人牙髓干细胞的分离、扩增及神经元分化过程中朊蛋白表达

摘要

本文介绍了一种人牙髓干细胞的分离与扩增方案，旨在评估朊蛋白在神经元分化过程中的表达情况。

摘要

与胚胎干细胞操作相关的生物伦理问题阻碍了医学研究领域的进展。因此，从脂肪组织、脐带、骨髓和血液等不同组织中获取成体干细胞显得尤为重要。在诸多可能的来源中，牙髓尤其具有吸引力，因其获取过程符合生物伦理要求。事实上，人牙髓干细胞（hDPSCs）是一类成体干细胞，能够分化为类神经元细胞，且可从健康患者（13–19岁）的第三磨牙中获得。具体而言，使用挖匙取出牙髓组织，将其切成小片，用IV型胶原酶处理后接种于培养瓶中进行培养。为诱导神经元分化，采用EGF/bFGF对hDPSCs刺激处理两周。此前，我们已证明在分化过程中，hDPSCs中细胞型朊蛋白（PrP^C）的含量增加。流式细胞分析显示PrP^C在早期即有表达，并在神经元分化后进一步升高。通过siRNA介导的PrP^C敲除可阻断EGF/bFGF诱导的神经元分化。本文中，我们展示了通过多种简便步骤优化hDPSCs的分离、纯化及体外培养方法后，获得了更高效率的细胞克隆，并实现了间充质干细胞（MSCs）的大规模扩增。我们还表明，按照本方案所述方法获得的hDPSCs是研究MSCs神经元分化过程及其后续细胞与分子机制的优良实验模型。

引言

间充质干细胞已从多种组织中分离获得，包括骨髓、脐带血、人牙髓、脂肪组织和血液^1,2,3,4,5,6。据多位研究人员报道，人牙髓干细胞（hDPSCs）具有贴壁生长特性，并呈现典型的成纤维细胞样形态。这类细胞属于高度异质性的群体，含有不同的克隆，且在增殖能力和分化潜能方面存在差异^7,8。hDPSCs表达间充质干细胞特异性标志物（如CD44、CD90、CD73、CD105、STRO-1），不表达某些造血系标志物（如CD14和CD19），并具备体外多向分化潜能^9,10,11。

多位研究人员已证实，通过不同的实验方案，这些细胞能够分化为类神经元细胞，方案中包括添加NGF、bFGF、EGF，并&#....

方案

本研究中使用的第三磨牙来自13至19岁、无药物或酒精使用史、非吸烟且口腔卫生状况良好的患者。在说明当日，于口腔科学与颌面医学系 "萨皮恩扎" 罗马大学，在伦理考量及伦理委员会批准的基础上，已从患者或其家长处获得知情同意。

1. 牙齿与牙髓提取

1. 准备用于保存或运输的适当培养基。
   1. 制备含L-谷氨酰胺的低糖浓度杜氏改良伊格尔培养基（DMEM-L）（494.5 mL）。
   2. 加入5 mL青霉素/链霉素（1%）和0.5 mL两性霉素B（0.1%）。
2. 从患者体内拔除第三磨牙，迅速用PBS冲洗，放入含有培养基的15 mL试管中，并在2小时内转移至实验室。
3. 在生物安全柜中，使用切割工具沿髓室顶平行且切向进行冠部切割，打开牙齿。
4. 用小型挖匙轻柔取出牙髓组织，并将其置于试管中。
5. 用PBS洗涤三次，在室温下以2,500 × g 离心10分钟。

2. 牙髓处理与干细胞释放

1. 弃去上清液，将沉淀物重悬于Hank's溶液中，并置于培养皿内。在37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时。
2. IV型胶原酶溶液的配制。

结果

从智齿牙髓中分离和纯化人牙髓干细胞（hDPSCs）的过程较为复杂，微小的操作差异可能导致失败的结果。本文采用Arthur等.¹²的实验方案，并进行了多项优化。代表性实验流程见图1。

hDPSCs 代表一群具有不同克隆以及增殖和分化能力差异的异质性细胞^7,8在牙髓分离并接种微小牙髓组织片段后，我们观察到细胞簇在周边区域扩展。 图2 显示牙髓组织分离后1天（左图）、4天（中图）和7天（右图）的小细胞簇。通常情况下，这些细胞簇持续生长，约在7至12天之间达到汇合状态。

讨论

在本研究中，我们重点关注 hDPSCs 的分离及其向神经元分化的方法学，并进一步评估了 PrP^C 在该过程中的作用。目前已有多种方法可用于 hDPSCs 的分离及其向类神经元细胞的分化，且该过程包含多个关键步骤。hDPSCs 能够向多种谱系分化，包括软骨母细胞、脂肪细胞、成骨细胞以及神经元。在本文中，我们探讨了神经元分化的机制以及 PrP^C 的存在情况。如上所述，这些细胞表达典型的间充质基质细胞特异性表面抗原，如 CD44、CD90、CD105、CD73 和 STRO-1^10,25,26。

在本方案中，若干关键步骤可能导致分离过程失败。第一个关键步骤是患者的选择²⁷。根据我们的经验，供体年龄增大（>20岁）会逐渐降低干细胞的增殖和分化能力。在本实验中，我们选用13至19岁、无药物或酒精使用史、非吸烟且具备良.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
两性霉素B溶液	Sigma-Aldrich	A2942	用于补充细胞培养基，是一种来自链霉菌的多烯类抗真菌抗生素
抗B3微管蛋白抗体	Cell Signaling Technology	#4466	六种β-微管蛋白亚型之一，在胎儿期和出生后发育过程中高度表达，在周围神经系统中保持高水平
抗CD105抗体	BD Biosciences	611314	内皮糖蛋白（CD105）是人血管内皮的主要糖蛋白，为I型整合膜蛋白，具有大的胞外区、疏水性跨膜区和短的胞质尾部
抗CD44抗体	Millipore	CBL154-20ul	针对间充质干细胞的阳性细胞标志物抗体
抗CD73抗体	Cell Signaling Technology	13160	CD73是一种70 kDa的糖基磷脂酰肌醇锚定型膜结合糖蛋白，可催化胞外核苷单磷酸水解为具有生物活性的核苷
抗CD90抗体	Millipore	CBL415-20ul	针对间充质干细胞的阳性细胞标志物抗体
抗GAP43抗体	Cell Signaling Technology	#8945	是神经系统特异性的生长相关蛋白，存在于生长锥及高可塑性区域
抗小鼠PE抗体	Abcam	ab7003	用于流式细胞术或FACS分析的抗体
抗NFH抗体	Cell Signaling Technology	#2836	可检测内源性总神经丝重链蛋白（Neurofilament-H）水平的抗体
抗PrP单克隆抗体EP1802Y	Abcam	ab52604	兔单克隆抗体[EP1802Y]，靶向朊病毒蛋白PrP
抗兔CY5抗体	Abcam	ab6564	用于流式细胞术或FACS分析的抗体
抗STRO-1抗体	Millipore	MAB4315-20ul	针对间充质干细胞的阳性细胞标志物抗体
B27无血清培养基添加剂 CTS	Gibco by life technologies	A14867-01	B-27 可用于支持从多能干细胞（PSCs）诱导人神经干细胞（hNSCs）、hNSCs的扩增、hNSCs的分化，以及在培养中维持成熟分化的神经元
BD Accuri C6 流式细胞仪	BD Biosciences	AC6531180187	配备蓝色激光（488 nm）和红色激光（640 nm）的流式细胞仪
BD Accuri C6 软件	BD Biosciences		用于控制BD Accuri C6流式细胞仪系统，以获取数据、生成统计结果并分析实验数据
bFGF	PeproThec, DBA	100-18B	碱性成纤维细胞生长因子
CL30R离心机	Thermo Fisher Scientific	11210908	用于基于密度分离流体、气体或液体的设备
CO2培养箱 3541	Thermo Fisher Scientific	317527-185	确保细胞培养的最佳且可重复的生长条件
IV型胶原酶	Life Technologies	17104019	胶原酶是一种蛋白酶，可切割胶原中高频出现的Pro-X-Glyc-Pro序列中中性氨基酸（X）与甘氨酸之间的肽键
一次性手术刀	Swann-Morton	501	用于切割组织
DMEM-L	Euroclone	ECM0060L	含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的低糖杜氏改良伊格尔培养基
EGF	PeproThec, DBA	AF-100-15	表皮生长因子
胎牛血清	Gibco by life technologies	10270-106	胎牛血清（FBS）是一种常用的培养基添加剂，因其在细胞培养中具有多种功能而广受欢迎。FBS可提供营养物质、生长和贴附因子，并通过难以在无血清培养基（SFM）系统中复制的机制保护细胞免受氧化损伤和凋亡
Filtropur BT50 0.2 µm，500 mL 瓶顶过滤器	Sarstedt	831,823,101	用于溶液过滤的装置
Flexitube GeneSolution for PRNP	Qiagen	GS5621	针对Entrez基因5621的4种siRNA。靶序列N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
1× Hank's溶液	Gibco by life technologies	240200083	Hanks′平衡盐溶液的主要功能是维持pH和渗透压平衡，同时为细胞提供水分和必需的无机离子
HiPerFect转染试剂	Qiagen	301705	HiPerFect转染试剂是一种阳离子与中性脂质的独特混合物，可有效促进siRNA进入细胞并在细胞内高效释放，即使使用低浓度siRNA也能实现高效的基因沉默
Neurobasal A	Gibco by life technologies	10888022	Neurobasal-A培养基是一种基础培养基，专为纯化的出生后及成年脑神经元的长期维持和成熟而设计
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	30525-89-4	多聚甲醛已用于染色过程中细胞和组织切片的固定
青霉素/链霉素	Euroclone	ECB3001D	用于补充细胞培养基以控制细菌污染
磷酸盐缓冲液 （PBS）	Euroclone	ECB4004LX10	PBS是一种用于哺乳动物细胞处理和培养的平衡盐溶液。PBS可用于灌注、洗涤和稀释哺乳动物细胞。磷酸盐缓冲系统可维持生理pH范围
6孔细胞培养板，Cell+，F型	Sarstedt	833,920,300	贴壁细胞的生长表面
组织培养瓶 T-25，Cell+，带通气盖	Sarstedt	833,910,302	T-25组织培养瓶，聚苯乙烯材质，适用于敏感贴壁细胞（如原代细胞）的Cell+生长表面，斜颈设计，带通气盖，黄色，无菌，无热原，无细胞毒性，10个/袋
曲拉通X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	一种广泛使用的非离子型表面活性剂，用于在温和非变性条件下回收膜组分
胰蛋白酶-EDTA	Euroclone	ECB3052D	胰蛋白酶可在赖氨酸和精氨酸氨基酸残基的羧基端侧切割肽键。胰蛋白酶用于将贴壁细胞从培养表面解离下来
离心管	Sarstedt	62,554,502	15 mL离心管，120 mm × 17 mm，聚丙烯材质
VBH 36 C2 Compact	Steril	ST-003009000	为环境和操作人员提供全面保护
ZEISS Axio Vert.A1 – 倒置 显微镜	Zeiss	3849000962	ZEISS Axio Vert.A1提供独特的入门级价格，支持所有对比技术，包括明场、相差、PlasDIC、VAREL、改进型霍夫曼调制对比（iHMC）、微分干涉差（DIC）和荧光。采用LED照明，适用于荧光标记细胞的温和成像。Axio Vert.A1采用符合人体工程学的设计，适用于常规工作，且体积紧凑，可置于组织培养超净台内。