人牙髓干细胞的分离、扩增及神经元分化过程中朊蛋白的表达

摘要

本文介绍了一种人牙髓干细胞的分离与扩增方案，旨在评估朊蛋白在神经元分化过程中的表达情况。

摘要

与胚胎干细胞操作相关的生物伦理问题阻碍了医学研究领域的发展。因此，从脂肪组织、脐带、骨髓和血液等不同组织中获取成体干细胞显得尤为重要。在众多可能的来源中，牙髓尤其具有吸引力，因为它在生物伦理方面易于获取。实际上，人牙髓干细胞（hDPSCs）是一类能够分化为类神经细胞的成体干细胞，可从健康患者（13–19岁）的第三磨牙中获得。具体而言，使用挖匙取出牙髓组织，将其切成小片，经胶原酶IV处理后接种于培养瓶中进行培养。为诱导神经元分化，采用EGF/bFGF刺激hDPSCs持续两周。此前我们已证实，在分化过程中，hDPSCs中细胞型朊蛋白（PrP^C）的含量增加。流式细胞分析显示PrP^C在早期即有表达，并在神经元分化后进一步上升。通过siRNA介导的PrP^C基因沉默可阻断EGF/bFGF诱导的神经元分化。本文中，我们展示了通过多种简便步骤优化hDPSCs的分离、纯化及体外培养方法后，获得了更高效率的细胞克隆，并实现了间充质干细胞（MSCs）的大规模扩增。我们还说明了依据本方案所获得的hDPSCs是研究MSCs神经元分化过程及其后续细胞与分子机制的优良实验模型。

引言

间充质干细胞已从多种组织中分离获得，包括骨髓、脐带血、人牙髓、脂肪组织和血液^1,2,3,4,5,6。据多位研究者报道，人牙髓干细胞（hDPSCs）具有贴壁生长特性，并呈现典型的成纤维细胞样形态。这类细胞为高度异质性的群体，包含不同的克隆，且在增殖能力和分化潜能方面存在差异^7,8。hDPSCs表达间充质干细胞特异性标志物（如CD44、CD90、CD73、CD105、STRO-1），不表达某些造血细胞标志物（如CD14和CD19），并具备体外多向分化潜能^9,10,11。

多位研究人员已证实，通过添加NGF、bFGF和EGF的不同组合方案，这些细胞能够分化为类神经元细胞 与 特定培养基和添加剂^7,12此外，神经元分化过程涉及多种蛋白质，其中多篇文献表明细胞型朊蛋白（PrP）具有重要作用并显著表达^C），在胚胎干细胞和成体干细胞中均如此^13,14PrP^C 是一种具有多种功能的多效性分子，可在细胞内参与铜代谢、凋亡以及抗氧化应激反应^{15,16,17,18,19,20,21,22}.

在我们之前的研究²³中，探讨了PrP^C在hDPSCs神经元分化过程中的作用。事实上，hDPSCs会过早表达PrP^C，而在神经元分化后，还可观察到其表达进一步增加。其他研究者曾假设PrP^C可能在干细胞的神经元分化过程中发挥作用。确实，PrP^C能够驱动人胚胎干细胞分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞²⁴。本研究的目的是强调从牙髓中获取干细胞的方法、其分化过程以及PrP^C在神经元分化期间所起的作用。

方案

本研究中使用的第三磨牙来自13至19岁、无药物或酒精使用史、非吸烟且口腔卫生状况良好的患者。在说明当日，于口腔科学与颌面科部门 "萨皮恩扎" 罗马大学，在伦理委员会批准及伦理考量的基础上，已从患者或其家长处获得知情同意。

1. 牙齿与牙髓提取

1. 准备用于保存或运输的适当培养基。
   1. 配制含L-谷氨酰胺的低糖浓度杜氏改良伊格尔培养基（DMEM-L，494.5 mL）。
   2. 加入5 mL青霉素/链霉素（1%）和0.5 mL两性霉素B（0.1%）。
2. 从患者体内拔除第三磨牙，迅速用PBS冲洗，放入含有培养基的15 mL试管中，并在2小时内转移至实验室。
3. 在生物安全柜中，使用切割工具沿髓室顶平行且切向进行冠部切割，打开牙齿。
4. 用小型挖匙轻柔取出牙髓组织，置于试管中。
5. 用PBS洗涤三次，于室温下以2,500 × g 离心10分钟。

2. 牙髓处理与干细胞释放

1. 弃去上清液，将沉淀物重悬于 Hank's 溶液中，并置于培养皿内。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 2 小时。
2. IV 型胶原酶溶液的配制。
   1. 准备 0.8 mL DMEM-L。
   2. 将 1 mg IV 型胶原酶溶于 0.8 mL DMEM-L 中，涡旋振荡数分钟。
   3. 用 DMEM-L 定容至 1 mL，终浓度为 1 mg/mL。
   4. 使用 0.22 µm 滤器过滤溶液。
3. 在室温下以 2,500 × g 离心 10 分钟，去除 Hank's 溶液，并用一次性手术刀片将组织碎块切成约 1 mm 大小的小片。
4. 将组织碎块放入培养皿中，加入 1 mL IV 型胶原酶，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 15 分钟。
5. 培养基配制（500 mL）。
   1. 取 445 mL 含 L-谷氨酰胺的 DMEM-L。
   2. 加入 50 mL 胎牛血清（FBS）（10%）。
   3. 加入 5 mL 青霉素/链霉素溶液（1%）。
6. 在室温下以 2,500 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，将沉淀物重悬于培养基（步骤 2.5）中，并在 T25 细胞培养瓶（专用于干细胞培养）中于 37 °C、5% CO₂ 条件下进行培养。

3. 干细胞培养与扩增

1. 每天观察培养情况，培养 3 天后，在培养瓶中观察不同的贴壁细胞克隆。
2. 每 3 天更换一次培养基。
3. 在培养 7 至 12 天之间，当贴壁细胞达到汇合状态时，使用 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 下处理 3 分钟，或轻轻使用细胞刮刀使细胞脱离。
4. 加入 4 mL（比例 1:5）的培养基（步骤 2.5）以终止胰蛋白酶作用。
5. 将细胞悬液在 259 x g 条件下离心 6 分钟，弃去上清液，并将细胞接种至 T25 培养瓶中进行传代。
   注意：细胞每 3 天达到一次汇合状态。
6. 将细胞传代培养至 21 或 28 天（约 6–8 代），以避免培养物中出现非干细胞样细胞。
7. 使用 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 下处理 3 分钟或轻轻刮取使细胞脱离，将细胞悬液在 259 x g 条件下离心 6 分钟。
8. 弃去上清液，并对细胞进行流式细胞术分析（步骤 6）。

4. 通过siRNA瞬时沉默PrP^C

1. 将hDPSCs以2 x 10⁵ 个细胞/mL的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基（步骤2.5），培养24 h。
2. 次日，制备siRNA PrP转染液（400 µL）。
   1. 向无菌离心管中加入384 µL DMEM-L基础培养基。
   2. 向DMEM-L中加入每种siRNA PrP各1 µL，使终浓度为5 nM（共使用4种siRNA PrP，供应商已验证其基因沉默效率≥70%）。
   3. 向DMEM-L中加入12 µL转染试剂。
   4. 涡旋混匀后，室温孵育10 min，以形成转染复合物。
3. 向每个样本中加入400 μL siRNA PrP转染液，37 °C孵育6 h。
4. 不弃去siRNA PrP转染液，直接加入1.6 mL（体积比1:5）的培养基（步骤2.5）。
5. 将细胞在37 °C继续培养72 h。
6. 吸除上清液，室温下用2 mL PBS洗涤3次。
7. 加入2 mL神经细胞诱导培养基，培养7天和/或14天（步骤5.1）。
8. 每3天更换一次神经细胞诱导培养基。
   注意： 每次更换神经细胞诱导培养基时，需同步更换siRNA PrP溶液。
9. 培养结束后，室温下用2 mL PBS洗涤3次，通过Western Blot分析检测神经元表面抗原表达。

5. hDPSCs 的神经元诱导过程

1. 神经元培养基的配制（500 mL）。
   1. 准备444.7 mL专为神经元细胞设计的基础培养基。
   2. 向培养基中加入50 mL无血清添加剂（10%），用于支持胚胎和成体神经干细胞的长期存活。
   3. 向培养基中加入200 µL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（终浓度40 ng/mL）和100 µL表皮生长因子（EGF）（终浓度20 ng/mL）。
   4. 向培养基中加入5 mL青霉素/链霉素溶液（1%）。
2. 将hDPSCs接种于6孔板中（2 × 10⁵ 个细胞/mL），自牙髓分离起培养至多28天，并用2 mL神经元培养基进行诱导。
3. 每隔3天弃去上清液，用2 mL常温PBS洗涤3次，更换2 mL神经元培养基。
4. 培养7天和/或14天后，加入1 mL胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育3分钟，或用细胞刮轻轻刮下细胞以完成消化。
5. 加入4 mL（1:5比例）培养基（步骤2.5）以终止胰蛋白酶作用。
6. 通过流式细胞术分析检测神经元表面抗原的表达（步骤6）或朊蛋白的表达（步骤7）。

6. 通过流式细胞术表征hDPSCs

1. 选择间充质基质细胞（MSC）特异性或神经元表面抗原。
2. 将hDPSCs以2 × 10⁵ 个细胞/mL的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基（步骤2.5）。
3. 在牙髓分离后第28天或神经元诱导培养基培养14天后（步骤5.1），加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，37 °C孵育3分钟，或使用细胞刮轻轻刮下hDPSCs。
4. 加入4 mL（1:5比例）培养基（步骤2.5）以终止胰酶消化作用，随后在室温下以259 × g离心6分钟。再用2 mL PBS在室温下洗涤2次。
5. 用含4%多聚甲醛的PBS溶液在4 °C固定未经处理或经处理的hDPSCs，孵育10分钟。
6. 用含0.1%（v/v）非离子型表面活性剂的PBS溶液在室温下进一步透化hDPSCs，孵育10分钟。
7. 用含5%脱脂奶粉的PBS溶液1 mL在室温下封闭1小时。
8. 用1 mL PBS洗涤3次，随后在室温下与以下一抗共同孵育1小时：抗CD105单克隆抗体（1:100/5 × 10⁵ 个细胞）、抗CD44单克隆抗体（1:100/5 × 10⁵ 个细胞）、抗STRO-1单克隆抗体（1:100/5 × 10⁵ 个细胞）、抗CD90单克隆抗体（1:100/5 × 10⁵ 个细胞）、抗CD73单克隆抗体（1:100/5 × 10⁵ 个细胞）、抗β3-微管蛋白单克隆抗体（1:100/5 × 10⁵ 个细胞）、抗NFH单克隆抗体（1:100/5 × 10⁵ 个细胞）以及抗GAP43单克隆抗体（1:100/5 × 10⁵ 个细胞）。
9. 用1 mL PBS洗涤细胞3次，随后在室温下与二抗——抗小鼠PE标记抗体（1:50/5 × 10⁵ 个细胞）或抗兔CY5标记抗体（1:50/5 × 10⁵ 个细胞）——共同孵育1小时。
10. 使用上述二抗作为设门依据以识别免疫阳性细胞（抗小鼠PE或抗兔CY5单克隆抗体），所有样本均采用流式细胞仪进行分析，并至少采集20,000个事件。

7. 通过流式细胞术分析评估hDPSCs中PrP^C的表达

1. 将hDPSCs以2 x 10⁵ 个细胞/mL的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基（步骤2.5）。
2. 在牙髓分离后第21天和第28天，以及使用神经元培养基（步骤5.1）培养7天和/或14天后，用1 mL胰蛋白酶-EDTA消化液消化hDPSCs，并按步骤6.4所述方法终止胰酶作用。用含4%多聚甲醛的PBS溶液在4 °C固定10分钟。
3. 用含0.1%（v/v）非离子型表面活性剂的PBS溶液在室温下透化处理10分钟。弃去上清液后，加入兔抗PrP单克隆抗体EP1802Y（1:50/5 x 10⁵ 个细胞），室温孵育1小时进行染色。随后加入Cy5标记的抗兔二抗（1:50/5 x 10⁵ 个细胞），室温继续孵育1小时。
4. 使用流式细胞仪分析所有样本，每个样本至少采集20,000个事件。

结果

从第三磨牙牙髓中分离和获取人牙髓干细胞（hDPSCs）的过程较为复杂，微小的操作差异可能导致失败的结果。本文采用Arthur等.¹²的实验方案，并进行了多项改进。具体操作流程见图1。

hDPSCs 代表一类具有不同克隆及增殖和分化能力差异的异质性细胞群体^7,8。在牙髓组织分离并接种微小牙髓碎片后，我们观察到细胞簇在边缘区域不断扩展。图2展示了牙髓分离后1天（左图）、4天（中图）和7天（右图）的细胞小簇。通常情况下，这些细胞簇持续生长，约在7至12天之间达到汇合状态。

讨论

In this work, we focused on methodology for isolation and neuronal differentiation of hDPSCs; moreover, we evaluated the role of PrP^C in this process. There are several methods to isolate and differentiate hDPSCs in neuron-like cells and critical steps during the process. hDPSCs are able to differentiate in several lineages such as chondroblasts, adipocytes, osteoblasts, and neurons. In our paper, we investigated the mechanisms of neuronal differentiation and the presence of PrP^C. As discussed above...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
两性霉素B溶液	Sigma-Aldrich	A2942	用于补充细胞培养基，是一种来自链霉菌的多烯类抗真菌抗生素
抗B3微管蛋白抗体	Cell Signaling Technology	#4466	六种β-微管蛋白亚型之一，在胎儿期和出生后发育过程中高度表达，在周围神经系统中持续保持高水平
抗CD105抗体	BD Biosciences	611314	内皮糖蛋白（CD105）是人血管内皮的主要糖蛋白，为I型整合膜蛋白，具有大的胞外区、疏水性跨膜区和短的胞质尾部
抗CD44抗体	Millipore	CBL154-20ul	针对间充质干细胞的阳性细胞标志物抗体
抗CD73抗体	Cell Signaling Technology	13160	CD73是一种70 kDa的糖基磷脂酰肌醇锚定型膜结合糖蛋白，可催化细胞外核苷单磷酸水解为具有生物活性的核苷
抗CD90抗体	Millipore	CBL415-20ul	针对间充质干细胞的阳性细胞标志物抗体
抗GAP43抗体	Cell Signaling Technology	#8945	是一种神经系统特异性的生长相关蛋白，存在于生长锥及高可塑性区域
抗小鼠PE抗体	Abcam	ab7003	用于流式细胞术或FACS分析的抗体
抗NFH抗体	Cell Signaling Technology	#2836	可检测内源性总神经丝重链蛋白（Neurofilament-H）水平的抗体
抗PrP单克隆抗体EP1802Y	Abcam	ab52604	兔单克隆抗体[EP1802Y]，靶向朊病毒蛋白PrP
抗兔CY5抗体	Abcam	ab6564	用于流式细胞术或FACS分析的抗体
抗STRO-1抗体	Millipore	MAB4315-20ul	针对间充质干细胞的阳性细胞标志物抗体
B27无血清培养基添加剂 CTS	Gibco by life technologies	A14867-01	B-27 可用于支持从多能干细胞（PSCs）诱导人神经干细胞（hNSCs）、hNSCs的扩增、hNSCs的分化，以及在培养中维持成熟分化的神经元
BD Accuri C6 流式细胞仪	BD Biosciences	AC6531180187	配备蓝色激光（488 nm）和红色激光（640 nm）的流式细胞仪
BD Accuri C6 软件	BD Biosciences		用于控制BD Accuri C6流式细胞仪系统，以获取数据、生成统计结果并分析实验数据
bFGF	PeproThec, DBA	100-18B	碱性成纤维细胞生长因子
CL30R离心机	Thermo Fisher Scientific	11210908	用于基于密度分离流体、气体或液体的设备
CO2培养箱 3541	Thermo Fisher Scientific	317527-185	确保细胞培养的最佳且可重复的生长条件
IV型胶原酶	Life Technologies	17104019	胶原酶是一种蛋白酶，可切割胶原蛋白中高频出现的Pro-X-Glyc-Pro序列中中性氨基酸（X）与甘氨酸之间的肽键
一次性手术刀	Swann-Morton	501	用于切割组织
DMEM-L	Euroclone	ECM0060L	含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的低糖杜尔贝科改良伊格尔培养基
EGF	PeproThec, DBA	AF-100-15	表皮生长因子
胎牛血清	Gibco by life technologies	10270-106	胎牛血清（FBS）是一种常用的培养基添加剂，因其在细胞培养中具有广泛的功能。FBS提供营养物质、生长和贴附因子，并通过难以在无血清培养基（SFM）系统中复制的机制保护细胞免受氧化损伤和凋亡
Filtropur BT50 0.2，500 mL 瓶顶过滤器	Sarstedt	831,823,101	用于溶液过滤的装置
Flexitube GeneSolution for PRNP	Qiagen	GS5621	针对Entrez基因5621的4种siRNA。靶序列N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
1× Hank's溶液	Gibco by life technologies	240200083	Hanks′平衡盐溶液的主要功能是维持pH值和渗透压平衡，同时为细胞提供水分和必需的无机离子
HiPerFect转染试剂	Qiagen	301705	HiPerFect转染试剂是一种阳离子脂质与中性脂质的独特混合物，可有效促进siRNA进入细胞并在细胞内高效释放，即使使用低浓度siRNA也能实现高效的基因沉默
Neurobasal A	Gibco by life technologies	10888022	Neurobasal-A培养基是一种基础培养基，专为纯化的出生后及成年脑神经元的长期维持和成熟而设计
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	30525-89-4	多聚甲醛已用于染色过程中细胞和组织切片的固定
青霉素/链霉素	Euroclone	ECB3001D	用于补充细胞培养基以控制细菌污染
磷酸盐缓冲液 （PBS）	Euroclone	ECB4004LX10	PBS是一种用于哺乳动物细胞处理和培养的平衡盐溶液。PBS用于灌注、洗涤和稀释哺乳动物细胞。磷酸盐缓冲系统可维持生理pH范围
6孔TC培养板，Cell+，F型	Sarstedt	833,920,300	贴壁细胞的生长表面
组织培养瓶 T-25，Cell+，带通气盖	Sarstedt	833,910,302	T-25组织培养瓶，聚苯乙烯材质，适用于敏感贴壁细胞（如原代细胞）的Cell+生长表面，倾斜瓶颈，带通气盖，黄色，无菌，无热原，无细胞毒性，10个/袋
曲拉通X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	一种广泛使用的非离子型表面活性剂，用于在温和非变性条件下回收膜组分
胰蛋白酶-EDTA	Euroclone	ECB3052D	胰蛋白酶可在赖氨酸和精氨酸氨基酸残基的羧基端切割肽键。胰蛋白酶用于将贴壁细胞从培养表面解离下来
离心管	Sarstedt	62,554,502	15 mL离心管，120 mm × 17 mm，聚丙烯材质
VBH 36 C2 Compact	Steril	ST-003009000	为环境和操作人员提供全面保护
ZEISS Axio Vert.A1 – 倒置 显微镜	Zeiss	3849000962	ZEISS Axio Vert.A1提供独特的入门级价格，支持所有对比技术，包括明场、相差、PlasDIC、VAREL、改进型霍夫曼调制对比（iHMC）、微分干涉差（DIC）和荧光。采用LED照明，适用于荧光标记细胞的温和成像。Axio Vert.A1符合人体工程学设计，适用于常规工作，且体积紧凑，可置于组织培养超净台内。