利用 PiggyBac 载体将人诱导的多能干细胞 (Ipsc) 转化为功能性脊柱和颅内运动神经元

摘要

该协议允许诱导多能干细胞快速有效地转换为具有脊柱或颅内身份的运动神经元, 通过从诱导的 piggyBac 载体的转录因子的异位表达。

摘要

我们这里描述了一种方法来获得功能性脊椎和颅内运动神经元从人类诱导的多能干细胞 (Ipsc)。直接转化为运动神经元是通过转录因子的替代模块, 即 Ngn2、Isl1 和 Lhx3 (NIL) 或 Ngn2、Isl1 和 Phox2a (NIP) 的异位表达而获得的。NIL 和 NIP 分别指定脊柱和颅内运动神经元的身份。我们的协议从生成修改后的 iPSC 线开始, 在这些线路中, NIL 或 NIP 通过 piggyBac 转座子载体稳定地集成到基因组中。然后由多西环素诱导转基因基因的表达, 并在5天内导致 Ipsc 转化为 MN 祖细胞。随后的成熟, 7天, 导致脊柱或颅内 Mna 的同质种群。与以前的协议相比, 我们的方法有几个优点: 它非常快速和简化;它不需要病毒感染或进一步 MN 分离;它允许产生不同的 MN 亚群 (脊椎和颅骨) 与显著的成熟程度, 这证明了火训练的动作电位。此外, 大量的运动神经元可以获得没有纯化从混合人群。ipsc 衍生的脊髓和颅内运动神经元可用于肌萎缩侧索硬化症和运动神经神经元的其他神经退行性疾病的体外建模。均匀运动神经元群可能是细胞类型特异性药物筛选的重要资源。

引言

运动神经元 (MN) 变性在肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和脊髓肌萎缩 (SMA) 等人类疾病中起着致病作用。建立合适的体外细胞模型系统, 总结人类 MN 的复杂性, 是朝着发展新的治疗方法迈出的重要一步。诱导多能干细胞 (ipsc) 具有显著的多系分化特性, 目前已从一些受运动神经元疾病 1^,2 的患者中提取。从控制 "健康" 多能干细胞3开始, 基因编辑产生了更多携带与 MN 疾病相关的致病突变的 iPSC 系^.这些生产线是体外疾病建模和药物筛选的有用工具, 前提是有适当的 iPSC 分为 Mn 的方法。这种方法发展的基本原理是为对 MN 疾病感兴趣的科学界提供快速有效的分化协议, 从而产生成熟的功能 Mn。此方法的第一个优点是其执行时间范围。另一个相关的强项来自于任何净化步骤的消除。最后, 该协议可用于生成两个不同的运动神经元群。

生成不同子类型的 mn 的可能性与 MN 疾病的建模特别相关。并非所有的 MN 亚型在 ALS 和 SMA 中都同样脆弱, 不同运动单位的症状出现对预后有很大影响。在 ALS 中, 脊柱出现症状开始于上肢和下肢, 导致死亡约 3-5年 4.相反, 球囊发作, 从颅骨 MNs 的退化开始, 有一个最坏的预后。此外, rna 结合蛋白 FUS 和 TDP-43 突变患者的球状发病百分比明显高于 SOD1 突变⁵患者。几乎所有的替代 mn 分化协议依赖于维甲酸 (ra) 的活性, 这赋予了脊椎字符分化 ipsc^6,7,8。这限制了研究内在因素的可能性, 而内在因素可能对^特定的 mn 亚型^{9、10 具有}保护作用。

与以前在小鼠胚胎干细胞¹¹中的研究一致, 我们最近已经表明, 在人类 Ipsc 中, Ngn2、isl1 和 Lhx3 (nil) 的异位表达诱导了脊柱 mn 的身份, 而 Ngn2 和 isl1 加 phox2a (nip) 则指定了颅内 mn12。因此, 我们开发了一个高效的协议, 导致在12天的周转时间内生产具有功能特性的人类 MNs。这种方法的目的是在很短的时间内, 在不需要纯化的情况下 (例如, 通过流式细胞仪), 获得具有脊柱或颅内身份的 MNs 高度丰富的细胞群。

方案

1. 人类 Ipsc 的维护

1. 基质涂层板的制备
   1. 在4°C 下连夜解冻一个5毫升的基质 (见材料表)。原始的基质库存在不同的库存浓度下, 并根据数据表上显示的稀释系数进行。重要的是要保持小瓶和管冰凉, 以防止过早的胶凝矩阵。在冰上预先冷却的低温管中, 将基质分配到等价物中。在-20°c 时冻结未使用的脂肪。
   2. 将一个放在冰上大约2小时才能解冻。
   3. 用20毫升的冷 dmmmm·f12 将基体的脂肪体稀释在一个50毫升的锥形管中。
   4. 混合好, 将稀释后的基质1毫升放入35毫米盘子 (其他菜品表面面积相当的量)。
   5. 将含有稀释基质的盘子在室温下保存 1小时, 以便涂布。
      请注意:用副封闭密封的菜肴可在4°c 下存放长达2周。
2. 温和细胞离解试剂的库存溶液 (20 毫升) 和1x 工作量的制备(请参见材料表)。
   1. 在 PBS (Ca^{2 +}mgg^{2 +}游离) 中溶解粉末至 10 mgml。
   2. 滤清器通过0.22μm 滤膜进行灭菌。
   3. 准备20个等价物 (每种1毫升), 并储存在-20°c。
   4. 使用前, 在 PBS (Ca^{2 +}mg^{2 +}免费) 中稀释一个 aliquot 至 1 mg/ml (1x 工作的 aliquot)。
      注: 1x 工作的等价物可在4°c 下存放长达2周。
3. 通过人的 Ipsc。
   1. 开始前: 如果在4°c 下储存, 在37°c 的孵化器中预热基质涂层板 20-30, 在室温下预热所需的人体 iPSC 介质 (见材料表)。预热 DMMM/F12。
   2. 吸种培养基。
   3. 用 PBS 冲洗 Ipsc (Ca^{2 +}/mg^{2 +}免费)。
   4. 加入1x 温和离解溶液 (35 毫米盘子 0.5 mL)。在37°c 时孵化, 直到菌落边缘开始从板上分离, 通常为3-5分钟。
   5. 渴望温和的离解解决方案, 注意不要分离 iPSC 菌落。
   6. 用 DMEMM/F12 (35 毫米盘子为2毫升) 清洗细胞, 并小心不分离细胞。重复此步骤一次。
   7. 加入人工 iPSC 介质 (35 毫米盘子为1毫升)。
   8. 用细胞提升器轻轻分离菌落, 转移到15毫升管中。
   9. 用 P1000 移液器向上和向下移液3-4 次, 轻轻打破细胞团块。
   10. 从基质涂层板中吸收上清液。
   11. 将细胞播种在人体 iPSC 培养基的适当培养量中。分割率可以因线而异, 大约为 1:4-1: 8。每天更换介质。

2. NIL 和 NIP 工业 iPSC 线路的生成

1. 细胞转染。
   1. 用 PBS 冲洗细胞 (Ca^{2 +}mg^{2 +}免费)。
   2. 加入细胞离解试剂 (见材料表)(35 毫米盘0.35 毫升), 在37°c 孵育, 直到单个细胞分离 (5-10)。
   3. 使用 P1000 移液器向上和向下移液3-4 次, 轻轻完成细胞分离。
   4. 收集在一个15毫升管, 并添加 PBS (Ca^{2 +}/mL^{2 +}免费) 到10毫升。数一数单元格。
   5. 颗粒 10^{6 个}细胞, 并在100Μl 的缓冲区 r 中重新悬浮 (包括在细胞电穿孔试剂盒中, 请参见材料表)。
   6. 为转染添加质粒 DNA: 4.5 微克的转座子载体 (epB-Bsd-TT-NIL 或 EpB-Bsd-TT-NIL¹²) 和0.5 微克的 piggybac 转座子质^粒13。
   7. 根据制造商的说明和前面描述的3进行电池电穿孔系统的转染 (见材料表), 其参数如下: 1, 200 v 电压、30毫秒宽、1个脉冲。在一个6毫米的基质涂层盘中播种人的 ipsc 介质中的细胞, 并辅以 10μm y-27道理 (rock 抑制剂, 见材料表)。
2. 用抗生素进行选择。
   1. 转染两天后, 在培养基中加入5μgml。
   2. 大多数未转染的细胞将在选择杀菌素48小时内死亡。将细胞保持在闪电分裂中至少 7-10, 以反选择尚未整合基因组中转基因的细胞。
   3. 将稳定转染的细胞作为混合群体, 由具有不同转基因数量和不同整合位点的细胞组成, 或分离单个克隆。
   4. 用 RT-PCR 与 ngn2 的转基因特异性引物 (前进: tatgccccccccccccccccccccaccaccactag) 制备一个额外的盘子, 以检查转质的有效表达, 在诱导后;相反: GAGGGGGGGCTCACT), 如上文所述^.
   5. 在这一阶段, 将新型 NIL-IP-IP-IPSC 生产线的库存冻结在人类 Ipsc 的冷冻介质中 (见材料表)。

3. 电机神经元分化

1. 如所述 (步骤 2.1.1 2.1.3), 将细胞与细胞离解试剂分离。收集离解细胞在一个15毫升管和稀释与5卷 DMM/F12。将细胞颗粒状, 并在人的 iPSC 介质中重新悬浮, 辅以 10μm ROCK 抑制剂。以62,500 细胞的密度计算细胞和种子在基质涂层的菜肴上.
2. 第二天, 用 dmm函数 f12 取代培养基, 辅以1x 稳定的 l-谷氨酰胺类似物、1x 非必需氨基酸 (NEAA) 细胞培养补充剂和0.5倍青霉素-链霉素, 并含有1μgml 多西环素。这被考虑作为区别的第0天。在第1天, 刷新培养基和多西环素。
3. 第2天, 将培养基改为神经碱/b27 培养基 (神经基底培养基, 补充 1x B27, 1x 稳定的 l-谷氨酰胺类似物、1x NEAA 和 0.5倍 penicillin/streptomycin), 含有 5μm DAPT、4μm 0.5X 和 1μgml dox十胺 (见材料表).每天刷新培养基和多西环素, 直到第5天。
4. 第5天: 细胞离解试剂与细胞离解(请参见材料表)。
   1. 用 PBS 冲洗细胞 (Ca^{2 +}mg^{2 +}免费)。
   2. 加入细胞离解试剂 (35 毫米盘0.35 毫升), 在37°c 孵育, 直到整个细胞单层与盘分离。请注意, 单个细胞在孵育过程中不会被分离。
   3. 加入1毫升的 dmemmsf12, 并将细胞收集在一个15毫升的管中。
   4. 使用 P1000 移液器进行10-15 次移液, 向上和向下移液, 轻轻完成细胞分离。
   5. 加入4毫升的 dmmmsf12, 并对细胞进行计数。
   6. 在此阶段, 根据制造商的说明, 将运动神经元祖细胞冻结在细胞冷冻介质中 (见材料表)。
   7. 将细胞颗粒并重新悬浮在神经中 (Neurobasal/B27 培养基, 辅以 20 ng/mL bdnf, 10 ng/mL GDNF 和 200 ngml l-抗坏血酸, 见材料表) 补充 10μm rock 抑制剂。
   8. 在 100, 000 细胞的密度下, 在多鸟-层压膜上或在基质涂层支撑上播种细胞.使用Μ-滑动塑料支架与聚合物盖板 (见材料表) 进行免疫染色分析。
5. 第6天, 用不含 ROCK 抑制剂的新鲜神经元培养基改变培养基。在接下来的几天里, 每3天刷新一次一半的培养基。培养介质必须非常小心地改变, 以防止从表面脱落。

4. 免疫染色分析

1. 细胞固定。用 PBS 冲洗细胞 (用 Ca^{2 +}mg^{2 +}), 在室温下在 pbs 中培养4% 的甲醛 15分钟 (用 ca^{2 +}/mg^{2 +})。
   注意事项:对苯二甲醛有毒, 怀疑会致癌。避免接触皮肤和眼睛, 并处理下的化学烟雾罩。
2. 在室温下使用 PBS (ca^{2 +}mg^{2 +}), 含有 0.1% triton x-100 5分钟。
3. 在室温下在抗体阻断溶液中培养 30分钟 (ABS: 3% BSA 在 PBS 中加 CA^{2 +}/mg^{2 +})。
4. 在室温下与 abs 的原生抗体培养 1小时: 抗 TUJ1 (1xy1000; 兔子) 和抗八角 4 (1x:200; 鼠标) 或抗 chat (抗胆碱乙酰基转移酶; 1: 150; 山羊)。请参阅材料表。
5. 在室温下用适当的驴二级抗体对在 abs 中培养 45分钟: 抗鼠亚历克莎 Flor 647 (1:250)、抗兔子亚历克莎福陆 594 (1:250) 和抗山羊亚历克莎福陆 488 (1:250)。请参阅材料表。
6. 在室温下在 0.4Μgml DAPI 中培养 5分钟, 以标记细胞核。
7. 用安装介质 (见材料表) 安装电池, 以便在荧光显微镜下进行成像。

5. 通过补丁夹具记录的功能表征

1. 准备 Hepes-平衡的外部溶液 (NES) 如下: 140 mM ncl、2.8 mM kcl、2 mM ccl 2、2 mm MGCL 2、10 Mm hepes 和 10 mm 葡萄糖_.将渗透度设置在 290-300 mΩ之间。使用 1N NaOH 将 pH 值调整为 7.3, 并将溶液存放在4°c。
2. 准备内部溶液: 140 mM K-glucoinate, 2 mM 氯化钠, 5 mm Bapta, 2 mM MgCl 2, 10 mMmm hepes, 2 mm mg-atp, 0.3 mm Na-GTP。使用 1M KOH 将 pH 值调整为 7.3, 并检查渗透度是否设置在 290 mΩ左右。将溶液冻结在-20°c 的小等价物中。
3. 在进行实验之前, 将水浴中的 NES 溶液预热至28-30 左右。
4. 拉一些硼硅酸盐微移液器 (ID 0.86 毫米;OD 1.5 mm) 轴承尖端电阻: 5-6 MΩ, 并在安装到移液器支架之前用细胞内溶液填充。
   请注意:记住用共用的银丝记录电极和参考电极在漂白剂中至少 30分钟, 以便在金属丝表面形成均匀的 AgCl 层。
5. 将培养皿转移到记录室, 并让室与 NES 溶液在 1-2 mL/min。让流经在30°c 温度下设置的内联加热器的流量, 以保持溶液的温度。
6. 将电生理记录室置于直立显微镜下。使用膜片钳放大器记录膜电流, 并使用适当的软件获取数据。
7. 打开放大器控制软件, 将信号增益设置为值 1, 将贝塞尔滤波器设置为10千赫。确保贝塞尔滤波器比采样频率低2.5倍。
8. 在记录软件中设置电压夹和电流夹实验的实验协议。
9. 在协议设置中, 勾选插曲式刺激模式, 并将采样频率设置为25千赫。然后, 移动到波形选项卡, 并键入电压或电流步长振幅和长度, 如下所示。
10. 对于电压门控钠电流, 使用15个电压步骤 (每个50毫秒的持续时间)-100 mV 到 + 40 mV (10 mV 增量)。在通过放大器向补丁细胞施加-60 mV 的保持电位后, 运行协议。同样, 电压门控钾电流通过电压步长 (每个250毫秒) 从-30 mV 到 + 50 mV (10 mV 增量), 将记录的电池保持在-40 mV。
11. 为了研究 ipsc 衍生的颅骨和脊柱 MV 的燃烧特性, 在-70 mV 的膜电位下, 在电流夹紧模式下, 夹紧细胞的膜电位为-70 mV, 并使用4个增加振幅的电流脉冲 (每个频率) (从 + 20 pA 到 + 80 pA; 20 p a 增量)。
12. 获取每个电池电压激活电流、诱发燃烧活动和三种无源特性, 如全细胞膜电容 (Cm)、细胞膜电阻 (Rm) 和休息膜电位 (RMP)。

结果

图 1显示了微分方法的示意图描述。人体 Ipsc (WT I线 3) 通过 epB-Bsd-TT-NIL 或 EpB-Bsd-TT-NIL 进行转染, 在选择无菌性细胞线¹²后生成稳定和诱导细胞系, 以下分别称为 Ipsc-nil 和 ipsc-nip。对分化细胞的多能性标记 OCT4 和泛神经元标记 TUJ1 的表达进行了表征。免疫染色分析显示, 在没有 TUJ1 阳性的情况下, 在第0天, OCT4 在所有细胞中的表达均匀 (图 2a)。在第3天, 我们观察到 OCT4 阳性细胞的数量大幅减少, 这反映在分化 Ipsc 的子集中的 TUJ1 表达 (图 2b)。第5天, 在人群中没有观察到 OCT4 的表达, 显示 TUJ1 的表达一致, 并获得了神经元形态 (

讨论

由于谱系特异性转录因子的异位表达, 该协议可以有效地将人的 Ipsc 转化为脊柱和颅内运动神经元。这些转基因是由多西环素诱导和稳定地集成在基因组中感谢一个 piggyBac 转座子基载体。在混合人群中, 一个或多个携带 Bac 载体的副本将随机整合到单个细胞的基因组中, 从而增加基因组完整性改变的风险。此外, 随着时间的推移, 可能会逐步选择 iPSC 亚克隆, 可能会对分化以及疾病和控制细胞系的比较分析产生影响。总之, 使用该协议获得的 ipsc 派生的 Ms 将不适合再生医学。然而, 我们的方法可能是特别有用的体外运动神经元疾病的建模。主要的强项表现为极简单的培养条件、MN 转换的速度、ipsc 衍生 Mn 的高度成熟以及获得脊椎和颅骨 Mn 的可能性, 如先前所示:分析特定标记基因的表达¹²。该协议的鲁棒性表现在其重现性上。到目前为止, 我们已经成功地应用该协议超过30倍的脊柱和颅 MN 生成, 评估的结果, 通过标记和/或功能分析。我们已经成功地保持了长达两个月的运动神经元培养, 没有明显的可行性下降。此外, 一旦获得稳定转染 iPSC 线路, 每个实验都可以通过多西环素诱导开始,...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-Bapta	Sigma-Aldrich	A4926-1G	电生理溶液化学品
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	细胞解离试剂
抗 CHAT	EMD Millipore	AB144P	抗胆碱乙酰转移酶。用于免疫染色测定的一抗。RRID：AB_2079751;批号：2971003
抗山羊 Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	用于单荧光测定的二抗。RRID：AB_2534102;批号：1915848
抗小鼠 Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A31571	用于单荧光测定的二抗。RRID：AB_162542;批号：1757130
抗 Oct4	BD Biosciences	611202	用于免疫染色测定的一抗。RRID：AB_398736;批号：5233722
抗 Phox2b	抗体 Santa Cruz Biotechnology， Inc.	sc-376997	用于免疫染色测定的一抗。批号：E0117
抗兔 Alexa Fluor 594	免疫科学	IS-20152-1	用于抗
TUJ1	Sigma-Aldrich	T2200	用于免疫染色测定的一抗。RRID： AB_262133
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	用于神经元细胞维持的无血清补充剂
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	细胞冷冻培养基，此处用于运动神经元祖细胞
BDNF	PreproTech	450-02	脑源性神经营养因子
杀稻瘟菌素	Sigma-Aldrich	203350	抑制原核生物和真核生物中蛋白质合成的核苷抗生素
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	牛血清白蛋白。封闭剂，可防止免疫染色测定中抗体的非特异性结合
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	用于电生理溶液的化学品
Clampex 10 软件	Molecular Devices	Clampex 10	膜电流记录系统
康宁基质胶 hESC 认证 基质	康宁	354277	来自 Engelbreth-Holm-Swarm （EHS） 小鼠肉瘤的重构基底膜制备物。用于 iPSC 与塑料和玻璃载体的粘附
CRYOSTEM ACF 冻存培养基	生物工业	05-710-1E	人 iPSC 冻存培养基
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5146	电生理溶液化学品
DAPI粉末	罗氏	10236276001	4′，6-二脒基-2-苯基吲哚。与腺嘌呤结合的荧光染色剂–DNA 中富含胸腺嘧啶的区域，用于单荧光测定中的细胞核染色
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	γ 分泌酶抑制剂
分散酶	Gibco	17105-041	用于温和解离人 iPSC
的试剂 DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	用于细胞培养的基础培养基
多西环素	Sigma-Aldrich	D9891-1G	用于诱导 epB-Bsd-TT-NIL 和 epB-Bsd-TT-NIP 载体的转基因表达
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	商业人 iPSC 细胞系
E.Z.N.A 总 RNA 试剂盒	Omega bio-tek	R6834-02	试剂盒，用于从培养的真核细胞中总提取
	PreproTech	450-10	神经胶质衍生神经营养因子
Gibco 游离型 hiPSC 细胞系	Thermo Fisher Scientific	A18945	商业人 iPSC 细胞系
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	L-谷氨酰胺的替代品，稳定性更高。改善细胞健康。
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	电生理学溶液
用于 RT-qPCR 的 iScript 逆转录超混合液	Bio-Rad	1708841	试剂盒，用于使用实时 qPCR 进行基因表达分析
iTaqTM 通用 SYBR Green 超混合液	生物辐射	172-5121	即用型反应预混液，针对任何实时荧光定量 PCR 仪器上的基于染料的定量 PCR （qPCR） 进行了优化
K-葡萄糖酸盐	Sigma-Aldrich	G4500	用于电生理溶液的化学品
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	用于电生理溶液的化学品
L-抗坏血酸	LKT Laboratories	A7210	在细胞培养中用作抗氧化剂
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	11243217001	促进神经细胞的体外附着和生长
激光扫描共聚焦显微镜	奥林巴斯	iX83 FluoView1200	共聚焦显微镜，用于采集免疫染色图像
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	用于电生理溶液的化学品
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	用于电生理溶液
的化学品 封固剂	Ibidi	50001	用于共聚焦显微镜和免疫荧光测定的封片剂
多钳位膜片钳放大器	Molecular Devices	700B	膜电流记录系统
Na-GTP	Sigma-Aldrich	G8877	电生理溶液用化学品
NaCl	Sigma-Aldrich	71376	电生理溶液用化学品
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	必需氨基酸。用作细胞培养基的补充剂，以增加细胞生长和活力。
霓虹灯 100 μL 试剂盒	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell 电穿孔试剂盒
Neon 转染系统	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell 电穿孔系统
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher Scientific	21103049	基础培养基，设计用于神经元细胞群的长期维持和成熟，无需星形胶质细胞饲养层
NutriStem-XF/FF	生物工业	05-100-1A	人 iPSC 培养基
多聚甲醛	电子显微镜科学	157-8	用于免疫染色测定中的细胞固定
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水，含钙，含镁
PBS Ca2+/Mg2+ 不含	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水，不含钙，不含镁
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	青霉素/链霉素溶液，用于防止细菌污染细胞培养物。
聚鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P4957	在体外促进神经细胞的附着和生长
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	血管内皮生长因子受体 2 （VEGFR-2） 的选择性抑制剂 Triton
X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-（1,1,3,3-四甲基丁基）苯基-聚乙二醇， t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇 叔辛基苯醚。用于免疫染色测定中的细胞透化
正置显微镜	奥林巴斯	BX51VI	配备 CoolSnap Myo 相机的电生理记录显微镜
Y-27632 （ROCK 抑制剂）	恩佐生命科学	ALX-270-333-M005	Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶 （ROCK） 的细胞渗透性选择性抑制剂。提高 iPSC 存活率
μ-玻片 8 孔	同比迪	80826	支持 high–固定细胞的末端显微镜分析