方法文章

在微RNA的Vivo抑制下，降低小鼠的肿瘤生长

DOI：

10.3791/59322

⸱

2019年8月23日

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-UAM, 2Ciberonc, Instituto de Salud Carlos III

本文内容

摘要

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该协议将人类甲状腺肿瘤的异种移植和正交小鼠模型描述为测试基于微RNA的抑制剂治疗的平台。该方法是研究非编码RNA的功能及其作为新的治疗靶点的潜力的理想选择。

摘要

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微RNA（miRNA）是基因表达的重要调节器，通过它们破坏mRNA和抑制目标mRNA的翻译的能力。越来越多的研究已经确定miRNA是癌症诊断和治疗的潜在生物标志物，也是治疗目标，为癌症评估和治疗增加了一个额外的维度。在甲状腺癌的背景下，肿瘤的产生不仅来自重要基因的突变，还来自许多miRNA的过度表达。因此，miRNA在甲状腺基因表达控制中的作用正在演变为癌症的重要机制。本文提出一个方案，利用人类肿瘤异种移植和正交小鼠模型，研究miRNA抑制剂作为甲状腺癌治疗方式的效果。在工程稳定甲状腺肿瘤细胞表达GFP和荧光素酶后，细胞被注射到裸鼠中，形成肿瘤，随后可发生生物发光。体内抑制miRNA可以降低肿瘤生长，提高miRNA基因靶点。除了确定新的治疗靶点外，该方法还可用于评估确定 miRNA 在体内的重要性。

引言

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甲状腺癌是一种内分泌恶性肿瘤，发病率不断增加，虽然一般说来，它有很好的结果1。然而，一些患者发展为无法治疗的侵略性疾病，并且对分子基础知之甚少2。

miRNA 是 22 核苷酸长的非编码 RNA，用于调节许多组织中的基因表达，通常通过基对结合到目标信使RNA （mRNA） 的 3' 非转化区域 （3'UTR），触发 mRNA 退化或转化抑制3,4.越来越多的证据表明，微RNA表达的放松管制是癌症的标志，因为这些分子调节增殖信号、迁移、入侵和转移，并能抵抗凋亡5，6.近年来，许多研究已经确定miRNA是癌症诊断和预后的潜在生物标志物，以及治疗目标7，为癌症评价和治疗提供了新的维度。

miRNA在人类分子肿瘤学中已成为人类甲状腺肿瘤8、9、10、11、12的关键驱动因素。

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方案

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动物实验是经欧洲委员会高级委员会道德委员会（CSIC，西班牙）批准，根据欧洲共同体法（86/609/EEC）和西班牙法律（R.D.1201/2005）进行的。

1. 细胞的侧角接种和肿瘤内性肿瘤治疗

  1. 细胞制备
    1. 设计Cal62人类甲状腺癌细胞系（KRASG12R和p53A161D突变），以过度表达一种转基因结构，该结构构成表达GFP和荧光素酶（CMV-萤火虫Luc-IRES-eGFP）。通过抗生素耐药性或通过流式细胞测定对GFP阳性细胞进行分类，选择转基因细胞。
    2. 在37°C和5%CO2下，在Dulbeco的改性鹰培养基（DMEM）中生长细胞，辅以青霉素、链霉素和10%胎儿牛血清（FBS）。
    3. 在4°C下在50μL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中悬浮1 x 106个细胞。
  2. 细胞接种到小鼠的侧翼
    1. 用相同数量的基底膜基质混合细胞。例如，在PBS的50μL中加入1 x 106个细胞到50μL的基底膜基质（见材料表），然后轻轻混合。
      注意:
    2. 使用 1 mL 胰岛素注射器，使用 27G 1/2' （0.4x13 m....

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结果

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我们使用两个不同的小鼠模型来确定miRNA的中和是否能抑制肿瘤生长。因此，人类肿瘤甲状腺Cal62-luc细胞被分皮注射到裸鼠的侧翼，以生成异形文字模型。两周后，肿瘤成立，可以用卡钳测量。当时，小鼠在肿瘤内注射miR-146b抑制剂，或适当的对照，肿瘤体积再跟踪两周（图1A）。如图1B所示，在肿瘤内注射miR-146b抑制剂（抗146b）（n=8）的肿瘤生长对阴性对照组（n=4）或盐水对照组（未显示）有明显抑制。miRNA是基因调控的一个重要特征，因为它们调节了几个靶点mRNA。因此，肿瘤抑制基因是肿瘤抑制基因的重要调节剂。该协议允许分析这些基因的肿瘤内表达水平，在使用miRNA抑制剂治疗后可以进行测试。此外，还可以研究一些增殖标记物的水平，这从在拮抗性肿瘤中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达低于控制治疗的肿瘤（图2）。此外，通过分析肿瘤提取的RNA或蛋白质，可以研究miRNA靶点的恢复，如在抗肿瘤（抗-146b）治疗肿瘤中PTEN的较高表达（

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讨论

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本文介绍了一种研究miRNA体内功能的方法，以更好地了解其在肿瘤启动和进展中的作用，以及其作为甲状腺癌治疗靶点的潜力。这里描述的肿瘤异种移植模型基于细胞的使用，这些细胞可以通过其生物发光信号进行跟踪，从而允许在治疗的影响下测量体内的肿瘤生长。此外，我们描述了使用基于miRNA的甲状腺癌治疗，目前处于早期阶段。

我们首先使用皮下异种移植模型测试了miRNA作为治疗靶点的可行性，该模型将甲状腺肿瘤细胞注射到免疫缺陷小鼠的侧翼。然后，我们在肿瘤内注射了拮抗性R。该模型可用于多种癌症类型，以测试特定miRNA或在人体癌细胞体内的comiRs的重要性。这种技术的优点是，它相对简单，执行也快，与最小的动物痛苦。然而，这项技术的一个主要缺点是，它不密切模仿人类的状况，因为细胞被注射皮下，而不是进入原产器官。为了克服这一限制，我们使用了一个更强大的模型，通过手术将生物发光甲状腺肿瘤细胞植入小鼠的甲状腺进行手术正射。虽然这种技术是更加复杂和耗时的，它允许研究肿瘤生长在其"原生"环境，甲状腺。这种方法的一个优势是，它允许研究肿瘤细胞传播作为转移，通常在肺部，这可以通过体内成像软件进行评估。另一个优势是.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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我们感谢拉克尔·阿罗查·里斯科在老鼠的治疗和护理方面给予的帮助。我们感谢J.Blanco博士（加泰罗尼亚高级化学研究所-CSIC）和E.Mato博士（圣克里乌圣保医院研究所）巴塞罗那（西班牙）分别赠送CMV-萤火虫luc-IRES-EGFP和Cal62-Luc细胞。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AntagomiR：mirVana miRNA 抑制剂Thermo Fisher4464088体内就绪
基底膜基质：基质胶基底膜基质 高浓度Corning#354248
DICER 抗体Abcamab14601IHQ：1/100
体内 递送试剂：Invivofectamine 3.0 试剂Thermo FisherIVF3005
体内成像软件：IVIS-Lumina II 成像系统Caliper 生命科学
阴性对照：mirVana miRNA 抑制剂，阴性对照 #1Thermo Fisher4464077体内就绪
PCNA 抗体Abcamab92552WB：1/2,000
PTEN 抗体Santa Cruzsc-7974WB：1/1,000
XenoLight D-荧光素 - K+ 盐生物发光底物PerkinElmer122799在 PBS 中稀释

参考文献

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  1. Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
  2. Landa, I., et al.

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标签

microRNA AntagomiR CAL 62 D

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