利用PiggyBac载体将人诱导性多能干细胞（iPSCs）转化为功能性脊髓和颅脑运动神经元

摘要

本方案通过可诱导的piggyBac载体异位表达转录因子，可快速高效地将诱导性多能干细胞转化为具有脊髓或颅脑特征的运动神经元。

摘要

本文介绍一种从人诱导性多能干细胞（iPSCs）获得功能性脊髓和颅脑运动神经元的方法。通过异位表达特定的转录因子组合模块，即可实现向运动神经元的直接转化，这些模块分别为 Ngn2、Isl1 和 Lhx3（NIL）或 Ngn2、Isl1 和 Phox2a（NIP）。NIL 和 NIP 分别决定脊髓和颅脑运动神经元的身份特征。本方案首先构建经改造的 iPSC 细胞系，使 NIL 或 NIP 模块通过 piggyBac 转座子载体稳定整合至基因组中。随后通过多西环素诱导转基因表达，可在 5 天内将 iPSC 转化为运动神经元前体细胞。再经过 7 天的进一步成熟培养，即可获得高度均一的脊髓或颅脑运动神经元群体。与以往方案相比，本方法具有多项优势：操作极为快速简便；无需病毒转染或后续的运动神经元分离步骤；能够生成不同亚型的运动神经元（脊髓型与颅脑型），且成熟度显著，表现为可产生成簇的动作电位。此外，可在无需从混合细胞群中纯化的条件下获得大量运动神经元。由 iPSC 分化而来的脊髓和颅脑运动神经元可用于肌萎缩侧索硬化症及其他运动神经元变性疾病的体外建模研究。均一的运动神经元群体可能成为细胞类型特异性药物筛选的重要资源。

引言

运动神经元（MN）的变性在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA）等人类疾病中起着致病作用。建立能够重现人类运动神经元复杂性的合适体外细胞模型系统，是开发新型治疗策略的重要一步。目前，已从多种运动神经元疾病患者中成功获得具有强大多向分化潜能的诱导性多能干细胞（iPSCs）^1，2。此外，通过基因编辑技术，研究人员已从对照的"健康"多能干细胞出发，构建了携带与运动神经元疾病相关致病突变的iPSC细胞系³。这些细胞系是体外疾病建模和药物筛选的有力工具，前提是具备合适的将iPSC定向分化为运动神经元的方法。本方法的开发旨在为关注运动神经元疾病研究的科学界提供一种快速且高效的分化方案，以获得成熟且具有功能的运动神经元。该方法的首要优势在于其较短的操作时间。另一重要优势在于无需任何细胞纯化步骤。最后，该方案可用于生成两种不同的运动神经元群体。

生成不同亚型运动神经元（MNs）的可能性对于运动神经元疾病的建模尤为重要。在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA）中，并非所有运动神经元亚型的易损性均相同，不同运动单位症状的起始情况极大地影响着预后。在ALS中，若症状起始于四肢（脊髓型），患者通常在约3-5 年内死亡⁴。相反，若为延髓起始型（....

方案

1. 人iPSC的维持

1. 基质包被培养板的制备
   1. 将一管5 mL的基质（见材料表）在4 °C下过夜解冻。原始基质库存浓度各不相同，需根据每批次数据表上标明的稀释倍数进行分装。为防止基质提前凝胶化，操作过程中必须始终保持管子和离心管处于冰上低温状态。在预冷的冻存管中于冰上分装基质。未使用的分装样品应于-20 °C冷冻保存。
   2. 取一份分装样品置于冰上约2小时，使其缓慢解冻。
   3. 在50 mL锥形离心管中，用20 mL冷的DMEM/F12稀释该份基质。
   4. 充分混匀后，将1 mL稀释后的基质加入35 mm培养皿中（其他规格培养皿按相同表面积比例加入相应体积）。
   5. 将含有稀释基质的培养皿在室温放置1小时，以完成包被。
      注意：用封口膜密封的培养皿可在4 °C保存最多2周。
2. 温和细胞解离试剂的储存液（20 mL）及1x工作液分装的制备（见材料表）。
   1. 将粉末溶于PBS（无Ca²⁺/Mg²⁺）中，配制成10 mg/mL的溶液。
   2. 使用0.22 μm滤膜过滤除菌。
   3. 分装成20份（每份1 mL）....

结果

分化方法的示意图见图1。将人iPSCs（WT I系³）转染epB-Bsd-TT-NIL或epB-Bsd-TT-NIP，经杀稻瘟菌素筛选后获得稳定且可诱导的细胞系¹²，下文分别称为iPSC-NIL和iPSC-NIP。对分化细胞进行多能性标志物OCT4和泛神经元标志物TUJ1的表达分析。免疫染色结果显示，在第0天，所有细胞均表达OCT4，而无TUJ1阳性信号（图2A）。第3天时，OCT4阳性细胞数量显著减少，同时部分正在分化的iPSCs开始表达TUJ1（图2B）。至第5天，细胞群体中已检测不到OCT4表达，而TUJ1表达一致阳性，并呈现出神经元形态（图2C）。随后将运动神经元前体细胞解离并重新接种，以进一步成熟.......

讨论

该方案通过异位表达谱系特异性转录因子，可高效地将人iPSCs转化为脊髓和颅脑运动神经元。这些转基因通过多西环素诱导，并借助基于piggyBac转座子的载体稳定整合至基因组中。在混合细胞群体中，piggyBac载体的一个或多个拷贝会随机插入单个细胞的基因组，从而增加基因组完整性受损的风险。此外，随着时间推移，可能逐渐发生iPSC亚克隆的选择性扩增，进而影响分化过程以及疾病组与对照组细胞系之间的比较分析。因此，采用本方案获得的iPSC来源的运动神经元不适合用于再生医学。然而，该方法在体外运动神经元疾病建模方面可能具有重要应用价值。本方法的主要优势包括培养条件极为简化、运动神经元转化速度快、iPSC来源的运动神经元成熟度高，以及能够同时获得脊髓和颅脑运动神经元，后者已通过特异性标记基因表达分析得到证实¹²该方案的稳健性通过其可重复性得到验证。迄今为止，我们已成功应用该方案超过30次，用于脊髓和/或颅脑运动神经元的生成，并通过标志物分析和/或功能分析评估了实验结果。我们已成功将运动神经元培养物维持长达两个月，未见明显活力下降。此外，一旦获得稳定转导的iPSC细胞系，每次实验均可通过多西环素诱导启动.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-Bapta	Sigma-Aldrich	A4926-1G	电生理溶液用化学品
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	细胞解离试剂
抗-CHAT	EMD Millipore	AB144P	抗胆碱乙酰转移酶。免疫染色实验中使用的一抗。RRID: AB_2079751；批号：2971003
抗山羊 Alexa Fluor 488	赛默飞世尔科技	A11055	用于免疫荧光检测的二抗。RRID: AB_2534102；批号：1915848
抗小鼠 Alexa Fluor 647	赛默飞世尔科技	A31571	用于免疫荧光检测的二抗。RRID: AB_162542；批号：1757130
抗Oct4	BD 生物科学	611202	免疫染色实验中使用的一抗。RRID: AB_398736；批号：5233722
抗-Phox2b	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-376997	免疫染色实验中使用的一抗。批号：E0117
抗兔 Alexa Fluor 594	免疫学科学	IS-20152-1	用于免疫荧光检测的二抗
抗-TUJ1	Sigma-Aldrich	T2200	免疫染色实验中使用的一抗。RRID: AB_262133
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	用于神经元细胞维持的无血清添加剂
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	用于运动神经元前体细胞的细胞冻存液
BDNF	PreproTech	450-02	脑源性神经营养因子
杀稻瘟菌素	Sigma-Aldrich	203350	抑制原核生物和真核生物蛋白质合成的核苷类抗生素
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	牛血清白蛋白。用于免疫染色实验中防止抗体非特异性结合的封闭剂
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	电生理溶液用化学品
Clampex 10 软件	Molecular Devices	Clampex 10	膜电流记录系统
Corning Matrigel hESC-合格基质	康宁	354277	从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中重建的基底膜基质。用于诱导多能干细胞（iPSC）在塑料和玻璃载体上的黏附
CRYOSTEM ACF 冻存培养基	生物工业公司	05-710-1E	人诱导多能干细胞冻存培养基
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5146	电生理溶液用化学品
DAPI 粉末	罗氏	10236276001	4′，6-二脒基-2-苯基吲哚。一种可与腺嘌呤结合的荧光染料–DNA中富含胸腺嘧啶的区域，用于免疫荧光检测中的细胞核染色
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	γ-分泌酶抑制剂
Dispase	Gibco	17105-041	用于温和解离人iPSC的试剂
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	细胞培养基础培养基
多西环素	Sigma-Aldrich	D9891-1G	用于诱导 epB-Bsd-TT-NIL 和 epB-Bsd-TT-NIP 载体中转基因的表达
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	商用人类iPSC细胞系
E.Z.N.A 总RNA试剂盒	Omega bio-tek	R6834-02	用于培养的真核细胞总RNA提取的试剂盒
GDNF	PreproTech	450-10	胶质细胞源性神经营养因子
Gibco 附加体质粒 hiPSC 细胞系	赛默飞世尔科技	A18945	商用人类iPSC细胞系
Glutamax	赛默飞世尔科技	35050038	一种比L-谷氨酰胺更稳定的替代物，可改善细胞健康。
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	电生理溶液用化学品
用于RT-qPCR的iScript反转录超级混合液	伯乐（Bio-Rad）	1708841	用于实时定量 PCR 的基因表达分析试剂盒
iTaq™ Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121	即用型反应预混液，专为基于染料的定量PCR（qPCR）优化，适用于任何实时PCR仪器
K-葡萄糖酸盐	Sigma-Aldrich	G4500	电生理溶液用化学品
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	电生理溶液用化学品
L-抗坏血酸	LKT Laboratories	A7210	在细胞培养中用作抗氧化剂
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	11243217001	促进神经细胞在体外的贴附和生长
激光扫描共聚焦显微镜	Olympus	iX83 FluoView1200	用于免疫染色图像采集的共聚焦显微镜
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	电生理溶液用化学品
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	电生理溶液用化学品
封片剂	Ibidi	50001	用于共聚焦显微镜和免疫荧光实验的封片液
多钳制膜片钳放大器	Molecular Devices	700B	膜电流记录系统
Na-GTP	Sigma-Aldrich	G8877	电生理溶液用化学品
NaCl	Sigma-Aldrich	71376	电生理溶液用化学品
非必需氨基酸	赛默飞世尔科技	11140035	非必需氨基酸。用作细胞培养基的补充剂，以促进细胞生长并提高细胞存活率。
Neon 100 μL 型试剂盒	赛默飞世尔科技	MPK10096	细胞电穿孔试剂盒
Neon 转染系统	赛默飞世尔科技	MPK5000	细胞电穿孔系统
Neurobasal 培养基	赛默飞世尔科技	21103049	专为长期维持和成熟神经元细胞群体而设计的基础培养基，无需使用星形胶质细胞饲养层
NutriStem-XF/FF	生物工业公司	05-100-1A	人iPSC培养基
多聚甲醛	电子显微镜科学公司	157-8	用于免疫染色实验中的细胞固定
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	含钙、含镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液
PBS Ca2+/毫克2+ 自由	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	不含钙、不含镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	用于防止细胞培养中细菌污染的青霉素/链霉素溶液。
多聚鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P4957	促进神经细胞在体外的贴附和生长
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）选择性抑制剂
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇， 辛基苯基聚乙二醇，聚乙二醇 叔辛基苯基醚。用于免疫染色实验中的细胞通透化
直立显微镜	Olympus	BX51VI	用于电生理记录的显微镜，配备 CoolSnap Myo 相机
Y-27632  （ROCK抑制剂）	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	细胞通透性Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）选择性抑制剂。可提高诱导多能干细胞（iPSC）存活率
μ-第8孔	Ibidi	80826	高支持–固定细胞的显微分析