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方法文章

利用PiggyBac载体将人诱导性多能干细胞（iPSCs）转化为功能性脊髓和颅脑运动神经元

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DOI：

10.3791/59321

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2019年5月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology Charles Darwin, Sapienza University of Rome, Italy, 2Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, Italy, 3Laboratory of Stem Cell biology and Molecular Embryology, The Rockefeller University, USA, 4Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, Italy

本文内容

摘要

本方案通过可诱导的piggyBac载体异位表达转录因子，可快速高效地将诱导性多能干细胞转化为具有脊髓或颅脑特征的运动神经元。

摘要

本文介绍一种从人诱导性多能干细胞（iPSCs）获得功能性脊髓和颅脑运动神经元的方法。通过异位表达特定的转录因子组合模块，即可实现向运动神经元的直接转化，这些模块分别为 Ngn2、Isl1 和 Lhx3（NIL）或 Ngn2、Isl1 和 Phox2a（NIP）。NIL 和 NIP 分别决定脊髓和颅脑运动神经元的身份特征。本方案首先构建经改造的 iPSC 细胞系，使 NIL 或 NIP 模块通过 piggyBac 转座子载体稳定整合至基因组中。随后通过多西环素诱导转基因表达，可在 5 天内将 iPSC 转化为运动神经元前体细胞。再经过 7 天的进一步成熟培养，即可获得高度均一的脊髓或颅脑运动神经元群体。与以往方案相比，本方法具有多项优势：操作极为快速简便；无需病毒转染或后续的运动神经元分离步骤；能够生成不同亚型的运动神经元（脊髓型与颅脑型），且成熟度显著，表现为可产生成簇的动作电位。此外，可在无需从混合细胞群中纯化的条件下获得大量运动神经元。由 iPSC 分化而来的脊髓和颅脑运动神经元可用于肌萎缩侧索硬化症及其他运动神经元变性疾病的体外建模研究。均一的运动神经元群体可能成为细胞类型特异性药物筛选的重要资源。

引言

运动神经元（MN）的变性在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA）等人类疾病中起着致病作用。建立能够重现人类运动神经元复杂性的合适体外细胞模型系统，是开发新型治疗策略的重要一步。目前，已从多种运动神经元疾病患者中成功获得具有强大多向分化潜能的诱导性多能干细胞（iPSCs）1，2。此外，通过基因编辑技术，研究人员已从对照的"健康"多能干细胞出发，构建了携带与运动神经元疾病相关致病突变的iPSC细胞系3。这些细胞系是体外疾病建模和药物筛选的有力工具，前提是具备合适的将iPSC定向分化为运动神经元的方法。本方法的开发旨在为关注运动神经元疾病研究的科学界提供一种快速且高效的分化方案，以获得成熟且具有功能的运动神经元。该方法的首要优势在于其较短的操作时间。另一重要优势在于无需任何细胞纯化步骤。最后，该方案可用于生成两种不同的运动神经元群体。

生成不同亚型运动神经元（MNs）的可能性对于运动神经元疾病的建模尤为重要。在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA）中，并非所有运动神经元亚型的易损性均相同，不同运动单位症状的起始情况极大地影响着预后。在ALS中，若症状起始于四肢（脊髓型），患者通常在约3-5 年内死亡4。相反，若为延髓起始型（起始于颅脑运动神经元的退化），其预后更差。此外，携带RNA结合蛋白FUS和TDP-43突变的患者中，延髓起始型所占比例显著高于SOD1突变个体5。几乎所有其他运动神经元定向分化方案都依赖于视黄酸（RA）的作用，该因子赋予分化中的诱导多能干细胞（iPSCs）脊髓特性6,7,8。这限制了研究某些内在保护性因素的可能性，而这些因素可能在特定运动神经元亚型中发挥保护作用9,10。

与之前在小鼠胚胎干细胞中的研究一致11，我们近期研究表明，在人诱导多能干细胞（iPSCs）中异位表达 Ngn2、Isl1 和 Lhx3（NIL）可诱导产生脊髓运动神经元（MN）特性，而 Ngn2 和 Isl1 联合 Phox2a（NIP）则可指定脑神经运动神经元12。因此，我们开发了一种高效方案，可在12天内快速生成具有功能特性的人大运动神经元。该方法的目的是在短时间内获得高度富集的、具有脊髓或颅脑特性的运动神经元细胞群，且无需进行纯化步骤（例如通过流式细胞分选术FACS）。

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方案

1. 人iPSC的维持

  1. 基质包被培养板的制备
    1. 将一管5 mL的基质（见材料表）在4 °C下过夜解冻。原始基质库存浓度各不相同，需根据每批次数据表上标明的稀释倍数进行分装。为防止基质提前凝胶化，操作过程中必须始终保持管子和离心管处于冰上低温状态。在预冷的冻存管中于冰上分装基质。未使用的分装样品应于-20 °C冷冻保存。
    2. 取一份分装样品置于冰上约2小时，使其缓慢解冻。
    3. 在50 mL锥形离心管中，用20 mL冷的DMEM/F12稀释该份基质。
    4. 充分混匀后，将1 mL稀释后的基质加入35 mm培养皿中（其他规格培养皿按相同表面积比例加入相应体积）。
    5. 将含有稀释基质的培养皿在室温放置1小时，以完成包被。
      注意：用封口膜密封的培养皿可在4 °C保存最多2周。
  2. 温和细胞解离试剂的储存液（20 mL）及1x工作液分装的制备（见材料表）。
    1. 将粉末溶于PBS（无Ca2+/Mg2+）中，配制成10 mg/mL的溶液。
    2. 使用0.22 μm滤膜过滤除菌。
    3. 分装成20份（每份1 mL），于-20 °C保存。
    4. 使用前，取一份分装样品用PBS（无Ca2+/Mg2+）稀释至1 mg/mL（即1x工作液）。
      注意：1x工作液可在4 °C保存最多2周。
  3. 人iPSC的传代。
    1. 开始前准备：若基质包被培养板储存在4 °C，需将其在37 °C培养箱中预热20–30分钟。将所需量的人iPSC培养基（见材料表）在室温预热。同时预热DMEM/F12。
    2. 吸除培养基。
    3. 用PBS（无Ca2+/Mg2+）冲洗iPSC。
    4. 加入1x温和解离溶液（35 mm培养皿加0.5 mL），在37 °C孵育，直至克隆边缘开始从培养皿脱离，通常为3–5分钟。
    5. 小心吸除温和解离溶液，注意避免将iPSC克隆完全脱离。
    6. 用DMEM/F12（35 mm培养皿加2 mL）洗涤细胞一次，并小心吸除，避免细胞脱落。重复此步骤一次。
    7. 加入人iPSC培养基（35 mm培养皿加1 mL）。
    8. 用细胞刮轻轻将克隆刮下，并转移至15 mL离心管中。
    9. 用P1000移液器轻柔吹打3–4次，使细胞团块分散。
    10. 吸除基质包被培养板中的上清液。
    11. 将细胞以适当体积的人iPSC培养基重新接种。传代比例因细胞系而异，通常为1:4至1:8。每日更换培养基。

2. 生成可诱导的NIL和NIP iPSC细胞系

  1. 细胞转染。
    1. 用PBS（无Ca2+/Mg2+）清洗细胞。
    2. 加入细胞解离试剂（见材料表）（35 mm培养皿加0.35 mL），在37 °C孵育至细胞完全分散为单细胞（5–10分钟）。
    3. 用P1000移液器轻轻吹打3–4次，完成细胞的彻底分离。
    4. 将细胞收集至15 mL离心管中，加入PBS（无Ca2+/Mg2+）至10 mL，计数细胞。
    5. 离心收集106个细胞，重悬于100 μL缓冲液R中（包含在细胞电穿孔试剂盒中，见材料表）。
    6. 加入用于转染的质粒DNA：4.5 μg转座载体（epB-Bsd-TT-NIL或epB-Bsd-TT-NIP12）和0.5 μg piggyBac转座酶质粒13。
    7. 使用细胞电穿孔系统（见材料表）进行转染，按照制造商说明书及先前描述的方法3设置以下参数：电压1,200 V，脉冲宽度30 ms，单次脉冲。将细胞接种于添加了10 μM Y-27632（ROCK抑制剂，见材料表）的人iPSC培养基中，培养皿为6 mm基质包被皿。
  2. 抗生素筛选。
    1. 转染后两天，向培养基中加入5 μg/mL杀稻瘟菌素（blasticidin）。
    2. 大多数未转染的细胞将在杀稻瘟菌素筛选48小时内死亡。持续使用杀稻瘟菌素至少7–10天，以淘汰未将转基因整合入基因组的细胞。
    3. 将稳定转染的细胞作为混合群体维持培养（包含不同数量转基因及不同整合位点的细胞），或分离单克隆细胞株。
    4. 准备额外的培养皿，通过RT-PCR检测转基因在1 μg/mL多西环素诱导下的有效表达情况，使用针对Ngn2的特异性引物（正向：TATGCACCTCACCTCCCCATAG；反向：GAAGGGAGGAGGGCTCGACT），方法如前所述12。
    5. 在此阶段，将新构建的NIL-iPSC和NIP-iPSC细胞系使用人iPSC冻存液（见材料表）冻存备用。

3. 运动神经元分化

  1. 按照前述方法（步骤 2.1.1.–2.1.3.）使用细胞解离试剂解离细胞。将解离后的细胞收集至 15 mL 离心管中，并用 5 倍体积的 DMEM/F12 稀释。离心收集细胞，重悬于添加了 10 μM ROCK 抑制剂的人源 iPSC 培养基中。计数细胞后，以 62,500 个细胞/cm2 的密度接种于基质包被的培养皿中。
  2. 次日，更换为 DMEM/F12 培养基，其中添加 1× 稳定型 L-谷氨酰胺类似物、1× 非必需氨基酸（NEAA）细胞培养添加剂和 0.5× 青霉素/链霉素，并含有 1 μg/mL 多西环素。此日记为分化第 0 天。在第 1 天更换培养基和多西环素。
  3. 第 2 天，更换为 Neurobasal/B27 培养基（Neurobasal 培养基添加 1× B27、1× 稳定型 L-谷氨酰胺类似物、1× NEAA 和 0.5× 青霉素/链霉素），并加入 5 μM DAPT、4 μM SU5402 和 1 μg/mL 多西环素（见材料表）。此后每天更换培养基和多西环素，直至第 5 天。
  4. 第 5 天：使用细胞解离试剂进行细胞解离（见材料表）。
    1. 用不含 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 洗涤细胞。
    2. 加入细胞解离试剂（35 mm 培养皿加 0.35 mL），于 37 °C 孵育，直至整个细胞单层从培养皿脱离。注意：孵育过程中不会形成单细胞悬液。
    3. 加入 1 mL DMEM/F12，将细胞收集至 15 mL 离心管中。
    4. 使用 P1000 移液器轻柔吹打 10–15 次，完成细胞的进一步解离。
    5. 加入 4 mL DMEM/F12，计数细胞。
    6. 此阶段可根据制造商说明，将运动神经元前体细胞冻存于细胞冻存液中（见材料表）。
    7. 离心收集细胞，重悬于神经元培养基（Neurobasal/B27 培养基添加 20 ng/mL BDNF、10 ng/mL GDNF 和 200 ng/mL L-抗坏血酸，见材料表）中，并补充 10 μM ROCK 抑制剂。
    8. 以 100,000 个细胞/cm2 的密度将细胞接种于多聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被或替代性基质包被的培养表面。如需进行免疫染色分析，建议使用带有聚合物盖玻片的 µ-Slide 塑料培养载片（见材料表）。
  5. 第 6 天，更换为新鲜的不含 ROCK 抑制剂的神经元培养基。此后每 3 天更换一半培养基。更换培养基时必须格外小心，以防止细胞从培养表面脱落。

4. 免疫染色分析

  1. 细胞固定。用 PBS（含 Ca2+/Mg2+）清洗细胞，然后在室温下用含 Ca2+/Mg2+ 的 4% 多聚甲醛溶液孵育 15 分钟。
    注意：多聚甲醛具有毒性，且可能致癌。避免接触皮肤和眼睛，应在化学通风橱中操作。
  2. 在室温下用含 0.1% Triton X-100 的 PBS（含 Ca2+/Mg2+）处理 5 分钟以进行透化。
  3. 在抗体封闭液（ABS：含 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 中含 3% BSA）中室温孵育 30 分钟。
  4. 在抗体封闭液（ABS）中加入一抗，室温孵育 1 小时：抗 TUJ1 抗体（1:1000；兔源）和抗 Oct4 抗体（1:200；小鼠源）或抗 CHAT 抗体（抗胆碱乙酰转移酶；1:150；山羊源）。参见 材料表。
  5. 在抗体封闭液（ABS）中加入适当的驴源二抗组合，室温孵育 45 分钟：抗小鼠 Alexa Fluor 647（1:250）、抗兔 Alexa Fluor 594（1:250）和抗山羊 Alexa Fluor 488（1:250）。参见 材料表。
  6. 加入 0.4 μg/mL 的 DAPI，室温孵育 5 分钟，以标记细胞核。
  7. 使用封片剂（见 材料表）封片，用于荧光显微镜成像。

5. 通过膜片钳记录进行功能表征

  1. 配制HEPES平衡的外部溶液（NES），配方如下：140 mM NaCl、2.8 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM HEPES 和 10 mM 葡萄糖。将渗透压调节至290–300 mΩ之间，用1N NaOH将pH值调至7.3，并将溶液储存在4 °C。
  2. 配制内部溶液：140 mM K-葡萄糖酸盐、2 mM NaCl、5 mM BAPTA、2 mM MgCl2、10 mM HEPES、2 mM Mg-ATP、0.3 mM Na-GTP。用1M KOH将pH值调至7.3，并确认渗透压约为290 mΩ。将溶液分装后于-20 °C冷冻保存。
  3. 实验开始前，将NES溶液在水浴中预热至约28–30 °C。
  4. 拉制若干硼硅酸盐玻璃微电极（内径0.86 mm，外径1.5 mm），使其尖端电阻为5–6 MΩ，并在装入电极夹持器前用细胞内溶液灌注电极。
    注意：请务必在漂白剂中对记录电极和参比电极的银丝进行氯化处理至少30分钟，以在金属丝表面形成均匀的AgCl层。
  5. 将培养皿转移至记录室，并以1–2 mL/min的速度向记录室中持续灌流NES溶液。让液体流经一个设定温度为30 °C的在线加热器，以维持溶液温度。
  6. 将电生理记录室置于直立显微镜下，使用膜片钳放大器记录膜电流，并通过适当的软件采集数据。
  7. 打开放大器控制软件，将信号增益设为1，贝塞尔滤波器设为10 kHz。确保贝塞尔滤波器的截止频率为采样频率的2.5倍以下。
  8. 在记录软件中设置电压钳和电流钳实验的实验程序。
  9. 在程序设置中，选择“间歇刺激模式”，并将采样频率设为25 kHz。然后切换到波形选项卡，输入电压或电流阶跃的幅度和持续时间，如下所述。
  10. 对于电压门控钠电流，使用15个电压阶跃（每个持续50 ms），从-100 mV逐步增加至+40 mV（步长10 mV）。通过放大器将被记录细胞钳制在-60 mV的保持电位后运行该程序。类似地，电压门控钾电流通过电压阶跃（每个持续250 ms）从-30 mV至+50 mV（步长10 mV）诱发，同时将记录细胞保持在-40 mV的膜电位。
  11. 为研究诱导多能干细胞（iPSC）来源的颅部和脊髓运动神经元的放电特性，将细胞在电流钳模式下钳制在-70 mV的膜电位，并施加4个持续1秒、幅度递增的电流脉冲（从+20 pA至+80 pA，步长20 pA）。
  12. 对每个细胞采集电压激活电流、诱发的放电活动，以及三个被动电生理特性：全细胞电容（Cm）、细胞膜电阻（Rm）和静息膜电位（RMP）。

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结果

分化方法的示意图见图1。将人iPSCs（WT I系3）转染epB-Bsd-TT-NIL或epB-Bsd-TT-NIP，经杀稻瘟菌素筛选后获得稳定且可诱导的细胞系12，下文分别称为iPSC-NIL和iPSC-NIP。对分化细胞进行多能性标志物OCT4和泛神经元标志物TUJ1的表达分析。免疫染色结果显示，在第0天，所有细胞均表达OCT4，而无TUJ1阳性信号（图2A）。第3天时，OCT4阳性细胞数量显著减少，同时部分正在分化的iPSCs开始表达TUJ1（图2B）。至第5天，细胞群体中已检测不到OCT4表达，而TUJ1表达一致阳性，并呈现出神经元形态（图2C）。随后将运动神经元前体细胞解离并重新接种，以进一步成熟...

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讨论

该方案通过异位表达谱系特异性转录因子，可高效地将人iPSCs转化为脊髓和颅脑运动神经元。这些转基因通过多西环素诱导，并借助基于piggyBac转座子的载体稳定整合至基因组中。在混合细胞群体中，piggyBac载体的一个或多个拷贝会随机插入单个细胞的基因组，从而增加基因组完整性受损的风险。此外，随着时间推移，可能逐渐发生iPSC亚克隆的选择性扩增，进而影响分化过程以及疾病组与对照组细胞系之间的比较分析。因此，采用本方案获得的iPSC来源的运动神经元不适合用于再生医学。然而，该方法在体外运动神经元疾病建模方面可能具有重要应用价值。本方法的主要优势包括培养条件极为简化、运动神经元转化速度快、iPSC来源的运动神经元成熟度高，以及能够同时获得脊髓和颅脑运动神经元，后者已通过特异性标记基因表达分析得到证实12该方案的稳健性通过其可重复性得到验证。迄今为止，我们已成功应用该方案超过30次，用于脊髓和/或颅脑运动神经元的生成，并通过标志物分析和/或功能分析评估了实验结果。我们已成功将运动神经元培养物维持长达两个月，未见明显活力下降。此外，一旦获得稳定转导的iPSC细胞系，每次实验均可通过多西环素诱导启动...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

作者感谢意大利技术研究院生命纳米科学中心成像平台提供的支持与技术指导。我们感谢生命纳米科学中心成员的有益讨论。本研究部分得到了AriSLA基金会（2016年试点项目资助）的资助。 "StressFUS") 至 AR。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-BaptaSigma-AldrichA4926-1G电生理溶液用化学品
AccutaseSigma-AldrichA6964-100ML 细胞解离试剂
抗-CHATEMD Millipore AB144P抗胆碱乙酰转移酶。免疫染色实验中使用的一抗。RRID: AB_2079751；批号：2971003
抗山羊 Alexa Fluor 488 赛默飞世尔科技 A11055用于免疫荧光检测的二抗。RRID: AB_2534102；批号：1915848
抗小鼠 Alexa Fluor 647赛默飞世尔科技 A31571用于免疫荧光检测的二抗。RRID: AB_162542；批号：1757130
抗Oct4 BD 生物科学611202免疫染色实验中使用的一抗。RRID: AB_398736；批号：5233722
抗-Phox2bSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-376997免疫染色实验中使用的一抗。批号：E0117
抗兔 Alexa Fluor 594 免疫学科学IS-20152-1用于免疫荧光检测的二抗
抗-TUJ1 Sigma-Aldrich T2200免疫染色实验中使用的一抗。RRID: AB_262133
B27Miltenyi Biotec130-093-566用于神经元细胞维持的无血清添加剂
BambankerNippon GeneticsNGE-BB02用于运动神经元前体细胞的细胞冻存液
BDNFPreproTech450-02脑源性神经营养因子
杀稻瘟菌素Sigma-Aldrich203350抑制原核生物和真核生物蛋白质合成的核苷类抗生素
BSASigma-AldrichA2153牛血清白蛋白。用于免疫染色实验中防止抗体非特异性结合的封闭剂
CaCl2Sigma-AldrichC3881电生理溶液用化学品
Clampex 10 软件Molecular DevicesClampex 10膜电流记录系统
Corning Matrigel hESC-合格基质康宁354277从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中重建的基底膜基质。用于诱导多能干细胞（iPSC）在塑料和玻璃载体上的黏附
CRYOSTEM ACF 冻存培养基生物工业公司05-710-1E人诱导多能干细胞冻存培养基
D-葡萄糖Sigma-AldrichG5146电生理溶液用化学品
DAPI 粉末罗氏102362760014′，6-二脒基-2-苯基吲哚。一种可与腺嘌呤结合的荧光染料–DNA中富含胸腺嘧啶的区域，用于免疫荧光检测中的细胞核染色
DAPTAdipoGenAG-CR1-0016-M005γ-分泌酶抑制剂
DispaseGibco17105-041用于温和解离人iPSC的试剂
DMEM/F12Sigma-AldrichD6421-500ML细胞培养基础培养基
多西环素Sigma-AldrichD9891-1G 用于诱导 epB-Bsd-TT-NIL 和 epB-Bsd-TT-NIP 载体中转基因的表达
DS2U WiCellUWWC1-DS2U商用人类iPSC细胞系
E.Z.N.A 总RNA试剂盒 Omega bio-tekR6834-02用于培养的真核细胞总RNA提取的试剂盒
GDNFPreproTech450-10胶质细胞源性神经营养因子
Gibco 附加体质粒 hiPSC 细胞系赛默飞世尔科技A18945商用人类iPSC细胞系
Glutamax赛默飞世尔科技35050038一种比L-谷氨酰胺更稳定的替代物，可改善细胞健康。
HepesSigma-AldrichH4034电生理溶液用化学品
用于RT-qPCR的iScript反转录超级混合液 伯乐（Bio-Rad）1708841用于实时定量 PCR 的基因表达分析试剂盒
iTaq™ Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad172-5121 即用型反应预混液，专为基于染料的定量PCR（qPCR）优化，适用于任何实时PCR仪器
K-葡萄糖酸盐Sigma-AldrichG4500电生理溶液用化学品
KClSigma-AldrichP9333电生理溶液用化学品
L-抗坏血酸LKT LaboratoriesA7210在细胞培养中用作抗氧化剂
层粘连蛋白Sigma-Aldrich11243217001促进神经细胞在体外的贴附和生长
激光扫描共聚焦显微镜 Olympus iX83 FluoView1200用于免疫染色图像采集的共聚焦显微镜
Mg-ATPSigma-AldrichA9187电生理溶液用化学品
MgCl2Sigma-AldrichM8266电生理溶液用化学品
封片剂 Ibidi50001用于共聚焦显微镜和免疫荧光实验的封片液
多钳制膜片钳放大器Molecular Devices700B膜电流记录系统
Na-GTPSigma-AldrichG8877电生理溶液用化学品
NaClSigma-Aldrich71376电生理溶液用化学品
非必需氨基酸赛默飞世尔科技11140035非必需氨基酸。用作细胞培养基的补充剂，以促进细胞生长并提高细胞存活率。
Neon 100 μL 型试剂盒赛默飞世尔科技MPK10096细胞电穿孔试剂盒
Neon 转染系统赛默飞世尔科技MPK5000细胞电穿孔系统
Neurobasal 培养基赛默飞世尔科技21103049专为长期维持和成熟神经元细胞群体而设计的基础培养基，无需使用星形胶质细胞饲养层
NutriStem-XF/FF 生物工业公司05-100-1A人iPSC培养基
多聚甲醛电子显微镜科学公司157-8用于免疫染色实验中的细胞固定
PBSSigma-AldrichD8662-500ML含钙、含镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液
PBS Ca2+/毫克2+ 自由Sigma-AldrichD8537-500ML不含钙、不含镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液
青霉素/链霉素 Sigma-AldrichP4333-100ML用于防止细胞培养中细菌污染的青霉素/链霉素溶液。
多聚鸟氨酸Sigma-AldrichP4957促进神经细胞在体外的贴附和生长
SU5402Sigma-AldrichSML0443-5MG血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）选择性抑制剂
Triton X-100 Sigma-AldrichT87874-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇， 辛基苯基聚乙二醇，聚乙二醇 叔辛基苯基醚。用于免疫染色实验中的细胞通透化
直立显微镜OlympusBX51VI用于电生理记录的显微镜，配备 CoolSnap Myo 相机 
Y-27632  （ROCK抑制剂）Enzo Life SciencesALX-270-333-M005 细胞通透性Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）选择性抑制剂。可提高诱导多能干细胞（iPSC）存活率
μ-第8孔 Ibidi80826高支持–固定细胞的显微分析

参考文献

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人诱导多能干细胞运动神经元分化Ngn2 Isl1 Lhx3Ngn2 Isl1 Phox2a脊髓运动神经元多西环素诱导胆碱乙酰转移酶动作电位发放
利用PiggyBac载体将人诱导性多能干细胞（iPSCs）转化为功能性脊髓和颅脑运动神经元
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