方法文章

利用平铺免疫荧光染色直接观察血管内皮细胞

DOI：

10.3791/59325

⸱

2019年8月20日

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1Department of Cardiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Institute of Cardiovascular Diseases, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了一种免疫荧光染色方案，用于直接观察小鼠主动脉的内皮细胞。该技术在研究不同血流模式下内皮细胞的细胞和分子表型以及动脉粥样硬化发展过程中具有重要应用价值。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

内皮细胞表型和形态的异常改变被认为是动脉粥样硬化发病过程中的初始事件。对完整内皮层进行直接观察，将为理解功能失调的内皮细胞中发生的细胞和分子事件提供有价值的信息。本文介绍一种改良的内皮面免疫荧光染色技术，该技术可使科研人员获得清晰的完整内皮表面图像，并原位分析分子表达模式。该方法简便可靠，适用于观察主动脉不同部位的完整内皮单层细胞。该技术可能是研究动脉粥样硬化病理生理机制，尤其是早期阶段的有力工具。

引言

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血管结构的早期变化主要起始于内皮层，内皮层通过其细胞间的紧密连接复合物，在血液与血管壁之间发挥选择性屏障作用1。大量证据表明，血流的机械效应在调节内皮功能中具有关键作用2。由血流产生的流体剪切应力是一种摩擦力，可根据不同血管部位的特定血流模式，差异性地塑造内皮细胞的形态和功能2,3。与血流稳定的区域（如动脉的直线段）相比，动脉粥样硬化病变更倾向于发生在血流紊乱（d-flow）的部位，例如血管弯曲处、分流处和分支点。因此，直接观察内皮细胞的形态及其分子表达模式，将有助于深入理解在不同血流条件下内皮细胞的结构与功能表型。

培养的内皮细胞可能无法完全表达其在体内的真实表型，部分原因在于缺乏流体剪切应力、周围细胞因子以及细胞间或细胞与细胞外基质相互作用的影响。为克服这一问题，可通过传统的免疫组织化学方法在横切面上研究完整的内皮细胞单层。然而，由于内皮单层极为纤薄且脆弱，通常难以清晰观察。已有研究采用表面免疫组织化学技术来观察内皮内表面，但该方法操作复杂，结果不稳定，因为内皮容易从下方组织剥离；或者仅能使用大鼠或兔的部分动脉壁进行制片，而这些动物的血管壁较厚4,5。

在诸多方面，小鼠模型相较于其他动物具有显著优势。本文中，我们采用一种改良的内皮面免疫荧光技术，用于分析C57BL/6小鼠主动脉弓和胸主动脉的内皮细胞。该技术已被广泛应用于研究不同血流模式下以及动脉粥样硬化发展过程中内皮细胞的病理生理学特征6,7,8,9,10。该方法可使科研人员清晰地观察内皮层的整个表面，并比较特定蛋白在不同流体剪切应力区域中的表达模式。

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方案

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所有动物实验均按照上海交通大学动物资源委员会批准的实验方案进行。

1. 小鼠主动脉灌注

  1. 简要而言，通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg 体重）对12周龄的C57BL/6小鼠进行麻醉。通过轻轻夹捏尾巴确认麻醉效果。
    注意：若未观察到任何运动反应，则表明动物已充分麻醉，可开始实验。
  2. 使用胶带将小鼠的四肢固定在一层纸巾上。
  3. 用镊子提起小鼠皮肤，用剪刀从腹部开始沿中线向上剪至胸腔顶部。
  4. 用锋利的剪刀在肋骨下方切开腹腔。
  5. 用镊子提起胸骨，剪断膈肌，随后剪除肋骨以暴露胸腔。
  6. 用剪刀在肝脏上方剪断下腔静脉。
  7. 通过左心室以100 mmHg的压力灌注预冷的含肝素（40单位/mL）生理盐水5分钟，直至肺和肝脏变为苍白；随后用预冷的含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）灌注3分钟。
  8. 去除所有肌肉、器官和脂肪组织，直至暴露主动脉。
  9. 将小鼠置于解剖显微镜下。

2. 主动脉的解剖与纵向切开

  1. 在解剖显微镜下清晰暴露主动脉，并使用精细镊子和精细剪刀尽可能彻底清除主动脉周围的结缔组织（图1）。
  2. 用精细剪刀从心脏至腹腔干处分离胸主动脉，并将主动脉置于盛有PBS的6 cm细胞培养皿中。沿主动脉小弯和大弯纵向切开，直至到达直段。使用显微剪刀切开主动脉弓的三个分支，包括无名动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉，如图2所示。

3. 主动脉的预处理与免疫染色

  1. 在12孔细胞培养板中，用含0.1%聚氧乙烯辛基苯基醚的PBS溶液对主动脉进行通透处理，持续10分钟，随后在室温下用含10%正常山羊血清和2.5%聚山梨酯20的Tris缓冲盐水（TBS）封闭1小时。
  2. 接着，将主动脉置于封闭缓冲液中，加入5 µg/mL兔抗VCAM-1抗体和5 µg/mL大鼠抗VE-钙黏蛋白抗体，于4 °C孵育过夜。
  3. 用洗涤液（含2.5%聚山梨酯20的TBS）将样本清洗3次后，加入荧光标记的二抗（1:1,000稀释，Alexa Fluor 555标记的抗兔IgG和Alexa Fluor 488标记的抗大鼠IgG），室温孵育1小时。再用洗涤液清洗3次。
  4. 用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1 µg/mL）对主动脉进行复染，持续10分钟，随后用洗涤液清洗3次。

4. 将主动脉固定在玻片上

  1. 将主动脉置于盖玻片上，管腔面朝下，缓慢移至预先滴加在盖玻片上的抗荧光淬灭封片液中。轻轻拉伸主动脉，以保持样本平整。
  2. 将盖玻片翻转，放置在载玻片上。操作时需注意避免样本与玻片之间残留气泡。

5. 主动脉的观察

  1. 使用激光扫描共聚焦显微镜观察主动脉。
  2. 利用Image-Pro Plus软件分析内面图像中目标区域不同通道的颜色强度。

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结果

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一只12周龄的C57BL/6小鼠被实施安乐死，并用含有40单位/毫升肝素的生理盐水灌注，随后用预冷的4%多聚甲醛灌注。在解剖显微镜下暴露小鼠主动脉（图1），进行解剖并纵向切开（图2）。按照图3和表1所示方法对血管内皮细胞进行表面免疫荧光染色。以VE-钙黏蛋白作为内皮细胞标记物，检测不同血流模式下小鼠主动脉不同区域血管细胞黏附蛋白-1（VCAM-1）的表达情况。同时用DAPI复染细胞核，以增强可视化效果。通过显微镜观察z-轴层扫图像时，可根据细胞核形态轻松区分内皮细胞和平滑肌细胞，因为内皮细胞核呈椭圆形且比呈纺锤形的平滑肌细胞核更大。典型的表面成像结果如图4所示。使用LSM 710激光扫描显微镜（材料表）配备FLUAR 40x/1.3油镜对主动脉进行观察...

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讨论

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内皮细胞暴露于多种促动脉粥样硬化因子，包括脂质、炎症介质和流体剪切应力1,11,12。对原位内皮细胞进行直接观察，可特异性分析细胞形态、细胞间连接及分子表达模式在损伤刺激下的变化，具有独特优势。

既往研究提出了两种不同的内皮面免疫组织化学技术，用于观察动脉壁的内皮层4,5。其中一种方法是通过特殊技术将内皮层从血管壁剥离，从而获得单层内皮细胞，但该技术难以掌握，且可能导致动脉分支部位大量内皮细胞丢失4。另一种方法则是如我们所述，将整段动脉壁进行封片。整体封片法操作简便，可在兔和大鼠中完整保留整个内皮单层5,13。然而，将...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究由国家自然科学基金（项目编号：81670451，81770430）、上海市启明星计划（项目编号：17QA1403000）以及上海市科学技术委员会（项目编号：14441903002，15411963700）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗荧光淬灭封片剂ServicebioG1401
精细镊子RWD Life ScienceF11001-11
精细剪刀RWD Life ScienceS12003-09
解剖镊RWD Life ScienceF12005-10
微型弹簧剪刀RWD Life ScienceS11001-08
聚氧乙烯辛基苯基醚（Triton X-100）AmrescoM143
聚山梨酯20（Tween 20）Amresco0777
VCAM-1 抗体Abcamab134047
VE-钙黏蛋白抗体BD Biosciences555289
Alexa Fluor 555 标记的抗兔 IgGinvitrogenA-31572
Alexa Fluor 488 标记的抗大鼠 IgGinvitrogenA-21208
激光扫描显微镜 Carl Zeiss

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
  2. Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
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