通过小鼠次级运动皮层双侧局部场电位记录评估半球偏侧化

摘要

我们介绍了在小鼠双侧次级运动皮层（M2）中进行局部场电位（LFP）的体内电生理记录方法，该方法可用于评估大脑半球的偏侧化功能。研究发现，与野生型对照组小鼠相比，APP/PS1小鼠左右M2之间的同步化水平发生改变。

摘要

本文展示了在小鼠皮层区域进行体内双侧局部场电位（LFP）记录与分析的完整且详细的实验流程，该方法可用于评估可能存在的偏侧性缺陷，以及研究啮齿类动物脑连接性和神经网络活动的耦合情况。阿尔茨海默病（AD）是一种常见的神经退行性疾病，其潜在的病理机制在很大程度上仍不清楚。已有研究表明，人脑的偏侧化在衰老过程中会发生改变，但异常的偏侧化是否是AD的早期征象之一，目前尚未确定。为探讨这一问题，我们对3至5月龄的AD模型小鼠APP/PS1及其同窝野生型（WT）对照小鼠进行了双侧LFP记录。结果显示，在APP/PS1小鼠中，左右两侧次级运动皮层（M2）的局部场电位（特别是在伽马频段）比WT对照组具有更高的同步性，提示在此AD小鼠模型中双侧M2半球的不对称性有所下降。值得注意的是，该记录与数据分析流程具有良好的灵活性且易于操作，也可应用于其他脑通路的研究，适用于关注神经环路的实验。

引言

阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆类型^1,2。细胞外β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein, Aβ）沉积和细胞内神经原纤维缠结（NFTs）是AD的主要病理特征^3,4,5，但AD发病机制的详细过程仍不明确。大脑皮层是认知和记忆的关键结构，在AD中受到损害⁶，且随着年龄增长，会出现行走缓慢、环境导航困难和步态异常等运动功能障碍⁷。在AD患者⁸以及认知功能受损的老年人⁹中，也观察到前运动皮层（PMC）和辅助运动区（SMA）存在Aβ沉积和神经原纤维缠结，提示运动系统的功能障碍参与了AD的发病过程。

大脑由两个被纵向裂隙分隔开的独立大脑半球构成。健康的大脑在结构和功能上均表现出不对称性¹⁰，这种现象称为"侧化"，使大脑能够高效地处理多种任务和活动。随着年龄增长，认知和运动能力会衰退，同时伴随大脑侧化程度的降低^11,12。在健康大脑中，左半球的运动功能表现明显¹³，但在阿尔茨海默病（AD）大脑中，由于与左侧皮层萎缩相关的左半球优势功能丧失，会出现异常的侧化现象^14,15,16。因此，理解AD发病过程中大脑侧化可能发生的改变及其潜在机制，可能为揭示AD的发病机制提供新的视角，并有助于发现潜在的治疗生物标志物。

电生理测量是一种评估动物神经元活动变化的敏感且有效的方法。已有电生理研究通过同步的半球间传递时间记录，证实了老年人半球不对称性减弱的现象（HAROLD）¹⁷，表现为老年人对单耳呈现的言语刺激缺乏或减弱了半球不对称性¹⁸。本研究结合最常用的阿尔茨海默病小鼠模型之一APP/PS1^19,20,21,22，以及对左右两侧M2区局部场电位（LFPs）进行的in vivo双侧细胞外记录，评估了阿尔茨海默病中可能存在的偏侧性功能缺陷。此外，通过简单的参数设置，数据分析软件（见材料表）内置的功能可提供比复杂数学编程语言更快速、更直接的电信号同步性分析方法，对in vivo电生理学初学者更加友好。

方案

所有动物均按照中国科学技术部实验动物指南的要求，在标准条件下成对饲养（12小时明暗循环、恒温环境、自由摄食和饮水），实验已获广州大学当地伦理委员会批准。本实验为非存活性操作。 

注意：代表性结果中所示数据使用了3-5月龄的APP/PS1（B6C3-Tg（APPswe, PSEN1dE9）85Dbo/J）双转基因小鼠及其同窝野生型（WT）对照小鼠进行记录（每组n = 10）。

1. 动物麻醉与手术

1. 根据您所在机构动物护理委员会批准的麻醉方案，称重并麻醉小鼠。 
2. 使用镊子进行尾部或足趾夹捏，以确认手术前已达到深度麻醉状态。
3. 将小鼠置于立体定位仪中，并固定其头部。
4. 在双眼上涂抹眼膏以保持湿润。遵循您所在机构关于术前和术后镇痛的动物护理指南。 
5. 使用手术剪刀剃除手术区域的毛发。在暴露的手术区域中央做一个12–15 mm的小切口。用镊子轻轻将头皮从正中线拉开。
6. 轻柔分离皮肤并清除残留组织。使用浸有双氧水的棉签清洁颅骨表面。
7. 在颅骨左右两侧钻两个直径为1.0–1.5 mm的小孔，以便在体视显微镜下将记录微电极插入M2区域（图1A）。
   注意：双侧M2的立体定位坐标为：前囟前1.94 mm，正中线外侧1.0 mm，硬脑膜下0.8–1.1 mm。
8. 用钨针小心去除硬脑膜。
9. 将玻璃硼硅酸盐微移液管（外径：1.0 mm）拉制成记录微电极，电阻为1–2 MΩ。
10. 使用机械微操纵器，将两根分别充满0.5 M NaCl的记录微电极以60°角插入小孔中（ 图1B）。

2. 小鼠双侧 M2 区的 LFP 记录

1. 将左右玻璃电极缓慢降至双侧M2的适当坐标位置 (图1C).
2. 为质量控制，在采集局部场电位（LFPs）之前，使用差分放大器检测每个电极的阻抗。
3. 将记录过程设置为高通0.1 Hz、低通1,000 Hz，放大倍数为1,000倍。
4. 采集数字化数据 稳定状态下小鼠以每秒2次呼吸频率均匀呼吸时，至少60秒的自发活动原始局部场电位数据 在麻醉状态下
5. 记录完毕后，缓慢将电极从脑组织中取出，随后通过快速颈椎脱位法处死小鼠。
6. 保存数据并进行离线分析。

3. 互相关分析

1. 在分析软件中点击 分析 - 波形相关性，并导入数据。
2. 参数设置
   1. 将一个波形通道信号定义为第一通道，另一个定义为参考通道。将宽度设为 2，偏移量设为 1（图 2A）。
   2. 通过选择起始时间和结束时间，设置两个局部场电位（LFP）的持续时间为 100 秒。点击 处理 按钮以执行互相关分析（图 2B）。
      注意：具有此类持续时间的双侧同步信号已足够长，可用于显示神经元的自发活动，从而揭示同步化的基本特性。
3. 点击 文件 - 另存为，然后将与弹出图表对应的互相关结果以 .txt 格式保存。
4. 打开该 .txt 文件（图 2C），删除时间滞后在 0 ± 0.01 秒范围内的相关值（因为两个连续的伽马波至少有 0.01 秒的时间间隔），然后对负时间滞后部分的其余互相关数据求平均值，或对正时间滞后部分的其余互相关数据求平均值。

4. 相干性分析

1. 在分析软件中导入并运行数据。
2. 将两个LFP信号分别指定为第一和第二波形通道，然后设置块大小值（图3A）。
   注意：块大小指在FFT中使用的数据点数量。块大小越大，频率分辨率越高。此处建议设置为4096。
3. 手动移动虚线，确保两个通道信号的时间精度设定为相同的时段（图3B）。按下添加区域按钮以加载该区域并执行相干性分析。
4. 点击文件 — 另存为，将与弹出图表对应的相干性结果保存为.txt格式（图3B）。

结果

为了探究早期阿尔茨海默病（AD）病理是否损害大脑半球偏侧化能力，我们在3至5月龄的APP/PS1小鼠和野生型（WT）对照小鼠中进行了双侧M2区细胞外局部场电位（LFP）记录，并分析了左右侧LFP信号的互相关性。在WT小鼠中，结果显示，正时间滞后的左右LFP平均相关性与负时间滞后的相关性存在显著差异，提示WT对照小鼠M2区域存在半球不对称性（图4C；WT-正滞后，0.08161 ± 0.01246；WT-负滞后，0.0206 ± 0.01218；双样本t检验，p = 4.74531E-4 ＜ 0.001）。相比之下，APP/PS1小鼠的左右侧LFP在时域上表现出更高的同步性，提示其左右M2区域之间的不对称性降低（图4C；APP/PS1-正滞后，0.13336 ± 0.0105；APP/PS1-负滞后，0.12635 ± 0.01066；双样本t检验，p = 0.64157 ＞ 0.05）。

讨论

本文报道了体内双侧细胞外记录的实验方法，并结合分析两个脑区局部场电位（LFP）信号的同步性，该方法灵活且易于实施，可用于评估大脑半球的偏侧化以及两个脑区神经活动之间的连接性、方向性或耦合性。该方法不仅可用于揭示群体神经元活动，还可广泛用于研究脑区间电生理的基本特性，尤其适用于关注振荡活动筛选或缺乏在行为动物中进行多通道记录系统的实验室²³。

通常，有多种技术可用于监测脑部活动，包括脑电图（EEG）、脑磁图（MEG）和功能性磁共振成像（fMRI）。与本文所展示的记录方法相比，这些方法的时间和空间分辨率相对较低。例如，脑电图是研究脑组织细胞外活动最古老且商业化程度最高的仪器之一。尽管已有研究在自由活动的啮齿类动物中采用"高密度”脑电图以改善其空间分辨率不足的问题^24,25,26，但颅骨始终会引入更多噪声，从而降低皮层伽马振荡的信...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
交流/直流差分放大器	A-M Systems	Model 3000
模数转换器	Cambridge Electronic Design Ltd.	Micro1401
玻璃硼硅酸盐微电极毛细管	南京舜科教学实验设备有限公司	161230	外径：1.0 mm
微电极拉制仪	Narishige	PC-10
氯化钠（NaCl）	广州化学试剂厂	7647-14-5
针式微电极夹持器	World Precision Instruments, INC.	MEH3SW10
Spike2	Cambridge Electronic Design Ltd.
体视显微镜	Zeiss	435064-9020-000
立体定位仪	RWD Life Science	68045
氨基甲酸乙酯（Urethane）	Sigma-Aldrich	94300