S. aureus 生物膜中碱性磷酸酶活性的比色分析

摘要

在本研究中，我们建立了一种高通量方法，用于定量96孔组织培养板中金黄色葡萄球菌（S. aureus）生物膜培养物的碱性磷酸酶活性

摘要

碱性磷酸酶（ALP）是一种在原核细胞和真核细胞中均普遍表达的酶。它能在碱性pH条件下催化多种分子上磷酸单酯的水解反应，在磷酸盐代谢中发挥不可或缺的作用。在人体中，真核来源的ALP是诊断多种疾病（如胆汁淤积和佝偻病）时最常用的酶学指标之一。在S. aureus中，ALP仅在细胞膜上被检测到，同时也以分泌形式表达。然而，其在生物膜形成中的功能尚不清楚。

本论文的目的是建立一种快速且可靠的检测方法，用于测定S. aureus生物膜中的碱性磷酸酶（ALP）活性，且无需进行蛋白质分离。以对硝基苯磷酸盐（pNPP）为底物，我们在96孔组织培养板中形成的S. aureus生物膜中测定了ALP活性。该检测基于反应生成的可溶性产物在405 nm处的吸光度进行定量。96孔组织培养板法具有高通量特性，为ALP活性检测提供了一种灵敏且可重复的方法。相同的实验体系还可拓展用于检测其他与生物膜形成相关的胞外分子标志物。

引言

碱性磷酸酶（ALP）在原核细胞和真核细胞中普遍存在¹。它能够催化多种分子（如核苷酸、蛋白质、生物碱、磷酸酯以及磷酸的酸酐）中单磷酸基团的水解反应。在人体中，真核生物来源的ALP广泛存在于肝脏、骨骼、肠道和胎盘等多种组织中²。该酶在蛋白质磷酸化、细胞生长、凋亡、干细胞过程以及正常的骨骼矿化过程中发挥重要作用。当其水平升高时，真核生物ALP也是提示骨骼、肝脏及其他组织或器官疾病存在的关键血清指标^3,4。

已在多种细菌细胞中检测到原核生物碱性磷酸酶（ALP），包括E. coli⁵、S. aureus^6,7以及土壤中一些常见的瘤胃细菌⁸。细菌ALP活性已被用作生物传感器，用于检测农药、重金属⁹和细菌污染¹⁰。ALP的组成型表达已被用于鉴定Staphylococci¹¹，并区分Serratia与Enterobacter¹²。另有研究提示，staphylococci中组成型ALP的产生可能与其致病性相关¹³。尽管ALP已在不同条件下被广泛研究^3,4，但其在生物膜培养中的活性与功能报道仍较少。

与游离生活的细菌细胞相比，生物膜中的细菌生命活动方式已被证实存在差异¹⁴。在S. aureus中，生物膜的形成已在多种临床条件下被发现，并与抗生素耐药性和慢性炎症相关^15,16。许多分子已被报道存在于生物膜基质中，如多糖、蛋白质、核酸和脂类，但生物膜形成的机制尚未完全阐明¹⁴。为了理解碱性磷酸酶（ALP）在生物膜形成中的作用，我们将在96孔组织培养板中培养S. aureus生物膜，并使用对硝基苯磷酸盐（pNPP）测定ALP活性。

分子pNPP是碱性磷酸酶（ALP）的一种即用型底物，已被广泛用于测定ALP活性^6,17,18。该比色法检测基于对硝基苯基磷酸盐（pNPP）转化为对硝基苯酚，生成在405 nm处有吸收的有色产物。与其他传统的ALP检测方法（如琼脂糖凝胶电泳¹⁹、麦胚凝集素（WGA）沉淀法和WGA-HPLC²⁰）相比，该方法具有高度特异性、高灵敏度、易于重复，且最重要的是可实现高通量检测。

方案

1. 培养基制备

1. 制备1 L胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）：向1 L蒸馏水中加入15 g酪蛋白胰酶消化物、5 g大豆粉木瓜蛋白酶消化物、3 g氯化钠、2.5 g葡萄糖和2.5 g磷酸氢二钾。使用前进行灭菌。
2. 对于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA），在1 L TSB中加入15 g琼脂，高压灭菌后冷却至室温，然后以每皿（100 mm × 15 mm）20 mL的比例倒入培养皿中。
3. 生物膜培养基：向1 L经高压灭菌的TSB中加入10 g葡萄糖，使用0.2 µm滤膜过滤除菌。

2. 在96孔组织培养板中形成S. aureus 生物膜

注意：S. aureus 生物膜的培养方法如前所述^6,21。

1. 从TSA平板上挑取单个金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌落接种于10 mL TSB培养基中，37 °C过夜培养。
2. 将过夜培养物按1:100（v/v）比例稀释至10 mL含葡萄糖（10 g/L）的TSB培养基中，轻轻涡旋混匀以获得一致的浓度。
3. 将稀释后的菌液各200 μL转移至一块96孔板中的共计18个孔（若需设置实验组，如非生物膜对照组以评估与碱性磷酸酶活性的关系⁶，可增加孔数）。每个时间点（0 min、15 min、30 min、45 min、60 min和75 min）设三个复孔。参见步骤3.2。
4. 将96孔板在37 °C孵育24 h，以形成生物膜^6,21。
5. 通过吸弃去除上清液。
6. 每孔用1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤一次，15,000 × g 离心5 min，然后通过吸弃去除上清液。

3. 碱性磷酸酶活性的测定 S. aureus 生物膜

注意：ALP 活性测定方法如文献^6,18所述。

1. 向第2.6步的每个孔中加入75 μL由市售pNPP组成的缓冲ALP底物，并开始计时。每个时间点设三个重复孔进行记录。
2. 分别在孵育不同时间后：0分钟（对照）、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟和75分钟，向每孔加入75 µL的5 M NaOH以终止反应。
3. 将板在15,000 × g 条件下离心5分钟。
4. 将100 µL上清液转移至新的96孔板中，用于比色测定。
5. 使用96孔板读数仪在405 nm处测定各孔的吸光度。以0分钟时间点的孔作为对照，校正405 nm处的背景噪声。
6. 在整个实验中，使用三个独立的96孔板重复三次。

结果

图1展示了在96孔组织培养板中培养的S. aureus生物膜的碱性磷酸酶（ALP）活性代表性结果。向每个孔中加入75 μL市售的pNPP溶液，并在室温下孵育。分别在不同时间点（0分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟和75分钟）加入75 μL的5 M NaOH以终止反应。随后在96孔板读数仪中于405 nm波长处测定产物。每个时间点均在同一块96孔板中设置三个复孔，且整个实验在3块独立的96孔板中重复进行。

图 1：S. aureus...

讨论

在我们的检测中，使用 pNPP 作为碱性磷酸酶（ALP）的底物。这是一种专为 ELISA 设计的工作液，无需稀释。ALP 催化水解后生成黄色产物，可在 405 nm 处测定其吸光度。酶促反应结束后，我们对 96 孔板短暂离心，并将上清液转移至新的 96 孔板中，使用酶标仪测定吸光度。我们发现这一额外的离心步骤至关重要，因为它可提高 405 nm 处吸光度的一致性，可能是通过去除酶促反应过程中可能产生的悬浮细胞所致。

在生物膜形成过程中，我们采用200 μL的过夜培养物按1:100（v/v）比例稀释，如文献报道^6,21。与其它稀释比例相比，该稀释度是金黄色葡萄球菌（S. aureus）形成生物膜的最佳条件（数据未显示）。由于本文的目的是测定生物膜中的碱性磷酸酶（ALP）活性，因此维持最佳的生物膜培养条件至关重要。此外，使用10 g/L葡萄糖以促进生物膜最佳生长的选择进一步强调了这一点⁶。若采用不同的细菌...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	VWR	9002-18-0
Eppendorf 离心机	Thomas Scientific	5810
葡萄糖	VWR	50-99-7
氢氧化钠颗粒	VWR	SS0550-500GR
对硝基苯基磷酸盐（pNPP）	Sigma	P7998-100ML	对硝基苯基磷酸盐（pNPP）液体底物的典型浓度范围通常在 10 至 50 mM 之间，常用于酶联免疫吸附测定（ELISA）。与本实验所用的此类即用型 pNPP 液体底物相似，由于其成分为专有配方，具体浓度未予公开。
10x PBS，pH 7.4。 173 mM NaCl， 2.7 mM KCl， 8 mM Na2HPO4， 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
酶标仪	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
胰蛋白胨大豆琼脂       15 g/L TSB	VWR	9002-18-0
胰蛋白胨大豆肉汤：      g/L 酪蛋白胰酶消化物........................ 15.0 大豆粉木瓜酶消化物..................... 5.00 氯化钠........................................ 3.00 葡萄糖........................................ 2.50  磷酸氢二钾.................................. 2.50	VWR	90006-098
96 孔组织培养板	BD	6902D09	U 型底