本方案描述了人甲状腺肿瘤发生的异种移植和原位小鼠模型，可作为测试基于微小RNA抑制剂治疗的平台。该方法适用于研究非编码RNA的功能及其作为新型治疗靶点的潜力。
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本文内容
摘要
摘要
microRNA（miRNA）通过介导靶mRNA的不稳定性和翻译抑制，在基因表达调控中发挥重要作用。越来越多的研究表明，miRNA可作为癌症诊断与预后的潜在生物标志物，并可作为治疗靶点，从而为癌症的评估与治疗增添了新的维度。在甲状腺癌中，肿瘤的发生不仅源于关键基因的突变，还与多种miRNA的过表达密切相关。因此，miRNA在调控甲状腺基因表达中的作用正逐渐成为癌症机制研究的重要内容。本文介绍了一种利用人源肿瘤异种移植及原位小鼠模型，研究miRNA抑制剂递送作为甲状腺癌治疗策略的实验方案。首先构建稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）和荧光素酶的甲状腺肿瘤细胞，将其注射至裸鼠体内以形成肿瘤，并通过生物发光成像进行动态监测。在体抑制特定miRNA可有效减缓肿瘤生长，并上调其靶基因的表达。该方法不仅可用于评估特定miRNA在体内的功能，还有助于发现新的治疗靶点。
引言
甲状腺癌是一种内分泌系统恶性肿瘤，其发病率呈上升趋势，尽管总体预后较好1。然而，部分患者会发展为无法治疗的侵袭性类型，其分子基础尚不明确2。
miRNA 是长约22个核苷酸的非编码RNA，通常通过与靶信使RNA（mRNA）的3'非翻译区（3'UTR）进行碱基配对结合，从而调控多种组织中的基因表达，引发mRNA降解或翻译抑制3,4。越来越多的证据表明，microRNA表达的失调是癌症的一个重要特征，因为这些分子能够调节增殖信号、迁移、侵袭和转移过程，并可赋予细胞对凋亡的抵抗能力5,6。近年来，大量研究已将miRNA鉴定为癌症诊断与预后评估的潜在生物标志物以及治疗靶点7，为癌症的评估与治疗提供了新的视角。
miRNA 已成为人类分子肿瘤学中的核心角色，是人类甲状腺肿瘤发生发展的关键驱动因素8,9,
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方案
动物实验遵循欧洲共同体法律（86/609/EEC）和西班牙法律（R.D. 1201/2005），并获得西班牙国家科学研究委员会（CSIC，西班牙）伦理委员会的批准。
1. 细胞侧腹接种及瘤内antagomiR治疗
- 细胞制备
- 构建 Cal62 人甲状腺癌细胞系（KRASG12R 和 p53A161D 突变）以过表达一种组成型表达GFP和荧光素酶的转基因构建体（CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP）。通过抗生素抗性筛选或流式细胞术分选GFP阳性细胞来获得转基因细胞。
- 在添加青霉素、链霉素和10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2.
- 重悬 1 × 10⁶ 细胞于 100 μL 缓冲液中6 50 μL 磷酸盐缓冲液（PBS）中的细胞，置于 4 °C。
- 将细胞接种至小鼠 flank 部位
- 将细胞与等量的基底膜基质混合。例如，加入 1 x 106 50 μL PBS中的细胞与50 μL基底膜基质混合（参见 材料表）并轻轻混匀。
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- 将细胞与等量的基底膜基质混合。例如，加入 1 x 106 50 μL PBS中的细胞与50 μL基底膜基质混合（参见 材料表）并轻轻混匀。
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结果
我们使用了两种不同的小鼠模型，以确定中和一种miRNA是否能够抑制肿瘤生长。为此，将人甲状腺肿瘤Cal62-luc细胞皮下注射到裸鼠的侧 flank 部位，建立异种移植模型。两周后，肿瘤形成并可用游标卡尺测量。此时，对小鼠瘤内注射miR-146b抑制剂（miR-146b-inhibitor）或相应的对照物，并继续监测肿瘤体积达两周（图1A）。如图1B所示，与阴性对照组（n=4）或生理盐水对照组（未显示）相比，瘤内注射miR-146b抑制剂（anti-146b）的小鼠（n=8）其肿瘤生长受到显著抑制。miRNA是基因调控的重要组成部分，因其可调控多个靶mRNA。因此，oncomiR（癌相关miRNA）是肿瘤抑制基因的重要调控因子。本实验方案可用于分析经miRNA抑制剂处理后，这些基因在肿瘤内部的表达水平。此外，还可研究某些增殖标志物的表达水平，例如，经antagomiR处理的肿瘤中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达水平低于对照组处理的肿瘤（图2）。同时，通过分析从.......
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讨论
本文介绍了一种研究miRNA在体内功能的方法，旨在更深入地理解其在甲状腺癌发生和进展中的作用，以及作为治疗靶点的潜力。文中所述的肿瘤异种移植模型基于可利用生物发光信号进行追踪的细胞，从而能够在治疗干预下在活体内测量肿瘤的生长情况。此外，我们还描述了一种基于miRNA的甲状腺癌治疗方法，目前该方法尚处于早期研究阶段。
我们首先使用皮下异种移植模型验证了miRNA作为治疗靶点的可行性，该模型将甲状腺肿瘤细胞注射到免疫缺陷小鼠的侧 flank 部位。随后，我们对肿瘤内注射了antagomiR。该模型可用于多种癌症类型，以在体内评估特定miRNA或癌相关miRNA（oncomiR）在人类癌细胞中的作用。该技术的优点在于操作相对简单、快速，且动物所受痛苦最小。然而，该技术的主要缺点是不能很好地模拟人类疾病状态，因为细胞被注射到皮下而非原发器官内。为了克服这一局限性，我们采用了一种更为严谨的模型，即通过手术将生物发光的甲状腺肿瘤细胞正位植入小鼠甲状腺内。尽管该技术操作更复杂且耗时较长，但它允许在肿瘤的“原生”环境——甲状腺中研究肿瘤生长。该方法的一个优势在于，可利用活体成像软件检测肿瘤细胞扩散.......
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披露
作者无任何披露信息。
致谢
我们感谢Raquel Arocha Riesco在小鼠处理与护理方面的协助。感谢西班牙巴塞罗那加泰罗尼亚高等化学研究所-西班牙国家研究委员会（Catalonian Institute for Advance Chemistry-CSIC）的J. Blanco博士和圣十字圣保罗医院研究所（Institut de Reserca de l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau）的E. Mato博士，分别惠赠CMV-Firefly luc-IRES-EGFP和Cal62-Luc细胞。 基金支持： SAF2016-75531-R（MICIU）、欧洲区域发展基金FEDER、B2017/BMD-3724（马德里自治区）、GCB14142311CRES（西班牙抗癌基金会，AECC）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| antagomiR：mirVana miRNA抑制剂 | Thermo Fisher | 4464088 | 适用于体内实验 |
| 基底膜基质：Matrigel 高浓度基底膜基质 | Corning | #354248 | |
| DICER抗体 | Abcam | ab14601 | 免疫组化染色：1/100 |
| 体内递送试剂：Invivofectamine 3.0 试剂 | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| 体内成像软件：IVIS-Lumina II 成像系统 | Caliper Life Sciences | ||
| 阴性对照：mirVana miRNA 抑制剂，阴性对照 #1 | Thermo Fisher | 4464077 | 适用于体内实验 |
| PCNA抗体 | Abcam | ab92552 | Western blot：1/2,000 |
| PTEN抗体 | Santa Cruz | sc-7974 | Western blot：1/1,000 |
| XenoLight D-荧光素钾盐生物发光底物 | PerkinElmer | 122799 | 用PBS稀释 |
参考文献
- Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
- Landa, I., et al.
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重印与许可
