使用近红外标记试剂验证大鼠尾静脉注射的新最佳实践

摘要

本文介绍了一种利用掺入试剂或生物探针中的染料所产生的近红外荧光成像数据来验证大鼠尾静脉注射效果的方法。在注射前后对尾部进行成像，定量分析荧光信号，并据此评估注射质量。

摘要

通过尾静脉对大鼠进行静脉（IV）给药可能既困难又不稳定。优化尾静脉注射是许多需要将试剂直接引入血液的实验操作中的关键环节。若操作不当，注射可能误入皮下，从而可能影响实验结果。本方法利用一种含有近红外荧光（NIRF）染料的纳米乳液型生物探针，可在活体条件下成像，以确认尾静脉注射是否成功。. 使用近红外荧光（NIRF）成像仪，在注射造影剂前后分别采集图像。通过评估注射部位近红外荧光信号的强度，可对静脉注射是否成功进行定性或定量判断。

引言

给药途径在小型动物实验中具有关键作用。它决定了药物的递送位置，并进而影响药物在体内的后续行为。尽管其他给药途径也可用于药物递送¹静脉给药途径是某些药物的首选给药方式。静脉注射可将药物直接注入血液，避免首过组织效应以及溶质需经额外吸收的过程1。此外，该方法还可实现对血液中细胞的靶向作用^2,3 以及向循环系统内所有组织的直接递送。在啮齿类动物中，可选择的静脉包括颈静脉、隐静脉和尾静脉。

本方法中，将含有生物探针的近红外荧光染料——此处为纳米乳剂（图1A）^3,4,5,6——注入大鼠尾侧静脉。这种含近红外荧光染料的纳米乳剂此前已被用于在神经病理性疼痛大鼠模型⁹中对神经炎症进行活体和离体成像与追踪^{7,82,3,4,5,10,11}。使用临床前近红外荧光成像仪（见材料表）在注射前后进行成像，以评估给药过程的质量。尾静脉注射前的成像可作为获取基线图像的依据。

在动物研究中，静脉注射的纳米乳剂正越来越多地被用作生物探针和靶向剂^12,13,14,15通过尾静脉注射给药已被证实具有挑战性^16,17——无论是药物、病毒载体还是其他探针——并确保注射的全部内容物已成功进入血液，而非周围组织¹⁷因此，一种用于可视化并评估成功注射质量的方法具有重要意义。 

通常使用加热灯或温水对尾部进行加温，使静脉扩张，以便在注射前观察到静脉。虽然这种方法有助于更顺利地进入静脉，但尚无定量方法来判断化合物是否已全部进入血液^18,19,20,21。对于静脉与皮肤对比度较低的动物品系（例如黑鼠），这一过程变得更加困难。通常情况下，研究者可通过注射时遇到阻力，并在某些情况下观察到尾部出现隆起，从而判断注射失败，提示药物发生了皮下渗漏^22,23。 

本研究中，将纳米乳剂注射到活体大鼠的侧尾静脉后，在小动物近红外荧光（NIRF）成像系统上进行成像（参见材料表）。大鼠饲喂一种特殊纯化饮食（参见材料表），以降低非特异性肠道荧光。使用NIRF成像仪及其配套软件，同步采集白光和800 nm荧光图像。在注射前和注射后状态下，测量尾部的相对荧光强度。记录注射部位感兴趣区域（ROI）的荧光强度，并除以ROI的面积。可据此对哪些注射符合标准进行定性评估。此外，也可通过设定可接受注射的阈值，将ROI测量结果分组，进一步进行定量分析，并计算统计学显著性。 

通过在尾静脉注射后采用这种验证策略，由于试剂给药的一致性提高，研究工作的标准得以提升。该评估尾静脉注射质量的方法可轻松针对不同可注射试剂进行定制，包括多家公司提供的商用近红外荧光探针。

方案

所有实验方案均遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）《实验动物护理与使用指南》以及杜肯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的相关规定进行。

1. 准备与麻醉

注意：整个操作过程需使用无菌技术。仅可使用新的无菌材料和经高压灭菌的无菌器械。必须穿戴个人防护装备（无菌手套、头帽、外科口罩、刷手服），以避免污染。

1. 本方案使用体重为 250–300 g 的成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠。将大鼠适应标准饲养条件，维持 12 小时光照/12 小时黑暗的光照周期，并自由提供食物和饮水。群养动物，使用纸屑垫料，并提供特殊饮食（见材料表），以避免成像过程中产生自发荧光。
2. 使用放置妥当的加热垫，在 20% 氧气中先以 5% 异氟烷进行诱导麻醉，随后维持在不低于 1.5% 且不高于 3% 的异氟烷浓度进行维持麻醉，除非动物苏醒或仍有知觉。
3. 通过尾部夹捏无反应来确认麻醉效果。在整个操作过程中也需通过生命体征监测血流情况。

2. 注射前图像采集

1. 将动物侧向放置于临床前近红外荧光成像仪中，使尾部外侧注射部位暴露，以建立尾部荧光的基线信号（图1C,E）。 使用近红外荧光成像仪及其配套软件，同步采集白光图像（身体视图）和近红外通道图像，并启用关联的查找表（LUT）。
2. 成像完成后，将动物移回手术台，并置于麻醉状态下进行尾静脉注射。
   注意：持续监测动物的生命体征，并通过尾部夹捏测试重新确认麻醉深度。

3. 含近红外荧光剂的尾静脉注射

1. 将动物置于俯卧位，使尾部背侧朝上。将尾部浸入温水中至少1分钟以扩张尾部血管。调整尾静脉方向，使尾部侧面（左侧或右侧）向顺时针或逆时针方向旋转30°，以暴露右侧或左侧尾静脉（图1B）。
   1. 确定侧尾静脉位置（扩张后呈深色）后，使用酒精棉片对整个尾部进行消毒 ，重复2次。
   2. 根据实验设计确定适当剂量，从尾部远端尾椎区域开始注射；若针头位置不当，可逐渐向近端移动尝试。
2. 将一支25–27 G的无菌针头斜面向上插入侧尾静脉，尾部保持180°伸直状态，针头沿抬起的尾部平行刺入。观察针头边缘是否有回血，以确认正确置入。若无回血，可缓慢移动针尖（不从尾部拔出）以寻找静脉入口。若针头进入皮下组织，则不会出现回血。
3. 将装有注射物质的注射器连接至针头接口。当正确置入后，推注时不会感到阻力，液体可顺畅、轻松地注入。注射完成后，拔出针头和注射器，用无菌纱布按压注射部位至少1分钟以确保止血，并用笔在尾部标记注射位置，确保其在白光图像中清晰可见。
   注意：注射部位不应出现血肿或病变。
4. 若插入注射器时针尖发生移动，应拔出针头，并在同侧尾静脉更近端的位置重新进行穿刺操作。若更换穿刺点，不得重复使用同一针头。
   注意：也可使用带有血流指示器的静脉留置针进行注射（见材料表）。该方法可在穿刺过程中直观确认导管位置。将留置针斜面朝上，按前述角度插入。观察血流指示器全长迅速出现回血，以确认正确置入。注射前可轻微回抽，使血液进入注射器以确认导管位于血管内。同样，注射时应无阻力。

4. 注射后图像采集

1. 在相同方向下，使用临床前近红外荧光成像仪对尾静脉注射后进行质量评估，成像方向应与注射前基线图像一致。在将动物放入成像仪之前，确保其仍处于适当的麻醉状态，并且在整个成像过程中持续保持麻醉。
   注意：如条件允许，应使用配备有带麻醉接口和动物面罩的抽屉式腔室的成像系统。
2. 将动物侧卧放置，以暴露尾部侧面的注射部位（如标记所示）。检查是否仅在注射部位出现近红外荧光（NIRF）信号。若信号仅局限于注射部位，则表明 尾静脉注射成功（图1D）。
   注意：如果信号弥散分布于整个尾部，则视为皮下渗漏，即注射失败（图1F）。图2展示了其他注射失败的示例。

5. 图像定量分析

注意：如果近红外成像仪配套的成像软件提供此 功能，则可使用该软件进行图像定量分析。此外，也可使用其他 commercially available 图像分析 软件²⁴。

1. 在注射后图像中，围绕注射部位的荧光区域绘制感兴趣区域^2,6。 
2. 测量该区域的面积和相对荧光强度，并记录为面积/强度。通过适当的统计分析（取决于研究组别和实验条件），对注射后图像与基线前注射图像进行定性或定量比较。
   注意：研究人员可自行设定区分注射质量优劣的阈值，或为每次注射分配一个质量百分比。

结果

将含有近红外荧光（NIRF）的纳米乳剂注射至大鼠尾侧静脉，按照方案所述，使用小动物成像仪（材料表）采集注射前和注射后的图像。根据注射后图像的荧光分布情况，对注射质量进行定性评估，并将结果分为“良好注射”（n = 7）和“不良注射”（n = 4）两组。定性评估依据为观察注射部位的荧光强度。在理想的注射中，近红外荧光信号应局限于注射部位；若注射成功，示踪剂已完全进入血液循环，因此不会观察到信号。不良注射则表现为近红外荧光信号沿尾部长度方向弥散分布。

使用配套的近红外荧光（NIRF）成像仪软件对图像进行分析。在注射前图像的注射部位绘制感兴趣区域（图1C、E），并在注射后图像中荧光信号周围区域绘制感兴趣区域（图1D、F）。若图像中荧光信号沿尾部全长可见，则视为不合格图像并从分析中剔除（图2）。记录面积和荧光强度的测量值。计算面积/荧光强度的数值并进行绘图（图1G）。在“注射不良”组中，注射前后图像的荧光强度之间存在显著差异（非配对t检验）（图1G）（p = 0.0024）。

图1：基于近红外荧光的纳米乳剂及尾静脉图像。（A）含有近红外荧光染料的纳米乳剂生物探针被注射至（B）小鼠尾侧静脉，并在近红外荧光成像仪中进行成像。（C 和 D）一次成功注射的注射前与注射后图像。（E 和 F）一次失败注射的注射前与注射后图像。白色箭头指示注射位点。通过评估注射部位近红外荧光信号的扩散范围，可对成功与失败的注射进行定性判断。不合格的注射表现为荧光沿尾部全长扩散，此类样本被排除在分析之外（图2）。（G）图像还可进一步分析，以获得荧光强度的定量数据，注射质量的阈值由研究人员设定。图中误差线表示标准误（SEM）。对于“成功注射”组，n = 7；对于“失败注射”组，n = 4。在“失败注射”组中，注射前后图像的荧光强度存在统计学差异（非配对 t 检验；p = 0.0024）。请点击此处查看该图的高清版本。

图 2：注射操作不良的示例。 （A）在尾部部分区域观察到荧光信号。（B）在整个尾部长度上均观察到荧光信号。（C）荧光信号在尾部及动物身体尾端区域广泛弥散。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

由于检测试剂的误用，研究实验室会产生成本。尾静脉注射是一种难以掌握的技术，即使经验最丰富的技术人员也常出现误用错误，难以保持稳定的成功率。目前尚无可靠方法来确认注射是否成功。本方案通过为研究人员提供一种定性和定量的方法，以验证小鼠尾静脉注射的成功与否，从而解决了这一问题。在此方法中，将选择的试剂（本例中为药物）掺入近红外荧光（NIRF）标记的纳米乳剂^7,8,25 ，并在近红外荧光小动物成像仪中对注射部位进行成像。此外，也可选择开发非纳米乳剂形式的试剂，通过掺入市售的红外染料，采用相同的NIRF成像原理。同时，市面上已有多种即用型成像试剂，可用于肿瘤成像、代谢成像、细胞追踪和细胞凋亡等不同应用。注射可使用无菌针头进行，也可选择使用静脉留置导管（IV catheter），具体取决于研究人员的偏好。此外，已有研究使用自动尾静脉注射装置²⁶ 辅助该过程，且该装置与本方法兼容。然而，该技术目前尚未实现商业化。

尾静脉注射方法中有一些关键步骤，可确保更高的给药准确率。首先，应使用乙醇清洁尾部，以去除任何污垢或碎屑，使研究人员能够更清楚地观察静脉。将尾部浸入温水中以扩张静脉，也是该方法中非常重要的一步，因为这可以增大可供注射的表面积。在尾静脉更远端的位置进行注射，可为操作留出一定的容错空间，以防需要多次尝试。随着接近动物身体的尾端部分，尾静脉的直径逐渐增大，因此应尽量在尾部更近端的位置进行注射。此外，如果在同一侧尾静脉尝试穿刺超过三至五个位点仍未成功，可改用对侧尾静脉进行注射。

成功注射测试试剂后，注射部位应几乎没有或完全没有近红外荧光（NIRF）信号。若注射过程中未感到阻力，且尾部几乎没有或完全没有荧光，则可记录为注射成功。若注射时感到阻力，且尾部沿一定长度出现NIRF信号轨迹，则记录为注射失败，可能部分为皮下注射。需在注射前后采集荧光图像，并通过定性观察或定量分析注射部位的荧光信号来评估注射质量。近红外荧光成像仪配套的软件通常具备执行此类分析的功能。

该方法可通过多种方式进行调整。它适用于小鼠和大鼠的尾静脉注射。大多数小型动物近红外荧光成像仪均能够容纳啮齿类动物。麻醉水平需根据动物体重进行调整，并符合研究实验室的IACUC方案。另一种可能的改进是制备非纳米乳剂探针，可通过将红外染料掺入研究人员自配的试剂中，或购买针对特定生物应用的即用型成像试剂来实现。

如果大鼠体型相对较大，通常很难将其放置在小动物成像仪中。因此，建议在注射前先将动物放入成像仪抽屉中拍摄一张测试图像，以确定尾部可见的视野范围。将尾部用胶带固定在成像仪抽屉上，有助于确保成像过程中尾部不会移动。

旨在评估小动物尾静脉注射质量的替代方法目前仅限于使用不影响同步实验操作的标记试剂，并且需要在注射后对动物实施安乐死^12,13。某些试剂可能影响研究结果以及所涉动物的治疗评估，因此建议在实验设计中予以谨慎考虑。

未来，随着小动物成像技术的进步以及近红外荧光探针的改进，该方法可进一步优化。在研究设计的试剂给药阶段，可使用含有近红外染料并针对多种不同应用而设计的生物探针，以验证注射质量，如本方法所述^{2,3,27,28,29,30,31,32}。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100% 氧气气罐	AirGas Heathcare	n/a	用于动物通气。
70% 乙醇	多个来源	n/a
酒精棉片	Henry Schein	112-6131
人工泪液	Henry Schein	100-2634	用于保护大鼠在麻醉期间的眼睛。
烧杯	多个来源	n/a	用于盛装温水以扩张尾静脉。
蒸馏水	多个来源	n/a
排风扇	Hazard Technologies	n/a	用于实验室通风，若实验室无内置通风系统。
面罩	多个来源	n/a
带管路和面罩的气体麻醉舱	多个来源	n/a
纱布垫	Henry Schein	100-2634
发帽	多个来源	n/a
加热灯	多个来源	n/a
加热垫	多个来源	n/a
异氟烷（Isoflurane）	Southmedic Inc.	ND66794-013-25
带衬垫的实验台布	Box Board Products Inc.	026755100I
Pearl 小动物成像仪	Li-COR Biosciences
Pearl Trilogy 小动物成像系统	LI-COR Biosciences	n/a	可通过制造商网站获取报价。其他厂商如 Perkin Elmer（VisEn Medical FMT）也提供临床前近红外荧光成像仪。
手术服、实验服、鞋套	多个来源	n/a
锐器盒	多个来源	n/a
特殊饮食	Research Diets, Inc, 新不伦瑞克, 新泽西州
Sprague-Dawley 大鼠	Hilltop Animals, 斯普林代尔, 宾夕法尼亚州
无菌注射帽	多个来源	n/a
无菌针头，27 G	多个来源	n/a
SURFLO IV 导管，24 G，黄色	TERUMO	SR+OX2419C1	可作为无菌针头的替代品，有助于确认静脉插入是否正确。
外科手套	多个来源	n/a
外科胶带	多个来源	n/a