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方法文章

由脐带血来源的诱导多能干细胞生成三维皮肤类器官

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DOI：

10.3791/59297

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2019年4月18日

 , 
1CiSTEM Laboratory, Catholic Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Research Center, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Department of Biomedicine & Health Science, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 3Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

本文内容

摘要

我们提出了一种实验方案，用于诱导多能干细胞来源的角质形成细胞和成纤维细胞的分化，并利用这些角质形成细胞和成纤维细胞构建三维皮肤类器官。该方案包含建立人源化小鼠模型的额外步骤。本文所介绍的技术将有助于推动皮肤科领域的研究进展。

摘要

皮肤是人体最大的器官，具有多种功能。皮肤作为物理屏障保护机体，并调节各种生理功能。仿生学是指模仿自然界中的模型、系统和元素，以解决复杂的人类问题1。皮肤仿生技术是体外疾病研究和体内再生医学的有力工具。人诱导性多能干细胞（iPSCs）具有无限增殖的能力，并可分化为三个胚层的细胞。人iPSCs可由多种原始细胞生成，如血细胞、角质形成细胞、成纤维细胞等。其中，脐带血单个核细胞（CBMCs）作为同种异体再生医学视角下的替代细胞来源日益受到关注。CBMCs在再生医学中具有应用价值，因为人类白细胞抗原（HLA）分型对于细胞库系统的建立至关重要。本文提供一种将CBMC来源的iPSCs分化为角质形成细胞和成纤维细胞，并构建三维皮肤类器官的方法。由CBMC-iPSCs衍生的角质形成细胞和成纤维细胞具有与原代细胞系相似的特性。三维皮肤类器官通过将表皮层覆盖于真皮层之上而形成。通过移植该三维皮肤类器官，可建立人源化小鼠模型。本研究表明，来源于人iPSCs的三维皮肤类器官可能成为体外和体内皮肤科学研究的一种新颖且可行的替代工具。

引言

皮肤覆盖于身体最外层表面，保护内部器官。皮肤具有多种功能，包括抵御病原体、吸收和储存水分、调节体温以及排泄代谢废物2。根据皮肤来源的不同，皮肤移植可分为不同类型：使用他人供体皮肤的称为同种异体移植（allograft），而使用患者自身皮肤的则称为自体移植（autograft）。尽管自体移植因排斥反应风险较低而被视为首选治疗方式，但对于存在严重创面或皮肤细胞数量不足的患者而言，获取皮肤活检样本较为困难。在严重烧伤患者中，需要三倍数量的皮肤细胞才能覆盖大面积创面。由于患者自身可获取的皮肤细胞数量有限，因此在某些情况下必须采用同种异体移植。同种异体移植物通常仅作为临时措施使用，直至可进行自体移植，因为此类移植物通常在约1周后会被宿主免疫系统排斥3。为克服患者免疫系统的排斥反应，移植物必须来源于与患者具有相同免疫特征的细胞来源4。

人类诱导多能干细胞（iPSCs）是干细胞治疗领域新兴的细胞来源5。人类iPSCs可通过OCT4、SOX2、Klf4和c-Myc等重编程因子将体细胞重编程而获得6。与胚胎干细胞（ESCs）相比，使用人类iPSCs可避免伦理争议和免疫排斥问题7,8。人类iPSCs具有多能性，能够分化为三个胚层9。在再生医学中，HLA是决定免疫反应及排斥风险的关键因素10。使用患者来源的iPSCs可解决细胞来源受限和免疫系统排斥的问题。脐带血单个核细胞（CBMCs）也已成为再生医学中一种替代性的细胞来源11。在CBMC储存过程中进行的强制性HLA分型，可便捷地用于科研和移植应用。此外，纯合型HLA类型的iPSCs可广泛适用于多种患者12。建立CBMC-iPSC库是细胞治疗和同种异体再生医学的一种新颖且高效的策略12,13,14。在本研究中，我们利用CBMC来源的iPSCs，将其分化为角质形成细胞和成纤维细胞，并构建出分层的三维皮肤结构。研究结果表明，由CBMC-iPSC衍生的三维皮肤类器官是体外和体内皮肤病学研究的一种新型工具。

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方案

所有涉及动物的实验操作均依照韩国天主教大学医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）发布的《实验动物福利法》、《实验动物护理与使用指南》以及《啮齿类动物实验的指导原则和政策》进行。本研究方案已获得韩国天主教大学机构审查委员会的批准（批准编号：CUMC-2018-0191-01）。韩国天主教大学松宜校区的机构动物护理与使用委员会（IACUC）及实验动物部（DOLA）于2017年获得韩国食品药品安全管理厅卓越动物实验室设施认证，并于2018年获得国际实验动物护理评估与认证协会（AAALAC International）的全面国际认证。

1. 由诱导性多能干细胞分化皮肤细胞

  1. 培养基制备
    注意：所有培养基应于避光条件下在 4 °C 保存，最长可保存 3 个月。使用前需用 0.22 μm 聚醚砜滤器系统过滤所有培养基以实现灭菌。所有培养基的总体积均为 500 mL。
    1. 制备 KDM1（角质形成细胞分化培养基 1）。将 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）/F12 培养基（3:1）与 2% 胎牛血清（FBS）、0.3 mmol/L L-抗坏血酸、5 μg/mL 胰岛素和 24 µg/mL 腺嘌呤混合。
    2. 制备 KDM2（角质形成细胞分化培养基 2）。将无血清定义型角质形成细胞培养基（参见材料表）与 0.3 mmol/L L-抗坏血酸、5 μg/mL 胰岛素和 10 μg/mL 腺嘌呤混合。
      注意：无血清定义型角质形成细胞培养基已优化，可支持角质形成细胞的生长与扩增。
    3. 制备 KDM3（角质形成细胞分化培养基 3）。将无血清定义型角质形成细胞培养基与无血清角质形成细胞培养基按 1:1 混合。详见材料表。
      注意：无血清角质形成细胞培养基已优化，适用于角质形成细胞的生长与维持。
    4. 制备 FDM1（成纤维细胞分化培养基 1）。将 DMEM/F12 培养基（3:1）与 5% FBS、5 μg/mL 胰岛素、0.18 mM 腺嘌呤和 10 ng/mL 表皮生长因子（EGF）混合。
    5. 制备 FDM2（成纤维细胞分化培养基 2）。将 DMEM/F12 培养基（1:1）与 5% FBS 和 1% 非必需氨基酸混合。
    6. 制备 EP1（上皮细胞培养基 1）。将 DMEM/F12（3:1）与 4 mM L-谷氨酰胺、40 μM 腺嘌呤、10 μg/mL 转铁蛋白、10 μg/mL 胰岛素和 0.1% FBS 混合。
    7. 制备 EP2（上皮细胞培养基 2）。将 EP1 与 1.8 mM 氯化钙混合。
    8. 制备 EP3（上皮细胞培养基 3，即角化培养基）。将 F12 培养基与 4 mM L-谷氨酰胺、40 μM 腺嘌呤、10 μg/mL 转铁蛋白、10 μg/mL 胰岛素、2% FBS 和 1.8 mM 氯化钙混合。
  2. 胚状体生成
    1. 采用先前研究12中所述方案生成 CBMC-iPSCs。
    2. 使用纤连蛋白包被培养皿。准备 5 mL 包被一个 100 mm 培养皿。
      1. 将 50 μL 浓度为 0.5 mg/mL 的纤连蛋白（终浓度：5 µg/mL）用 5 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）解冻并重悬。将溶液加入培养皿中，在室温（RT）孵育 1 小时。使用前吸除包被液（避免干燥）。
    3. 将来源于 CBMC 的 iPSCs 接种至纤连蛋白包被的 100 mm 培养皿中，并在 37 °C、10% CO2 条件下每日更换 iPSC 培养基（E8）。
    4. 采用先前研究15中所述方案生成胚状体（EBs）（简要描述如下）。通过更换培养基扩增 iPSCs，直至细胞达到 80% 汇合度。当细胞汇合度达 80% 时，移除培养基并用 PBS 洗涤。
    5. 用 1 mL 1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）处理细胞。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2 分钟，然后用 3 mL E8 培养基收集细胞。以 250 x g 离心 2 分钟。
    6. 吸除上清液，向细胞中加入 5 mL E8 培养基。使用血细胞计数板计数细胞，并将 1 x 106 个细胞转移至新的 15 mL 圆底离心管中。以 250 x g 离心 2 分钟。
    7. 用 2.5 mL EB 形成培养基重悬转移的细胞，并加入 10 μM Rho 相关激酶（ROCK）抑制剂。使用 10–100 μL 多通道移液器将 1 x 104 个细胞（25 µL/滴）滴加至未包被的培养皿盖上。由 1 x 106 个细胞形成 100 个 EBs（1 x 104 个细胞/1 个 EB）。翻转培养皿，使液滴悬挂于皿盖上。
      注意：在维持和分化过程中，贴壁阶段需要 ROCK 抑制剂。仅在 EB 聚集阶段添加 ROCK 抑制剂。
    8. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育液滴 1 天。
    9. 次日，收集 100 个 EBs 并用于分化。用 iPSC 培养基（E8 培养基）或 PBS 冲洗培养皿盖，将内容物收集至 50 mL 圆底离心管中。在室温下静置 1 分钟使 EBs 沉降。吸除上清液，用 E8 培养基重悬 EBs，并将其维持在 90 mm 培养皿中直至进行分化。
  3. CBMC-iPSCs 向角质形成细胞的分化
    注意：有关 CBMC-iPSCs 向角质形成细胞分化的示意图，请参见图 1A。
    1. 用 iPSC 培养基或 PBS 将 100 个 EBs 收集至 50 mL 圆底离心管中。在室温下静置 1 分钟使 EBs 沉降。确保其沉降至离心管底部。吸除上清液，用含 1 ng/mL 骨形态发生蛋白 4（BMP4）的 E8 培养基重悬 EBs。将 EBs 转移至 90 mm 培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下维持 1 天。
    2. 使用 IV 型胶原包被培养皿。准备 5 mL IV 型胶原溶液以包被一个 100 mm 培养皿。
      1. 将 IV 型胶原溶液（终浓度：50 µg/mL）用 0.05 N HCl 解冻并重悬。将溶液加入培养皿中，在室温下孵育 1 小时。使用前吸除包被液（避免干燥）。
        注意：使用培养皿前，用 PBS 洗涤 3 次以去除酸。
    3. 将 EBs（步骤 1.3.1）收集至 50 mL 圆底离心管中，在室温下静置 1 分钟使其沉降。确保其沉降至离心管底部，吸除上清液，并用含 10 μM ROCK 抑制剂的 6 mL KDM1 重悬 EBs。将 EBs 转移至 IV 型胶原包被的 100 mm 培养皿中。
      注意：仅在 EB 贴壁阶段添加 ROCK 抑制剂。
    4. 在第 0–8 天期间，每隔一天更换一次含 3 µM 视黄酸（RA）以及各 25 ng/mL BMP4 和 EGF 的 KDM1 培养基。在 37 °C、5% CO2 条件下维持 EBs。
    5. 在第 9–12 天期间，每隔一天更换一次含 3 µM RA、25 ng/mL BMP4 和 20 ng/mL EGF 的 KDM2 培养基。
    6. 在第 13–30 天期间，每隔一天更换一次含 10 ng/mL BMP4 和 20 ng/mL EGF 的 KDM3 培养基。
  4. CBMC-iPSCs 向成纤维细胞的分化
    注意：有关 CBMC-iPSCs 向成纤维细胞分化的示意图，请参见图 2A。
    1. 使用基底膜基质包被培养皿。准备 5 mL 包被一个 100 mm 培养皿。
      1. 解冻基底膜基质（终浓度：600 ng/mL），并用 DMEM/F12 培养基稀释。将溶液加入培养皿中，在 37 °C 下孵育 30 分钟。使用前吸除包被液（避免干燥）。
    2. 使用移液器将 100 个 EBs 用 iPSC 培养基或 PBS 收集至 50 mL 圆底离心管中。在室温下静置 1 分钟使 EBs 沉降。确保其沉降至离心管底部。移除上清液。
    3. 使用 1,000 µL 移液器将 EBs 用含 10 μM ROCK 抑制剂的 6 mL FDM1 重悬。将 EBs（连同培养基）转移至基底膜基质包被的 100 mm 培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。每两天更换一次 FDM1，持续 3 天。
      注意：仅在 EB 贴壁阶段添加 ROCK 抑制剂。
    4. 在第 4 至 6 天期间，在 FDM1 中添加 0.5 nM 骨形态发生蛋白 4（BMP4）。
    5. 第 7 天起，每隔一天更换一次 FDM2 培养基，持续 1 周。
    6. 第 14 天，加入 1 mL 1 mM EDTA，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2 分钟。用 3 mL FDM2 收集细胞，以 250 x g 离心 2 分钟。移除上清液，用 5 mL FDM1 重悬细胞。
    7. 使用血细胞计数板计数细胞，将 2 x 106 个细胞用 FDM1 培养基重悬，并将细胞转移至未包被的培养皿中。在 37 °C、5% CO2 条件下维持细胞，并每隔一天更换一次培养基。
    8. 使用 I 型胶原包被培养皿。准备 5 mL 包被一个 100 mm 培养皿。将 I 型胶原溶液（终浓度：50 µg/mL）用 0.02 N 乙酸稀释。将溶液加入培养皿中，在室温下孵育 1 小时。使用前吸除包被液（避免干燥）。
      注意：使用培养皿前，用 PBS 洗涤 3 次以去除酸。
    9. 第 21 天，加入 1 mL 1 mM EDTA，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2 分钟。用 3 mL FDM1 收集细胞，以 250 x g 离心 2 分钟。移除上清液，用 5 mL FDM1 重悬细胞。使用血细胞计数板计数细胞，并将 2 x 106 个细胞用 FDM1 培养基转移至 I 型胶原包被的 100 mm 培养皿中。在 37 °C、5% CO2 条件下维持细胞，并每隔一天更换一次培养基。
    10. 第 28 天，加入 1 mL 1 mM EDTA，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2 分钟。用 3 mL FDM1 收集细胞，以 250 x g 离心 2 分钟。移除上清液，用 5 mL FDM1 重悬细胞。使用血细胞计数板计数细胞，并将 2 x 106 个细胞用 FDM1 培养基转移至未包被的培养皿中。在 37 °C、5% CO2 条件下维持细胞，并每隔一天更换一次培养基。
      注意：iPSC 来源的成纤维细胞增殖特性类似于原代成纤维细胞系，可传代至 10 代。本研究中，我们使用传代 2 至 5 次的 iPSC 来源成纤维细胞进行后续分析。

2. 人诱导多能干细胞分化细胞的应用

  1. 3D皮肤类器官的生成
    1. 按照制造商的建议，在冰上制备中和的I型胶原蛋白。最终I型胶原蛋白浓度为3 mg/mL（I型胶原蛋白的储存浓度为3.47 mg/mL），确保混合液的最终体积为5 mL。计算10x PBS的体积（最终体积/10 = 0.5 mL）。计算所需I型胶原蛋白的体积（最终体积 × 最终胶原蛋白浓度 / 储存胶原蛋白浓度 = 5 mL × 3 mg/mL / 3.47 mg/mL = 4.32 mL）。计算1 N NaOH的体积（所用胶原蛋白体积 × 0.023 mL = 0.1 mL）。计算dH2O的体积（最终体积 - 胶原蛋白体积 - 10x PBS体积 - 1 N NaOH体积 = 5 mL - 4.32 mL - 0.5 mL - 0.1 mL = 0.08 mL）。混合管内所有成分，并在使用前保持在冰上。
    2. 向步骤1.4.10中获得的iPSC来源的成纤维细胞加入1 mL EDTA，在37 °C、5% CO2条件下孵育2分钟。收集脱落的细胞，使用血细胞计数板计数，并将2 × 105个细胞转移至新的15 mL锥形管中。在250 × g条件下离心2分钟，弃去上清液。将iPSC来源的成纤维细胞重悬于1.5 mL FDM1和中和的I型胶原蛋白溶液（1:1）中。
      注：轻轻混匀溶液，避免产生气泡。
    3. 将膜插件置于6孔微孔板上，将混合液转移至插件中，在室温下孵育30分钟。
      注：不要移动培养板。
    4. 确认凝胶形成后，在插件顶部加入2 mL培养基，底部孔中加入3 mL培养基。将成纤维细胞与胶原蛋白基质在37 °C、5% CO2条件下孵育5–7天，直至凝胶完全形成且不再收缩。
    5. 完全凝胶化后，使用EDTA分离步骤1.3.6中获得的iPSC来源的角质形成细胞。加入1 mL EDTA，在37 °C、5% CO2条件下孵育2分钟。收集脱落的细胞，使用血细胞计数板计数，并将1 × 106个细胞转移至新的15 mL锥形管中。在250 × g条件下离心2分钟。
    6. 弃去上清液，将1 × 106个细胞重悬于50–100 µL低钙上皮培养基1（EP1）中。
    7. 吸除基质中的全部培养基（见步骤2.1.5），并将1 × 106个iPSC来源的角质形成细胞接种至每层成纤维细胞上。在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。
      注：不要移动培养板，且在角质形成细胞贴附期间不要添加任何培养基。
    8. 在插件顶部加入2 mL EP1，在底部孔中加入3 mL EP1。
    9. 2天后，吸除膜插件板中的全部培养基，并更换为正常钙EP2培养基，继续培养2天。
    10. 2天后，吸除全部培养基，仅在底部加入3 mL角化培养基，以形成气-液界面。
    11. 将3D皮肤类器官在37 °C、5% CO2条件下维持最多14天，每隔一天更换一次培养基。通过切割插件边缘收获3D皮肤类器官，并用于后续染色及皮肤移植研究。
  2. 皮肤移植
    1. 采用机构批准的标准方法，对NOD/scid小鼠（雄性，6周龄）进行吸入麻醉。进行皮肤移植前，剃除每只小鼠背部皮肤的毛发。
    2. 使用弯剪和镊子切除小鼠皮肤1 cm × 2 cm的区域。
    3. 将CBMC-iPSC来源的3D皮肤类器官置于缺损部位，并使用丝线缝合结合加压包扎法固定。
    4. 观察小鼠2周后处死，进行组织学分析。染色方案已在先前研究中验证16。

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结果

皮肤主要由表皮和真皮构成。角质形成细胞是表皮的主要细胞类型，成纤维细胞是真皮的主要细胞类型。角质形成细胞分化的示意图见图1A。CBMC-iPSCs在包被了纤连蛋白的培养皿中维持培养（图1B）。在本研究中，我们通过拟胚体（EB）形成的方法将CBMC-iPSCs分化为角质形成细胞和成纤维细胞。我们采用悬滴法生成拟胚体，以确保角质形成细胞和成纤维细胞的均一且可控的分化过程（图1C）。将拟胚体接种于包被有IV型胶原的培养板上以诱导角质形成细胞分化，并每天更换培养基。CBMC-iPSCs使用视黄酸（RA）、骨形态发生蛋白4（BMP4）和表皮生长因子（EGF）进行处理，诱导其向角质形成细胞分化。在分化过程中，源自CBMC-iPSCs的角质形成细胞形态随时间发生改变（补充图1）。

CB...

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讨论

人类诱导多能干细胞（iPSCs）被认为是个性化再生医学的一种新选择17。源自患者的个性化iPSCs能够反映患者的个体特征，可用于疾病建模、药物筛选以及自体移植18,19。使用患者来源的iPSCs还可克服原代细胞在细胞数量不足及免疫反应方面存在的问题5,17,19。然而，由于时间、成本和人力的限制，个性化iPSCs的制备在经济上并不可行。HLA纯合的脐带血单个核细胞（CBMC）来源的iPSCs已成为一种新的可能方案。HLA纯合的iPSCs具有较高的经济价值，并可应用于大量患者8,11,12,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了韩国医疗技术研究开发项目（Korea Healthcare Technology R&韩国保健福祉家庭部 #38;D 项目（H16C2177，H18C1178）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
腺嘌呤SigmaA2786成纤维细胞分化培养基组分
AggreWell 培养基（拟胚体形成培养基）STEMCELL05893EB形成
抗纤连蛋白抗体abcamab23750成纤维细胞标志物
抗KRT14抗体abcamab7800角蛋白形成细胞标志物
抗兜甲蛋白抗体abcamab85679角质层标志物
抗p63抗体abcamab124762角蛋白形成细胞标志物
抗波形蛋白抗体圣克鲁兹sc-7558成纤维细胞标志物
邦迪 弹性织物Johnson &安普与约翰逊-绷带
基底膜基质（Matrigel）BD354277成纤维细胞分化培养基组分
BLACK SILK 缝合线AILEEESK617皮肤移植
CaCl2SigmaC56703D皮肤类器官上皮培养基组分
I型胶原蛋白BD354236三维皮肤类器官
IV型胶原蛋白Santa-cruzsc-29010角质形成细胞分化培养基组分
成分明确的角质形成细胞无血清培养基Gibco10744-019角质形成细胞分化培养基组分
DMEM，高糖Gibco11995065分化培养基组分
DMEM/F12 培养基Gibco11330-032分化培养基组分
Essential 8 培养基GibcoA1517001iPSC 培养基
FBS，合格康宁35-015-CV成纤维细胞与角质形成细胞分化培养基组分
谷氨酰胺补充剂 Gibco35050061成纤维细胞分化培养基组分
胰岛素Invtrogen12585-014成纤维细胞与角质形成细胞分化培养基组分
虹膜标准弯剪专业PC-02.10外科手术器械
无血清角质形成细胞培养基Gibco17005-042角质形成细胞分化培养基组分
L-抗坏血酸-2-磷酸镁盐水合物SigmaA8960角质形成细胞分化培养基组分
MEM非必需氨基酸Gibco1140050成纤维细胞分化培养基组分
梅里亚姆有齿镊 16 厘米HIROSEHC 2265-1外科手术器械
NOD.CB17-Prkdc SCID/J杰克逊实验室001303用于皮肤移植的小鼠品系
90 mm 培养皿现代微科H10090塑料器皿
重组人BMP-4R&研发314-BP角质形成细胞分化培养基组分
重组人EGF蛋白R&研发236-EG角质形成细胞分化培养基组分
视黄酸SigmaR2625角质形成细胞分化培养基组分
T/C 培养皿 100 毫米，每箱 240 个TPP93100塑料器皿
转铁蛋白SigmaT37053D皮肤类器官上皮培养基组分
Transwell-COL 胶原包被膜小室 康宁CLS3492用于三维皮肤类器官的塑料器皿 
玻璃粘连蛋白Life technologiesA14700iPSC 培养
Y-27632 二盐酸盐peprotech1293823iPSC 培养

参考文献

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