通过等温滴定 calorimetry（ITC）可方便地测定酶活性的热稳定性。目前使用的大多数蛋白质稳定性检测方法仅测量蛋白质的去折叠过程，而无法提供有关酶活性的信息。ITC 能够直接确定酶修饰对酶活性稳定性的影响。
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摘要
摘要
本研究展示了一种利用等温滴定量热法（ITC）测定酶活性稳定性的新方法。在将底物溶液单次注入酶溶液后，所观察到的峰值热速率与酶活性相关。通过在一段时间内将底物多次注入同一酶溶液，可监测酶活性的下降。该检测方法具有自主性，所需人工操作时间极少，且适用于大多数培养基和酶。
引言
酶是一类能够催化多种有机反应的蛋白质。大多数酶在接近中性的水溶液中发挥作用，从而避免了使用苛刻的溶剂。由于具有高度选择性，与酸、碱等非选择性催化剂相比，酶催化反应产生的副产物更少（在某些情况下甚至没有副产物）1。这一点在食品制造中尤为重要，因为所有化学反应都必须确保最终产品对人体安全可食用。目前，酶已被用于生产高果糖玉米糖浆2、奶酪3、啤酒4、无乳糖牛奶5以及其他重要的食品。尽管本文重点讨论酶在食品工业中的应用，但酶还有许多其他用途，包括在绿色化学和药物合成中的应用。
酶的应用受到酶活性稳定性的限制，而酶活性的稳定性取决于酶三维结构的维持。可通过聚乙二醇化修饰6、在固体载体上固定化7、基因改造8以及配方优化等方法来稳定酶的结构。目前，通常采用差示扫描量热法（DSC）和终点酶活性检测法来测定酶的稳定性9。DSC 可测量酶发生解折叠时的温度；该温度越高，说明酶结构越稳定。然而，酶活性的丧失往往发生在低于酶整体或其结构域解折叠所需温度的条件下
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方案
1. 样品制备
- 1,000 mL 0.1 M 醋酸钠缓冲液，pH 4.6
- 用量筒量取 800 mL 去离子水，倒入 1,000 mL 烧杯中。
- 称取 8.2 g 无水醋酸钠，加入烧杯中。
- 将烧杯置于磁力搅拌器上，放入搅拌子，开启搅拌器，搅拌至完全溶解。
- 待无水醋酸钠完全溶解后，使用校准后的 pH 计测量溶液 pH。
- 根据需要加入 1 M HCl 或 NaOH，调节至目标 pH 4.6。
- 加入去离子水，定容至总体积为 1,000 mL。
- 室温保存，待用。
- 酶溶液
- 首先用量筒量取 8 mL 0.1 M 醋酸钠缓冲液（pH 4.6），置于 15 mL 量筒中，配制 10 mL 酶溶液，使酶浓度处于 10–30 mg/mL 范围内。
- 将缓冲液转移至含有酶的 15 mL 锥形离心管中，剧烈震荡，直至酶完全溶解。
- 继续加入缓冲液，定容至总体积为 10 mL。
- 将酶溶液置于 4 °C 保存，待用。
- 底物溶液
- 为配制浓度在 300–600 mM 范围内....
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结果
图1和图5中的代表性结果展示了两种酶——乳糖酶和转化酶的实验数据。乳糖酶和转化酶分别催化二糖水解为两个单糖，前者为吸热反应，后者为放热反应。这两种酶促反应均在不会使酶达到饱和的浓度下进行。
乳糖酶数据展示了如何利用等温滴定量热法（ITC）数据来评估酶的稳定性。将600 mM乳糖分四次连续滴定，每次注入4 µL（图1），加入到20 mg/mL的乳糖酶溶液中。每次注射之间间隔5,400秒，以确保在每次注射前系统有足够时间恢复至初始基线。上述方案分别在25 °C、35 °C、45 °C和55 °C下进行。此外，在55 °C条件下，将600 mM乳糖滴定至100 mM乙酸钠缓冲液中作为空白对照，以校正混合热效应。每次将底物注入酶溶液时，首先出现初始的放热混合热，随后乳糖酶催化乳糖发生吸热性水解反应，直至反应完成，热释放速率恢复至基线水平。乳糖向乳糖酶溶液中的注射共重复四次，由于酶活性逐渐降低，后续每次注射所引起的.......
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讨论
本文所述的ITC酶稳定性测定法的一个主要优势是其自动化程度高。一旦配制好所有适当的缓冲液和溶液，每次测定的设置时间仅需约15分钟。相比之下，传统的转化酶和乳糖酶活性测定方法需要约2小时，并且实验人员需持续参与，而许多其他酶活性测定所耗费的人工时间更长。在之前的一项研究中，我们已证明ITC方法所得数据与传统的分光光度法测定转化酶活性的结果具有可比性11。
ITC 测定法的另一个优势在于其几乎适用于任何酶12因此，在特定条件下测试不同酶的稳定性时，无需建立多种不同的检测方法。此外，等温滴定量热法（ITC）可用于测定新型酶或缺乏合适比色检测方法的酶的活性稳定性。 ITC 测定还可用于不透明介质，这在食品科学中具有显著优势。由于大多数先前的酶活性测定方法依赖分光光度法、荧光法或发光法来检测酶活性，因而无法适用于不透明或高色素的介质。尽管本研究仅展示了温度对酶活性稳定性的影响，但 ITC 方法同样适用于影响酶稳定性的大多数其他条件（如 pH、盐类、非水溶剂和变性剂）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| α-乳糖 | Fisher Scientific | 未知（过期） | 500g |
| 乙酸钠，无水，纯度≥99% | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| 乳糖酶 | MP Bio | 100780 | 5g |
| 盐酸溶液，1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| 台式pH计 | VWR | 89231-622 | |
| 70%乙醇 | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1加仑 |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L（清洗液） |
参考文献
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn S....
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重印与许可
