需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

人牙髓干细胞的分离、扩增及神经元分化过程中朊蛋白表达

7.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59282

⸱

2019年3月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

本文内容

摘要

本文介绍了一种人牙髓干细胞的分离与扩增方案，旨在评估朊蛋白在神经元分化过程中的表达情况。

摘要

与胚胎干细胞操作相关的生物伦理问题阻碍了医学研究领域的进展。因此，从脂肪组织、脐带、骨髓和血液等不同组织中获取成体干细胞显得尤为重要。在诸多可能的来源中，牙髓尤其具有吸引力，因其获取过程符合生物伦理要求。事实上，人牙髓干细胞（hDPSCs）是一类成体干细胞，能够分化为类神经元细胞，且可从健康患者（13–19岁）的第三磨牙中获得。具体而言，使用挖匙取出牙髓组织，将其切成小片，用IV型胶原酶处理后接种于培养瓶中进行培养。为诱导神经元分化，采用EGF/bFGF对hDPSCs刺激处理两周。此前，我们已证明在分化过程中，hDPSCs中细胞型朊蛋白（PrPC）的含量增加。流式细胞分析显示PrPC在早期即有表达，并在神经元分化后进一步升高。通过siRNA介导的PrPC敲除可阻断EGF/bFGF诱导的神经元分化。本文中，我们展示了通过多种简便步骤优化hDPSCs的分离、纯化及体外培养方法后，获得了更高效率的细胞克隆，并实现了间充质干细胞（MSCs）的大规模扩增。我们还表明，按照本方案所述方法获得的hDPSCs是研究MSCs神经元分化过程及其后续细胞与分子机制的优良实验模型。

引言

间充质干细胞已从多种组织中分离获得，包括骨髓、脐带血、人牙髓、脂肪组织和血液1,2,3,4,5,6。据多位研究人员报道，人牙髓干细胞（hDPSCs）具有贴壁生长特性，并呈现典型的成纤维细胞样形态。这类细胞属于高度异质性的群体，含有不同的克隆，且在增殖能力和分化潜能方面存在差异7,8。hDPSCs表达间充质干细胞特异性标志物（如CD44、CD90、CD73、CD105、STRO-1），不表达某些造血系标志物（如CD14和CD19），并具备体外多向分化潜能9,10,11。

多位研究人员已证实，通过不同的实验方案，这些细胞能够分化为类神经元细胞，方案中包括添加NGF、bFGF、EGF，并 与 特定培养基及补充物联合使用7,12。此外，在神经元分化过程中涉及多种蛋白质，其中多篇文献表明，细胞型朊蛋白（PrPC）在胚胎干细胞和成体干细胞中均发挥重要作用，并呈现显著表达13,14。PrPC是一种具有多效性的分子，可在细胞内执行多种功能，包括铜代谢、凋亡调控以及抗氧化应激能力15,16,17,18,19,20,21,22。

在我们之前的研究23中，探讨了PrPC在hDPSCs神经元分化过程中的作用。事实上，hDPSCs会过早表达PrPC，而在神经元分化后，可观察到其表达进一步增加。其他研究者曾假设PrPC可能在干细胞的神经元分化过程中发挥作用。确实，PrPC能够驱动人胚胎干细胞分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞24。本研究的目的是强调从牙髓中获取干细胞的方法、其分化过程以及PrPC在神经元分化期间所起的作用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究中使用的第三磨牙来自13至19岁、无药物或酒精使用史、非吸烟且口腔卫生状况良好的患者。在说明当日，于口腔科学与颌面医学系 "萨皮恩扎" 罗马大学，在伦理考量及伦理委员会批准的基础上，已从患者或其家长处获得知情同意。

1. 牙齿与牙髓提取

  1. 准备用于保存或运输的适当培养基。
    1. 制备含L-谷氨酰胺的低糖浓度杜氏改良伊格尔培养基（DMEM-L）（494.5 mL）。
    2. 加入5 mL青霉素/链霉素（1%）和0.5 mL两性霉素B（0.1%）。
  2. 从患者体内拔除第三磨牙，迅速用PBS冲洗，放入含有培养基的15 mL试管中，并在2小时内转移至实验室。
  3. 在生物安全柜中，使用切割工具沿髓室顶平行且切向进行冠部切割，打开牙齿。
  4. 用小型挖匙轻柔取出牙髓组织，并将其置于试管中。
  5. 用PBS洗涤三次，在室温下以2,500 × g 离心10分钟。

2. 牙髓处理与干细胞释放

  1. 弃去上清液，将沉淀物重悬于Hank's溶液中，并置于培养皿内。在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。
  2. IV型胶原酶溶液的配制。
    1. 准备0.8 mL DMEM-L。
    2. 将1 mg IV型胶原酶溶于0.8 mL DMEM-L中，涡旋振荡数分钟。
    3. 用DMEM-L定容至1 mL，终浓度为1 mg/mL。
    4. 使用0.22 µm滤器过滤溶液。
  3. 在室温下以2,500 × g离心10分钟，去除Hank's溶液，并用一次性手术刀片将组织碎块切成约1 mm大小的小片。
  4. 将组织碎块放入培养皿中，加入1 mL IV型胶原酶，在37 °C、5% CO2条件下孵育15分钟。
  5. 培养基配制（500 mL）。
    1. 取445 mL含L-谷氨酰胺的DMEM-L。
    2. 加入50 mL胎牛血清（FBS）（10%）。
    3. 加入5 mL青霉素/链霉素溶液（1%）。
  6. 在室温下以2,500 × g离心10分钟，弃去上清液，将沉淀物重悬于培养基（步骤2.5）中，并在T25干细胞专用培养瓶中于37 °C、5% CO2条件下进行培养。

3. 干细胞培养与扩增

  1. 每天观察培养情况，培养 3 天后，在培养瓶中观察不同的贴壁细胞克隆。
  2. 每 3 天更换一次培养基。
  3. 在培养 7 至 12 天之间，当贴壁细胞达到汇合状态时，使用 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 下处理 3 分钟，或轻轻使用细胞刮刀使细胞脱落。
  4. 加入 4 mL（比例 1:5）的培养基（步骤 2.5）以终止胰蛋白酶的作用。
  5. 将细胞悬液在 259 x g 条件下离心 6 分钟，弃去上清液，并将细胞接种至 T25 培养瓶中进行传代。
    注意：细胞每 3 天可达到汇合状态。
  6. 将细胞传代培养至 21 或 28 天（约 6–8 代），以避免培养物中出现非干细胞样细胞。
  7. 使用 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 下处理 3 分钟或轻轻刮取使细胞脱落，将细胞悬液在 259 x g 条件下离心 6 分钟。
  8. 弃去上清液，并对细胞进行流式细胞术分析（步骤 6）。

4. 通过siRNA瞬时沉默PrPC

  1. 将hDPSCs以2 × 105 个细胞/mL的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基（步骤2.5），培养24 h。
  2. 次日，配制siRNA PrP培养基（400 µL）。
    1. 向无菌试管中加入384 µL DMEM-L。
    2. 向DMEM-L中每种siRNA PrP各加入1 µL，使终浓度为5 nM（共使用4种siRNA PrP，供应商已验证其基因沉默效率≥70%）。
    3. 向DMEM-L中加入12 µL转染试剂。
    4. 涡旋混匀后，室温孵育10 min，以形成转染复合物。
  3. 向每个样本中加入400 μL siRNA PrP培养基，于37 °C孵育6 h。
  4. 不弃去siRNA PrP培养基，直接加入1.6 mL（体积比1:5）的培养基（步骤2.5）。
  5. 将细胞于37 °C继续培养72 h。
  6. 移除上清液，用2 mL PBS在室温下洗涤3次。
  7. 加入2 mL神经元培养基，培养7天和/或14天（步骤5.1）。
  8. 每3天更换一次神经元培养基。
    注意：每次更换神经元培养基时，均需更换siRNA PrP溶液。
  9. 培养结束后，用2 mL PBS在室温下洗涤3次，并通过Western Blot分析检测神经元表面抗原。

5. hDPSCs 的神经元诱导过程

  1. 神经元培养基制备（500 mL）。
    1. 准备444.7 mL专为神经元细胞配制的基础培养基。
    2. 向培养基中加入50 mL无血清添加剂（10%），用于支持胚胎和成体神经干细胞的长期存活。
    3. 向培养基中加入200 µL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（终浓度40 ng/mL）和100 µL表皮生长因子（EGF）（终浓度20 ng/mL）。
    4. 向培养基中加入5 mL青霉素/链霉素溶液（1%）。
  2. 将hDPSCs接种于6孔板中（2 × 105 个细胞/mL），自牙髓分离起培养至多28天，并用2 mL神经元培养基进行诱导。
  3. 每隔3天弃去上清液，用2 mL PBS在室温下洗涤3次，并更换2 mL神经元培养基。
  4. 培养7天和/或14天后，加入1 mL胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育3分钟，或用细胞刮轻轻刮下细胞。
  5. 加入4 mL（1:5比例）培养基（步骤2.5）以终止胰蛋白酶作用。
  6. 通过流式细胞术分析检测神经元表面抗原的表达（步骤6）或朊蛋白的表达（步骤7）。

6. 通过流式细胞术表征人牙髓干细胞

  1. 选择间充质基质细胞（MSC）特异性或神经元表面抗原。
  2. 将hDPSCs以2 × 105 个细胞/mL的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基（步骤2.5）。
  3. 在牙髓分离后第28天或神经元诱导培养基培养14天后（步骤5.1），加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，37 °C孵育3分钟，或使用细胞刮轻轻刮下hDPSCs。
  4. 加入4 mL（1:5比例）培养基（步骤2.5）以终止胰酶消化作用，随后在室温下以259 × g离心6分钟。再用2 mL PBS在室温下洗涤2次。
  5. 用含4%多聚甲醛的PBS溶液在4 °C固定未经处理或经处理的hDPSCs，孵育10分钟。
  6. 用含0.1%（v/v）非离子型表面活性剂的PBS溶液在室温下进一步透化hDPSCs，孵育10分钟。
  7. 用含5%脱脂奶粉的PBS溶液1 mL在室温下封闭1小时。
  8. 用1 mL PBS洗涤3次，随后在室温下与以下一抗共同孵育1小时：抗CD105单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）、抗CD44单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）、抗STRO-1单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）、抗CD90单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）、抗CD73单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）、抗β3-微管蛋白单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）、抗NFH单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）以及抗GAP43单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）。
  9. 用1 mL PBS洗涤细胞3次，随后在室温下与PE标记的抗小鼠二抗（1:50/5 × 105 个细胞）或CY5标记的抗兔二抗（1:50/5 × 105 个细胞）共同孵育1小时。
  10. 使用上述二抗作为设门依据以识别免疫阳性细胞（抗小鼠PE或抗兔CY5单克隆抗体），所有样本均采用流式细胞仪分析，并至少采集20,000个事件。

7. 通过流式细胞术分析评估 hDPSCs 中 PrPC 的表达

  1. 将hDPSCs以2 x 105 个细胞/mL的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基（步骤2.5）。
  2. 在牙髓分离后第21天和第28天，以及使用神经元培养基（步骤5.1）培养7天和/或14天后，用1 mL胰蛋白酶-EDTA消化液消化hDPSCs，并按步骤6.4所述方法终止胰酶作用。用4%多聚甲醛PBS溶液在4 °C固定10分钟。
  3. 用含0.1% (v/v) 非离子型表面活性剂的PBS溶液在室温下透化处理10分钟。弃去上清液后，加入兔抗PrP单克隆抗体EP1802Y（1:50/5 x 105 个细胞），室温孵育1小时进行染色。随后加入Cy5标记的抗兔二抗（1:50/5 x 105 个细胞），室温继续孵育1小时。
  4. 使用流式细胞仪分析所有样本，每个样本至少采集20,000个事件。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

从智齿牙髓中分离和纯化人牙髓干细胞（hDPSCs）的过程较为复杂，微小的操作差异可能导致失败的结果。本文采用Arthur等.12的实验方案，并进行了多项优化。代表性实验流程见图1。

hDPSCs 代表一群具有不同克隆以及增殖和分化能力差异的异质性细胞7,8在牙髓分离并接种微小牙髓组织片段后，我们观察到细胞簇在周边区域扩展。 图2 显示牙髓组织分离后1天（左图）、4天（中图）和7天（右图）的小细胞簇。通常情况下，这些细胞簇持续生长，约在7至12天之间达到汇合状态。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在本研究中，我们重点关注 hDPSCs 的分离及其向神经元分化的方法学，并进一步评估了 PrPC 在该过程中的作用。目前已有多种方法可用于 hDPSCs 的分离及其向类神经元细胞的分化，且该过程包含多个关键步骤。hDPSCs 能够向多种谱系分化，包括软骨母细胞、脂肪细胞、成骨细胞以及神经元。在本文中，我们探讨了神经元分化的机制以及 PrPC 的存在情况。如上所述，这些细胞表达典型的间充质基质细胞特异性表面抗原，如 CD44、CD90、CD105、CD73 和 STRO-110,25,26。

在本方案中，若干关键步骤可能导致分离过程失败。第一个关键步骤是患者的选择27。根据我们的经验，供体年龄增大（>20岁）会逐渐降低干细胞的增殖和分化能力。在本实验中，我们选用13至19岁、无药物或酒精使用史、非吸烟且具备良...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由 "Fondazione Varrone" 和 Rieti 大学中心 "Sabina Universitas" 资助 Vincenzo Mattei。

图5（A，B）经出版商Taylor & Francis Ltd许可转载自：Prion蛋白-EGFR多分子复合物在人牙髓源性干细胞神经元分化过程中的作用。Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C., Santilli F., Piccoli L., Sorice M., Mattei V. Prion. 2018年3月4日。Taylor & Francis Ltd.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
两性霉素B溶液Sigma-AldrichA2942用于补充细胞培养基，是一种来自链霉菌的多烯类抗真菌抗生素
抗B3微管蛋白抗体Cell Signaling Technology #4466六种β-微管蛋白亚型之一，在胎儿期和出生后发育过程中高度表达，在周围神经系统中保持高水平
抗CD105抗体 BD Biosciences611314内皮糖蛋白（CD105）是人血管内皮的主要糖蛋白，为I型整合膜蛋白，具有大的胞外区、疏水性跨膜区和短的胞质尾部
抗CD44抗体MilliporeCBL154-20ul针对间充质干细胞的阳性细胞标志物抗体
抗CD73抗体 Cell Signaling Technology 13160CD73是一种70 kDa的糖基磷脂酰肌醇锚定型膜结合糖蛋白，可催化胞外核苷单磷酸水解为具有生物活性的核苷
抗CD90抗体MilliporeCBL415-20ul针对间充质干细胞的阳性细胞标志物抗体
抗GAP43抗体 Cell Signaling Technology #8945是神经系统特异性的生长相关蛋白，存在于生长锥及高可塑性区域
抗小鼠PE抗体 Abcamab7003用于流式细胞术或FACS分析的抗体
抗NFH抗体 Cell Signaling Technology #2836可检测内源性总神经丝重链蛋白（Neurofilament-H）水平的抗体
抗PrP单克隆抗体EP1802Y Abcamab52604兔单克隆抗体[EP1802Y]，靶向朊病毒蛋白PrP
抗兔CY5抗体 Abcamab6564用于流式细胞术或FACS分析的抗体
抗STRO-1抗体MilliporeMAB4315-20ul针对间充质干细胞的阳性细胞标志物抗体
B27无血清培养基添加剂 CTSGibco by life technologiesA14867-01B-27 可用于支持从多能干细胞（PSCs）诱导人神经干细胞（hNSCs）、hNSCs的扩增、hNSCs的分化，以及在培养中维持成熟分化的神经元
BD Accuri C6 流式细胞仪 BD BiosciencesAC6531180187配备蓝色激光（488 nm）和红色激光（640 nm）的流式细胞仪
BD Accuri C6 软件 BD Biosciences用于控制BD Accuri C6流式细胞仪系统，以获取数据、生成统计结果并分析实验数据
bFGFPeproThec, DBA100-18B碱性成纤维细胞生长因子 
CL30R离心机Thermo Fisher Scientific11210908用于基于密度分离流体、气体或液体的设备
CO2培养箱 3541Thermo Fisher Scientific317527-185确保细胞培养的最佳且可重复的生长条件
IV型胶原酶 Life Technologies17104019胶原酶是一种蛋白酶，可切割胶原中高频出现的Pro-X-Glyc-Pro序列中中性氨基酸（X）与甘氨酸之间的肽键
一次性手术刀 Swann-Morton501用于切割组织
DMEM-LEurocloneECM0060L含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的低糖杜氏改良伊格尔培养基
EGFPeproThec, DBAAF-100-15表皮生长因子 
胎牛血清Gibco by life technologies10270-106胎牛血清（FBS）是一种常用的培养基添加剂，因其在细胞培养中具有多种功能而广受欢迎。FBS可提供营养物质、生长和贴附因子，并通过难以在无血清培养基（SFM）系统中复制的机制保护细胞免受氧化损伤和凋亡
Filtropur BT50 0.2 µm，500 mL 瓶顶过滤器Sarstedt831,823,101用于溶液过滤的装置
Flexitube GeneSolution for PRNPQiagenGS5621针对Entrez基因5621的4种siRNA。靶序列N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
1× Hank's溶液Gibco by life technologies240200083Hanks′平衡盐溶液的主要功能是维持pH和渗透压平衡，同时为细胞提供水分和必需的无机离子
HiPerFect转染试剂 Qiagen301705HiPerFect转染试剂是一种阳离子与中性脂质的独特混合物，可有效促进siRNA进入细胞并在细胞内高效释放，即使使用低浓度siRNA也能实现高效的基因沉默
Neurobasal A Gibco by life technologies10888022Neurobasal-A培养基是一种基础培养基，专为纯化的出生后及成年脑神经元的长期维持和成熟而设计 
多聚甲醛Sigma-Aldrich30525-89-4多聚甲醛已用于染色过程中细胞和组织切片的固定
青霉素/链霉素 EurocloneECB3001D 用于补充细胞培养基以控制细菌污染
磷酸盐缓冲液 （PBS）EurocloneECB4004LX10 PBS是一种用于哺乳动物细胞处理和培养的平衡盐溶液。PBS可用于灌注、洗涤和稀释哺乳动物细胞。磷酸盐缓冲系统可维持生理pH范围
6孔细胞培养板，Cell+，F型Sarstedt833,920,300贴壁细胞的生长表面
组织培养瓶 T-25，Cell+，带通气盖Sarstedt833,910,302T-25组织培养瓶，聚苯乙烯材质，适用于敏感贴壁细胞（如原代细胞）的Cell+生长表面，斜颈设计，带通气盖，黄色，无菌，无热原，无细胞毒性，10个/袋
曲拉通X-100 Sigma-Aldrich9002-93-1一种广泛使用的非离子型表面活性剂，用于在温和非变性条件下回收膜组分
胰蛋白酶-EDTA EurocloneECB3052D 胰蛋白酶可在赖氨酸和精氨酸氨基酸残基的羧基端侧切割肽键。胰蛋白酶用于将贴壁细胞从培养表面解离下来
离心管Sarstedt62,554,50215 mL离心管，120 mm × 17 mm，聚丙烯材质
VBH 36 C2 CompactSterilST-003009000为环境和操作人员提供全面保护
ZEISS Axio Vert.A1 – 倒置 显微镜Zeiss3849000962ZEISS Axio Vert.A1提供独特的入门级价格，支持所有对比技术，包括明场、相差、PlasDIC、VAREL、改进型霍夫曼调制对比（iHMC）、微分干涉差（DIC）和荧光。采用LED照明，适用于荧光标记细胞的温和成像。Axio Vert.A1采用符合人体工程学的设计，适用于常规工作，且体积紧凑，可置于组织培养超净台内。

参考文献

  1. Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
  2. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
  3. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
  4. Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
  5. Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
  6. Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
  7. Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561(2016).
  8. Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14(2015).
  9. Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
  10. Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
  11. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
  12. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
  13. Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
  14. Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
  15. Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34(2017).
  16. Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
  17. Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77(2017).
  18. Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
  19. Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
  20. Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571(2017).
  21. Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
  22. Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
  23. Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
  24. Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
  25. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
  26. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
  27. Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146(2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

胶原酶IV处理流式细胞术分析蛋白质印迹分析胰蛋白酶EDTA消化EGF bFGF刺激siRNA PrP沉默细胞培养传代
人牙髓干细胞的分离、扩增及神经元分化过程中朊蛋白表达
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。