利用大鼠的后肢卸荷和部分重量轴承模拟火星空间飞行任务

包括月球和火星在内的外星目标代表了人类太空探索的未来, 但两者的引力都大大弱于地球。虽然在宇航员^{1、2、3、4、5}和啮齿类动物6中广泛研究了失重对肌肉骨骼系统的影响,^7.,8,9、后者得益于成熟的后肢卸荷 (hlu) 模型¹⁰, 对部分重力的影响了解甚少。火星重力占地球的 38%, 这个星球已经成为长期探索的焦点¹¹;因此, 了解在这种情况下可能发生的肌肉变化是至关重要的。为此, 我们在大鼠12号的部分负重 (pwb) 系统的基础上, 根据以前在小鼠^613只身上所做的工作, 利用肌肉和骨骼结果对其进行了验证。然而, 在探索火星之前, 将有一段长时间的微重力, 而我们先前描述的^{模型 12}没有涉及这一问题。因此, 在这项研究中, 我们改变了我们的模型, 以模仿火星之旅, 包括一个完整的后肢卸载的第一阶段, 然后立即在正常负荷的40% 的部分重量承担的第二阶段。

与大多数 HLU 型号不同的是, 我们选择使用骨盆线束 (基于 Chowdhury 等人描述的那个), 而不是尾巴悬架, 以提高动物的舒适性, 并能够在几分钟内无缝、毫不费力地从 hlu 移动到 PWB。同时, 我们使用了我们之前开发和广泛描述的笼子和悬挂装置.除了提供可靠的一致数据外, 我们之前还证明, 吊杆中心悬架系统的固定连接点并不妨碍动物移动、梳理、喂养或饮酒。在这篇文章中, 我们将描述如何卸载动物的后肢 (全部和部分), 验证他们达到的重力水平, 以及如何在功能上评估由此产生的肌肉变化使用抓地力和湿肌肉质量。这种模型对于研究人员来说是非常有用的, 他们试图调查部分重力 (人造或外生) 对已经受损的肌肉骨骼系统的后果, 从而使他们能够研究生物体如何适应部分重新装载, 并制定可在载人航天飞行期间和之后维持健康的对策。

这里描述的所有方法都是由贝丝以色列执事医疗中心动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 根据第067-2016 号协议批准的。

注: 使用在基线 (第0天) 年龄为14周的雄性 Wistar 大鼠。老鼠被单独安置在定制笼子提前24小时基线, 以适应。

1. 后肢卸料

注: 骨盆线束可以放在麻醉或清醒的动物身上。在这里, 该协议的描述是麻醉动物。佩戴适当的个人防护装备 (PPE) 来处理动物。

1. 将大鼠放入麻醉箱中, 使用3.5% 异氟醚, 氧气流量为 2 l2 min。
   注: 当后爪的牢固夹点不会引起反应时, 正确的麻醉被确认。
2. 一旦动物被完全麻醉, 将老鼠放置在长凳上, 麻醉气体来自2% 异氟醚和 1.5 lmmin 的氧气流。
3. 将大鼠放置在一个俯卧的位置, 并将骨盆线束放在一个转子尾状运动。
4. 轻轻弯曲骨盆线束, 以提供一个舒适的适合, 同时要小心, 不要挤压后肢, 以防止擦伤和不适。
5. 将不锈钢链与旋转扣连接到骨盆线束的顶部, 在尾巴的底部安装一个钩子。
6. 将大鼠从麻醉中取出, 并将动物放入定制的笼子中, 其链延伸到其最大值。
7. 一旦大鼠完全清醒和移动, 缩短链使用顶部旋转扣, 直到后肢不能再到达地板。
8. 观察动物几分钟, 以评估其舒适性, 并确保在任何时候, 两肢都保持完全卸载。

2. 部分负重

注: 这一步可以在醒着和麻醉的动物身上实现。

1. 通过添加由不锈钢链条和后杆组成的三角形部分, 将 HLU 悬挂装置转换为 PWB 悬架。
2. 按照与 HLU 详细说明的程序 (步骤1.1 和 1.2) 相同的程序对动物进行麻醉。
3. 将适当大小的系绳夹在大鼠的前肢上 (400 克或以下的大鼠为 m, 重量在400克以上的大鼠为 l), 并使用后胸罩扩展器将其关闭。
4. 将三角形部件的一个扣子固定在位于后胸罩扩展器上的钩子上, 并将位于尾部底部骨盆线束上的挂钩上的相反扣子连接在一起。
5. 让动物从笼子里的麻醉中恢复。一旦醒来, 通过缩短链和修改底部旋转扣的位置, 验证悬吊在前肢和后肢是相等的, 如果需要的话。
   注: 此步骤也可以通过力板来确认所有肢体上的相等载荷来实现。
6. 将老鼠放在秤的顶部, 记录 "装载" 的体重, 即动物和整个仪器的重量, 而不缩短链条。
7. 缩短链条, 直到刻度显示40% 的 "加载" 体重, 并记录所达到的重力水平 (以卸载重量和装载重量之间的比率表示)。
8. 观察动物, 确保卸载的重量是稳定的, 老鼠同样加载在所有四肢上。
9. 使用棒从秤上取下整个设备, 并将老鼠放回笼子中。

3. 评估后肢抓地力

1. 用传统的约束将一只手放在前肢下, 以传统的约束将老鼠抱住。用第二只手轻轻握住尾巴。
2. 用后爪接近抓地杆, 并确保两个爪子都完全靠在杆上。
   注: 如果老鼠没有完全抓住酒吧或没有显示任何自愿抓握的证据, 稍微释放约束。如果这不成功, 请将老鼠返回到其保持架, 几分钟后重试。
3. 轻轻地把老鼠直接拉回来, 直到它释放它的抓地力。记录传感器上显示的最大力。
4. 在两次测量之间等待大约 30秒, 并重复测试3次。
5. 计算三个测量值的平均值, 以考虑疲劳。

4. 肌肉湿质量的记录

1. 将大鼠放入二氧化碳安乐死室。在根据 IACUC 和 AVMA 指南等待适当的时间后, 通过对呼吸不足的目视观察来确认安乐死。
2. 将大鼠放在解剖台上, 放在容易出现的位置, 用小的解剖剪刀在脚踝附近割伤皮草和皮肤。用双手将皮肤层拉掉。
3. 使用小解剖剪刀, 轻轻地打破肌肉筋膜, 并隔离跟骨肌腱。
   注: 跟腱是鞋底和腓肠肌的附着点。
4. 当拿着一小副推子的跟骨肌腱时, 用解剖剪刀将腓肠肌和独角肌与上面的双股肌隔离开来。
5. 一旦隔离, 切断腓肠肌和单侧肌肉在腹股沟区域的附着点。
6. 轻轻地将鞋底从肩部取下, 并通过切割跟骨肌腱将其分离。
7. 将老鼠置于仰角位置。小心地取出筋膜, 并在向上运动中从脚踝前剥去胫骨。
8. 在其上附着点前切胫骨。
9. 使用一个点色的精密秤和一艘称重船记录每个切除肌肉的确切湿质量。

利用我们之前设计和详细描述的新保持架 12, 我们使用了不锈钢链基悬挂装置, 既适用于后肢卸除 (hlu,图 1) 和部分负重 (pwb, 图 2)。我们设计的关键优势是能够在几分钟内从一种卸载到另一种卸载, 同时为动物保持相同的环境。我们使用了一个定制的骨盆线束 (图 2a), 它连接到一个定制的不锈钢链, 每一侧都有一个旋转的扣, 用于 hlu。为了修改这种悬挂装置并实现 PWB, 唯一的要求是增加一块三角形的不锈钢链条, 其中包括一个不灵活的后杆, 设计为坐在脊椎上方 (图 3)。这些步骤可以在清醒或麻醉的动物身上执行。

有了本实验提供的多功能环境, 我们可以成功地卸载所有动物的后肢 7天, 而不会出现任何并发症, 并以正常负荷的40% 迅速将它们暴露在部分重力状态下 (PWB40, 平均达到重力水平 0.4076 g±0.0036 g)。在总 HLU 的第一周, 动物的体重明显下降 (图 4a:7.19%±0.87%, n = 9, p < 0.87),这在其他型号14中已经看到, 与我们在在 PWB40 处暴露相同时间的大鼠 (-5.5%±1.44%, n = 10, p = 0.37)。然而, 动物继续减肥, 同时接触到 PWB40 (-9.0%±1.35% 从基线, p < 0.0001)。

后肢抓地力是一种标准的肌肉功能测量, 可纵向使用 (图 4b)。我们注意到, 一个星期的总卸载导致抓地力平均下降50.16% ±4.10% 相比基线 (p < 0.0001)。在随后一周的部分重量承受在正常负荷的40% 后, 我们没有注意到抓地力的任何进一步变化 (-44.29%±4.67% 与基线相比, p < 0.0001)。在所有时间点上, 后爪抓地力的百分比变化与年龄匹配的控制力有显著差异 (第7天和第14天的 p < 0.0001, n = 11)。此外, 我们注意到, 在完成研究后, 经过完全卸载的动物, 其次是部分负重 (HLU-PWB40), 与 PWB40 组相比, 抓地力损失显著较大 (p = 0.03)。

在实验结束时记录了肌肉湿质量, 并与正常加载两周或两周 PWB40 (图 4c) 后获得的数据和我们第12组先前公布的数据进行了比较.我们发现, 与年龄匹配的对照组 (Pwb100) 相比, WWB40 和 HLU-PWB40 组的单侧 (s)、腓肠肌 (G) 和胫骨前 (TA) 肌肉的湿质量明显较低 (PWB100)。事实上, 我们记录的动物平均焊点质量为0.165 克±0.007 g, 这明显低于在我们之前的实验中暴露于 PWB100 的老鼠 2周 (-24.60 ±3.18%, p < 0.0001)。对于壁角, 我们记录的平均湿质量为 2.192 g±0.096 g (-10.55 ±3.93%, p = 0.096 VS PWB100), 胫骨前部湿质量为 0.759 g±0.运载工具 g (-14.40 ±27, p = 0.00 9 VS pwb100)。虽然我们的数据集强调, 暴露在 Mars-a用来像类似物 (HLU-PWB100) 下的动物的独角肌和腓肠肌的湿质量与连续暴露在 PWB40 中的动物相比, 连续持续持续持续 2周 (-8.75 3.84 和-58%±4.14),分别), 我们没有观察到这两个群体之间的显著差异。

图 1: 悬挂设备的说明以及如何从 HLU 转换为 PWB.(A) 根据我们以前的设计, 我们使用了一个位于保持架顶部的铝杆, 以固定一个固定在连杆中心的钥匙圈 (箭头 1)、一个不锈钢链 (箭头 2) 和两个旋转的圆把扣 (箭头 3) 组成的稳定悬挂装置。(B) 要将悬挂装置转换为 PWB, 请使用底部旋转卡扣连接三角形结构。这一块是由不锈钢链和聚氯乙烯 (PVC) 后杆, 位于鼠的脊椎上方 (箭头 1)。在后杆的每一侧都有一个扣子, 分别连接到马具和夹克上 (箭头 2)。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 使用骨盆线束进行下肢卸荷.(A) 用于支撑动物后肢的线束结构的正面和侧面视图图纸。(B) 骨盆线束按描述的位置固定在大鼠的后肢周围。不锈钢连接处位于尾部, 并连接到旋转扣上。马具的确切位置和形状在动物之间可能会有所不同, 但老鼠应该是舒适的, 它们的后肢必须永远不要接触地面。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 部分负重.部分卸荷需要给动物增加一件夹克, 以支撑前肢。然后用后胸罩扩展器关闭夹克, 并将钩子连接到扩展器上, 位于肩骨之间。夹克和骨盆线束都连接到位于后杆两端的扣子上。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4: 暴露在不同卸载水平下的动物的纵向随访实例.(A) 体重 (bw) 变化。每周称动物体重, 没有马具或夹克, 体重记录。PWB100 = 正常载荷下的部分重量轴承;PWB40 = 正常载荷40% 时的部分重量轴承;HLU-PWB40 = 一周的后肢卸除, 然后是一周的 PWBB40。Tukey 在双向堆叠方差分析后进行的临时测试结果为 *: p < 0.05、* *: p < 0.01、* * *: p < 0.001 和 * * *: p < 0.0001 vs pwb100. (B) 改变后爪抓地力。每周、后爪抓地力进行测量, 结果以每只动物与基线的百分比变化表示。Tukey 在双向堆叠方差分析后进行的临时测试结果为 * * *: p < 0.001 和 * * * *: p &LT; 0.0001 诉 pwb100, α:p < 0.05 VS pwb40. (C) 14天后肌肉湿质量。肌肉湿质量记录在一个精确的规模后, 立即牺牲后, 在14天。结果显示为年龄匹配对照组 (PWB100) 中获得的湿质量的百分比。S = 索莱乌斯;G = Gastrocnemius;TA = 胫骨前部。图基在单向方差分析后的临时测试结果为 *: p < 0.05、* *: p < 0.01 和 * * * * p &LT; 0.0001 VS pwb100. 请点击这里查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。