由脐带血来源的诱导多能干细胞生成三维皮肤类器官

摘要

我们提出了一种实验方案，用于诱导多能干细胞来源的角质形成细胞和成纤维细胞的分化，并利用这些角质形成细胞和成纤维细胞构建三维皮肤类器官。该方案包含建立人源化小鼠模型的额外步骤。本文所介绍的技术将有助于推动皮肤科领域的研究进展。

摘要

皮肤是人体最大的器官，具有多种功能。皮肤作为物理屏障保护机体，并调节各种生理功能。仿生学是指模仿自然界中的模型、系统和元素，以解决复杂的人类问题¹。皮肤仿生技术是体外疾病研究和体内再生医学的有力工具。人诱导性多能干细胞（iPSCs）具有无限增殖的能力，并可分化为三个胚层的细胞。人iPSCs可由多种原始细胞生成，如血细胞、角质形成细胞、成纤维细胞等。其中，脐带血单个核细胞（CBMCs）作为同种异体再生医学视角下的替代细胞来源日益受到关注。CBMCs在再生医学中具有应用价值，因为人类白细胞抗原（HLA）分型对于细胞库系统的建立至关重要。本文提供一种将CBMC来源的iPSCs分化为角质形成细胞和成纤维细胞，并构建三维皮肤类器官的方法。由CBMC-iPSCs衍生的角质形成细胞和成纤维细胞具有与原代细胞系相似的特性。三维皮肤类器官通过将表皮层覆盖于真皮层之上而形成。通过移植该三维皮肤类器官，可建立人源化小鼠模型。本研究表明，来源于人iPSCs的三维皮肤类器官可能成为体外和体内皮肤科学研究的一种新颖且可行的替代工具。

引言

皮肤覆盖于身体最外层表面，保护内部器官。皮肤具有多种功能，包括抵御病原体、吸收和储存水分、调节体温以及排泄代谢废物²。根据皮肤来源的不同，皮肤移植可分为不同类型：使用他人供体皮肤的称为同种异体移植（allograft），而使用患者自身皮肤的则称为自体移植（autograft）。尽管自体移植因排斥反应风险较低而被视为首选治疗方式，但对于存在严重创面或皮肤细胞数量不足的患者而言，获取皮肤活检样本较为困难。在严重烧伤患者中，需要三倍数量的皮肤细胞才能覆盖大面积创面。由于患者自身可获取的皮肤细胞数量有限，因此在某些情况下必须采用同种异体移植。同种异体移植物通常仅作为临时措施使用，直至可进行自体移植，因为此类移植物通常在约1周后会被宿主免疫系统排斥³。为克服患者免疫系统的排斥反应，移植物必须来源于与患者具有相同免疫特征的细胞来源⁴。

人类诱导多能干细胞（iPSCs）是干细胞治疗领域新兴的细胞来源⁵。人类iPSCs可通过OCT4、SOX2、Klf4和c-Myc等重编程因子将体细胞重编程而获得⁶。与胚胎干细胞（ESCs）相比，使用人类iPSCs可避免伦理争议和免疫排斥问题^7,

方案

所有涉及动物的实验操作均依照韩国天主教大学医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）发布的《实验动物福利法》、《实验动物护理与使用指南》以及《啮齿类动物实验的指导原则和政策》进行。本研究方案已获得韩国天主教大学机构审查委员会的批准（批准编号：CUMC-2018-0191-01）。韩国天主教大学松宜校区的机构动物护理与使用委员会（IACUC）及实验动物部（DOLA）于2017年获得韩国食品药品安全管理厅卓越动物实验室设施认证，并于2018年获得国际实验动物护理评估与认证协会（AAALAC International）的全面国际认证。

1. 由诱导性多能干细胞分化皮肤细胞

1. 培养基制备
   注意：所有培养基应于避光条件下在 4 °C 保存，最长可保存 3 个月。使用前需用 0.22 μm 聚醚砜滤器系统过滤所有培养基以实现灭菌。所有培养基的总体积均为 500 mL。
   1. 制备 KDM1（角质形成细胞分化培养基 1）。将 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）/F12 培养基（3:1）与 2% 胎牛血清（FBS）、0.3 mmol/L L-抗坏血酸、5 μg/mL 胰岛素和 24 µg/mL 腺嘌呤混合。
   2. 制备 KDM2（角质形成细胞分化培养基 2）。将无血清定义型角质形成细胞培养基（参见材料表）与 0.3 mmol/L L....

结果

皮肤主要由表皮和真皮构成。角质形成细胞是表皮的主要细胞类型，成纤维细胞是真皮的主要细胞类型。角质形成细胞分化的示意图见图1A。CBMC-iPSCs在包被了纤连蛋白的培养皿中维持培养（图1B）。在本研究中，我们通过拟胚体（EB）形成的方法将CBMC-iPSCs分化为角质形成细胞和成纤维细胞。我们采用悬滴法生成拟胚体，以确保角质形成细胞和成纤维细胞的均一且可控的分化过程（图1C）。将拟胚体接种于包被有IV型胶原的培养板上以诱导角质形成细胞分化，并每天更换培养基。CBMC-iPSCs使用视黄酸（RA）、骨形态发生蛋白4（BMP4）和表皮生长因子（EGF）进行处理，诱导其向角质形成细胞分化。在分化过程中，源自CBMC-iPSCs的角质形成细胞形态随时间发生改变（补充图1）。

CB.......

讨论

人类诱导多能干细胞（iPSCs）被认为是个性化再生医学的一种新选择¹⁷。源自患者的个性化iPSCs能够反映患者的个体特征，可用于疾病建模、药物筛选以及自体移植^18,19。使用患者来源的iPSCs还可克服原代细胞在细胞数量不足及免疫反应方面存在的问题^5,17,19。然而，由于时间、成本和人力的限制，个性化iPSCs的制备在经济上并不可行。HLA纯合的脐带血单个核细胞（CBMC）来源的iPSCs已成为一种新的可能方案。HLA纯合的iPSCs具有较高的经济价值，并可应用于大量患者^8,11,12,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺嘌呤	Sigma	A2786	成纤维细胞分化培养基组分
AggreWell 培养基（拟胚体形成培养基）	STEMCELL	05893	EB形成
抗纤连蛋白抗体	abcam	ab23750	成纤维细胞标志物
抗KRT14抗体	abcam	ab7800	角蛋白形成细胞标志物
抗兜甲蛋白抗体	abcam	ab85679	角质层标志物
抗p63抗体	abcam	ab124762	角蛋白形成细胞标志物
抗波形蛋白抗体	圣克鲁兹	sc-7558	成纤维细胞标志物
邦迪 弹性织物	Johnson &安普与约翰逊	-	绷带
基底膜基质（Matrigel）	BD	354277	成纤维细胞分化培养基组分
BLACK SILK 缝合线	AILEEE	SK617	皮肤移植
CaCl2	Sigma	C5670	3D皮肤类器官上皮培养基组分
I型胶原蛋白	BD	354236	三维皮肤类器官
IV型胶原蛋白	Santa-cruz	sc-29010	角质形成细胞分化培养基组分
成分明确的角质形成细胞无血清培养基	Gibco	10744-019	角质形成细胞分化培养基组分
DMEM，高糖	Gibco	11995065	分化培养基组分
DMEM/F12 培养基	Gibco	11330-032	分化培养基组分
Essential 8 培养基	Gibco	A1517001	iPSC 培养基
FBS，合格	康宁	35-015-CV	成纤维细胞与角质形成细胞分化培养基组分
谷氨酰胺补充剂	Gibco	35050061	成纤维细胞分化培养基组分
胰岛素	Invtrogen	12585-014	成纤维细胞与角质形成细胞分化培养基组分
虹膜标准弯剪	专业	PC-02.10	外科手术器械
无血清角质形成细胞培养基	Gibco	17005-042	角质形成细胞分化培养基组分
L-抗坏血酸-2-磷酸镁盐水合物	Sigma	A8960	角质形成细胞分化培养基组分
MEM非必需氨基酸	Gibco	1140050	成纤维细胞分化培养基组分
梅里亚姆有齿镊 16 厘米	HIROSE	HC 2265-1	外科手术器械
NOD.CB17-Prkdc SCID/J	杰克逊实验室	001303	用于皮肤移植的小鼠品系
90 mm 培养皿	现代微科	H10090	塑料器皿
重组人BMP-4	R&研发	314-BP	角质形成细胞分化培养基组分
重组人EGF蛋白	R&研发	236-EG	角质形成细胞分化培养基组分
视黄酸	Sigma	R2625	角质形成细胞分化培养基组分
T/C 培养皿 100 毫米，每箱 240 个	TPP	93100	塑料器皿
转铁蛋白	Sigma	T3705	3D皮肤类器官上皮培养基组分
Transwell-COL 胶原包被膜小室	康宁	CLS3492	用于三维皮肤类器官的塑料器皿
玻璃粘连蛋白	Life technologies	A14700	iPSC 培养
Y-27632 二盐酸盐	peprotech	1293823	iPSC 培养