利用后肢悬吊和部分负重模拟大鼠火星太空任务

摘要

通过使用一种创新的地面类比模型，我们能够模拟大鼠的太空任务，包括前往（0 g）和在火星（0.38 g）停留的过程。该模型可对任务期间两个低重力阶段所发生的生理变化进行纵向评估。

摘要

啮齿类动物地面模型被广泛用于研究太空飞行对生理系统产生的生理影响，自1979年后肢卸载（HLU）模型建立以来已被常规使用。然而，下一步的太空探索计划包括前往火星，那里的重力仅为地球重力的38%。由于尚无人类体验过这种程度的部分重力环境，因此有必要建立一种可持续的地面模型，以研究机体在微重力环境中已受损的情况下，对这种部分负荷的反应。在此，我们采用创新的部分负重（PWB）模型，模拟一次短期火星任务及停留过程，以评估按顺序施加两种不同水平减重条件下后肢肌肉所诱发的生理功能损害。该模型有望为研究骨骼肌肉系统对重力变化的适应性提供一种安全的地面研究平台，并为制定有效对抗措施以保护宇航员健康与功能奠定基础。

引言

月球和火星等地外目标代表着人类太空探索的未来，但这些天体的引力均显著弱于地球。尽管失重对宇航员^1,2,3,4,5以及啮齿类动物^6,7,8,9骨骼肌肉系统的影响已得到广泛研究——后者主要得益于成熟的后肢悬吊（hindlimb unloading, HLU）模型¹⁰，但关于部分重力环境影响的研究仍十分有限。火星引力约为地球的38%，已成为长期探索的重点目标¹¹；因此，明确在此类环境下可能发生的肌肉改变至关重要。为此，我们此前建立了一种大鼠的部分负重（partial weight bearing, PWB）模型¹²，该模型基于小鼠中的前期研究^6,13，并已通过肌肉和骨骼指标得到验证。然而，前往火星的探索任务之前将经历一段长时间的微重力环境，而我们此前描述的模型¹²并未涵盖这一阶段。因此，在本研究中，我们对模型进行了改进，以模拟前往火星的旅程：包括第一阶段的完全后肢悬吊，紧接着进入第二阶段，在相当于正常负荷40%的条件下进行部分负重。

与大多数后肢卸载（HLU）模型不同，我们选择使用骨盆吊具（基于Chowdhury等人⁹所描述的设计），而非尾部悬吊，以提高动物的舒适度，并能够从HLU状态无缝且轻松地转换为部分体重支撑（PWB）状态，整个过程仅需几分钟。同时，我们采用了先前开发并详细描述过的笼具和悬吊装置¹²。除了可提供可靠且一致的数据外，我们此前还证明，悬吊系统在横杆中心位置的固定连接点并不会妨碍动物活动、理毛、进食或饮水。本文将介绍如何对动物的后肢进行完全和部分卸载，验证其所达到的重力水平，以及如何通过握力和湿肌质量来功能评估由此引起的肌肉变化。该模型对于研究部分重力（无论是人工模拟还是地外环境）对已受损肌肉骨骼系统影响的研究人员极为有用，可帮助他们探究生物体如何适应部分重加载，并有助于开发在人类太空飞行期间及之后维持健康的防护措施。

方案

本研究所述所有方法均经贝斯以色列女执事医疗中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，方案编号为067-2016。

注意：使用14周龄的雄性Wistar大鼠（以第0天为基线）。大鼠在基线前24小时单独饲养于定制笼具中，以适应环境。

1. 后肢悬吊

注意：骨盆固定带可应用于麻醉或清醒的动物。此处所述方案基于麻醉动物进行。操作动物时应穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

1. 将大鼠放入麻醉盒中，使用3.5%异氟烷和2 L/min的氧气流进行麻醉。
   注意：当用力捏压后肢足掌无反应时，表明麻醉已充分。
2. 待动物完全麻醉后，将大鼠仰卧置于操作台面上，通过鼻罩持续给予2%异氟烷和1.5 L/min的氧气流。
3. 将大鼠置于俯卧位，并以头尾方向的运动方式佩戴骨盆吊具。
4. 轻柔弯曲骨盆吊具以确保贴合，同时注意避免挤压后肢，以防造成擦伤或不适。
5. 将带有旋转扣的不锈钢链条连接至骨盆吊具顶部，并将挂钩固定于尾根部。
6. 将大鼠移出麻醉状态，并将其置于特制笼中，链条完全伸展至最大长度。
7. 待大鼠完全清醒并能够活动后，通过上方的旋转扣逐步缩短链条，直至后肢无法接触笼底。
8. 观察动物数分钟，评估其舒适度，并确保在任何时候双侧后肢均完全不受力。

2. 部分负重

注意：此步骤可在清醒或麻醉的动物中进行。

1. 通过添加由不锈钢链条和背杆组成的三角形部件，将 HLU 悬吊装置改装为 PWB 悬吊装置。
2. 按照 HLU 所述相同步骤（步骤 1.1 和 1.2）对动物进行麻醉。
3. 将合适尺寸的牵引背心套在大鼠前肢上（体重 400 g 及以下使用 M 号，体重超过 400 g 使用 L 号），并使用背部背扣延长器将其固定。
4. 将三角形部件的一端卡扣连接至背部背扣延长器上的挂钩，另一端卡扣连接至位于尾基部骨盆 harness 上的挂钩。
5. 将动物放回笼中使其从麻醉中恢复。清醒后，通过缩短链条并根据需要调整底部旋转卡扣的位置，确认前后肢悬吊受力均匀。
   注意：此步骤也可使用测力板来验证各肢体受力是否相等。
6. 将大鼠置于秤上，记录“负载”体重，即动物与整个装置的总重量，此时不缩短链条。
7. 逐渐缩短链条，直至秤显示“负载”体重的 40%，并记录此时达到的重力水平（以无负载重量与负载重量之比表示）。
8. 观察动物，确保无负载重量稳定，且大鼠四肢受力均匀。
9. 使用背杆将整个装置从秤上取下，并将大鼠放回其笼中。

3. 后肢抓握力评估

1. 用传统固定方法握住大鼠，一只手置于前肢下方，另一只手轻轻抓住尾巴。
2. 让大鼠的后肢接近握力杆，确保两只后肢完全放在杆上。
   注意：如果大鼠未能完全握住杆，或无任何主动握持迹象，可轻微放松固定。若此操作无效，应将大鼠放回笼中，数分钟后再次尝试。
3. 轻轻将大鼠沿直线向后拉动，直至其松开握力杆，记录传感器显示的最大拉力值。
4. 每次测量之间等待约30秒，并重复测试3次。
5. 为排除疲劳影响，取三次测量结果的平均值作为评分依据。

4. 肌肉湿重的测定

1. 将大鼠放入 CO₂ 安乐死舱中。根据 IACUC 和 AVMA 指南等待适当时间后，通过视觉观察确认呼吸停止以确定安乐死完成。
2. 将大鼠俯卧位放置于解剖台上，使用小型解剖剪在踝关节附近切开，去除毛发和皮肤。用手将皮肤层撕下。
3. 使用小型解剖剪轻轻撕开肌筋膜，分离跟腱。
   注意：跟腱是比目鱼肌和腓肠肌的附着点。
4. 用小型镊子夹住跟腱的同时，使用解剖剪将腓肠肌和比目鱼肌与上方的股二头肌分离。
5. 分离完成后，在腘窝区域切断腓肠肌和比目鱼肌的附着点。
6. 轻轻将比目鱼肌从腓肠肌上拉开，并通过切断跟腱将其完全分离。
7. 将大鼠转为仰卧位。小心去除筋膜，并从踝部开始向上剥离胫骨前肌。
8. 在胫骨前肌的上端附着点处将其切断。
9. 使用去皮的精密天平和称量舟，记录每块切除肌肉的精确湿重。

结果

利用我们先前设计并详细描述的新笼具¹²，我们采用了一种基于不锈钢链条的悬挂装置，适用于后肢悬吊（HLU，图1）和部分负重（PWB，图2）。本设计的关键优势在于可在数分钟内从一种卸载模式切换至另一种模式，同时保持动物所处环境完全一致。我们使用一种定制的骨盆吊具（图2A），其通过单根定制不锈钢链条连接，链条两侧配有旋转扣环，用于实施HLU。为了将该悬挂装置改装为PWB模式，仅需增加一个三角形不锈钢链条部件，该部件包含一根刚性背杆，设计位置位于动物脊柱正上方（图3）。上述操作可在清醒或麻醉状态下的动物中进行。

通过本实验提供的多功能环境，我们能够成功地对所有实验动物进行7天的...

讨论

该模型是首个为研究连续机械卸载水平而开发的地面模拟系统，旨在模拟前往火星及在火星停留的过程。

该方案的许多步骤对于确保其成功至关重要，需要密切观察。首先，必须监测动物的健康状况，确保其行为正常（例如进食、休息和探索等活动），尤其是在部分体重支撑（PWB）状态下，此时动物维持相对正常的生理姿态。其次，尽管PWB状态在时间上极为稳定且所需人为干预极少^12,14，仍必须记录所实现的部分重力水平，以尽量减少个体动物之间的差异。此外，当动物从完全机械卸载转为部分重力（PWB40）时，已表现出明显的肌肉萎缩和功能丧失^6,9,15，这可能导致其在恢复四足负重行为时出现短暂困难，并表现为暂时性的步态异常。

由于环境条件的可变性，可能会出现多种...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
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2 件定制亚克力板墙	P&K Custom Acrylics Inc.	N/A	2 块透明定制亚克力板墙，厚度 3/16"，宽度 12 3/16"，高度 18 13/16"，墙顶部中央设有一个直径为 0.25 英寸的圆形槽
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