利用稀有密码子富集标记鉴定氨基酸过量生产菌株

摘要

本研究提出了一种替代传统基于毒性类似物方法的新策略，通过使用稀有密码子富集的标记物，同时实现氨基酸高产菌株鉴定的准确性、灵敏度和高通量。

摘要

为了满足日益增长的氨基酸市场需求，需要高性能的生产菌株。传统上，氨基酸过量生产菌株的筛选依赖于氨基酸与其类似物之间的竞争作用。然而，这种基于类似物的方法准确性较低，且适用于特定氨基酸的类似物种类有限。本文提出一种替代策略，利用富含稀有密码子的标记基因，实现对氨基酸过量生产菌株的高准确性、高灵敏度和高通量筛选。该策略基于蛋白质翻译过程中存在的密码子使用偏好现象：根据密码子在编码DNA中的出现频率，可分为常见密码子和稀有密码子。稀有密码子的翻译依赖于其对应的稀有转运RNA（tRNA），而在氨基酸缺乏条件下，这些tRNA无法被相应的氨基酸完全荷载。理论上，当目标氨基酸在荷载同义的常见tRNA后仍有富余时，稀有tRNA便可被有效荷载，从而恢复因稀有密码子导致的翻译延迟。基于这一原理，通过在抗生素抗性基因或编码荧光蛋白、显色蛋白的基因中，将目标氨基酸的常见密码子替换为其同义的稀有密码子，构建出用于筛选氨基酸过量生产菌株的选择或筛选系统。我们证明，引入稀有密码子可显著抑制蛋白表达，且蛋白表达水平与相应氨基酸浓度呈正相关。利用该系统，可从突变文库中高效筛选出多种氨基酸的过量生产菌株。这种基于稀有密码子的策略仅需单个修饰基因，且与其它方法相比，宿主菌更难以逃逸筛选压力。该方法为获得氨基酸过量生产菌株提供了一种新的有效途径。

引言

目前氨基酸的生产主要依赖发酵工艺。然而，大多数氨基酸生产菌株的滴度和产量仍低于全球价值数十亿美元的氨基酸市场不断增长的需求^1,2。获得高性能的氨基酸过量生产菌株对于提升氨基酸产业水平至关重要。

传统策略通过氨基酸与其类似物在蛋白质合成中的竞争作用来鉴定氨基酸过量生产菌株^3,4。这些类似物能够负载到识别相应氨基酸的tRNA上，从而抑制肽链的延伸，导致生长停滞或细胞死亡⁵。抵抗类似物胁迫的一种方式是提高细胞内氨基酸的浓度。富集的氨基酸将与类似物竞争有限的tRNA，确保功能蛋白的正确合成。因此，能够在类似物存在下存活的菌株可被筛选出来，并很可能为相应氨基酸的过量生产者。

尽管基于类似物的筛选策略在选育亮氨酸（L-leucine）等氨基酸的高产菌株方面已被证明是成功的⁶，但该策略存在严重缺陷。一个主要问题是突变过程中或自发突变导致的类似物抗性。具有抗性的菌株可通过阻断、外排或降解类似物的方式逃逸筛选⁵。另一个问题是类似物对其他细胞过程产生的毒性副作用⁷。因此，能够在类似物筛选中存活的菌株未必是目标氨基酸的高产菌株，而真正所需的高产菌株可能因这些不利的副作用而被错误淘汰。

在此，提出一种基于密码子偏好性规律的新策略，以实现对氨基酸过量生产菌株的准确快速鉴定。大多数氨基酸由多个不同的核苷酸密码子编码 宿主生物以不同方式偏好的三联体^8,9某些密码子在编码序列中很少被使用，被称为稀有密码子。这些密码子翻译为氨基酸依赖于携带相应氨基酸的同源tRNA。然而，识别稀有密码子的tRNA通常比识别常见密码子的tRNA丰度低得多。^10,11因此，这些稀有tRNA在与其他同工受体竞争游离氨基酸时，捕获氨基酸的可能性较低；当氨基酸含量受限时，富含稀有密码子的序列的翻译开始减缓，甚至可能终止。¹⁰理论上，如果由于过量表达或额外补充相应的氨基酸，导致同义的普通tRNA在充电后出现氨基酸过剩，则这些翻译可能被恢复。¹²如果富含稀有密码子的基因编码一种筛选或选择标记，则可轻松识别出具有相应表型的菌株，这些菌株很可能为目标氨基酸的过量生产者。

上述策略可用于建立筛选和鉴定氨基酸高产菌株的选择与筛选系统。选择系统采用抗生素抗性基因（如 kan^R）作为标记，而筛选系统则采用编码荧光蛋白（如绿色荧光蛋白 [GFP]）或显色蛋白（如 PrancerPurple）的基因。在这两个系统中，标记基因均通过将目标氨基酸的常见密码子替换为其同义的稀有密码子，且替换数量经过明确定义。在突变文库中，携带富含稀有密码子标记基因的菌株可在适当条件下进行选择或筛选，从而快速识别出目标氨基酸的高产菌株。该工作流程首先构建富含稀有密码子的标记基因系统，随后优化实验条件，最终实现氨基酸高产菌株的鉴定与验证。这种无需依赖类似物的策略基于蛋白质翻译的基本原理，并已在实践中被证实可准确、快速地鉴定氨基酸高产菌株。理论上，该策略可直接应用于具有稀有密码子的氨基酸以及所有微生物。总之，当特定氨基酸缺乏合适类似物，或假阳性率较高成为主要问题时，基于稀有密码子的策略可作为传统类似物依赖方法的一种高效替代方案。以下实验方案以亮氨酸的稀有密码子为例，演示该策略在鉴定大肠杆菌（Escherichia coli）L-亮氨酸高产菌株中的应用。

方案

1. 表达稀有密码子富集标记基因的质粒构建

1. 选择一个包含适量目标氨基酸常见密码子的标记基因。
   注意：对于L-亮氨酸，使用含有29个亮氨酸密码子（其中27个为常见密码子）的卡那霉素抗性基因kan^R来构建筛选系统¹³。对于筛选系统，则使用绿色荧光蛋白基因gfp（19个亮氨酸密码子中包含17个常见密码子）或紫色蛋白编码基因prancerpurple（ppg）（含有14个亮氨酸常见密码子）（补充表1）。
2. 将标记基因中的常见密码子替换为同义稀有密码子。对于L-亮氨酸，将其在kan^R、gfp或ppg中的密码子替换为稀有密码子CTA，分别生成kan^R-RCs、gfp-RC或ppg-RC¹³（补充表1）。
   注意：标记基因中稀有密码子的频率将影响筛选或筛选系统的严格性。通常，增加稀有密码子的数量会提高筛选或筛选系统的严格性。为了获得适当的筛选或筛选强度，可设计一系列含有不同数量稀有密码子的标记基因，并比较其效果。
3. 使用GeneDesign¹⁴（http://54.235.254.95/gd/）等工具生成富含稀有密码子的标记基因的构建模块，用于基因合成。或者，可直接向商业基因合成服务公司订购这些标记基因。
   1. 在GeneDesign页面上，选择构建模块设计（恒定长度重叠）。
   2. 将富含稀有密码子的标记基因序列粘贴到序列框中。
   3. 定义组装寡核苷酸之间的重叠长度；请注意，默认的40 bp适用于大多数序列。
      注意：有关其他参数设置的更多说明，请参阅在线手册。
   4. 点击设计构建模块按钮，并订购页面上列出的寡核苷酸。
4. 通过基于聚合酶链式反应（PCR）的精确合成方法合成经稀有密码子修饰的基因¹⁵。
5. 将富含稀有密码子的kan^R-RC连接至载体pET-28a，gfp-RC连接至pSB1C3，ppg-RC连接至CPB-37-441¹⁶。
   注意：pET-28a和pSB1C3质粒图谱可在SnapGene在线质粒数据库中获取（补充表1）；CPB-37-441质粒图谱可在ATUM显色蛋白网站上获取。
   1. 在冰上，将载体和标记基因片段以1:1的摩尔比加入7.5 μL的组装混合液中（见材料表），总体积为10 μL。将样品在50 °C孵育1小时。
   2. 取5 μL组装产物转化至50 μL感受态细胞中（见材料表），42 °C热激30秒。
   3. 在SOC（含分解代谢抑制的超级优化肉汤）培养基中37 °C恢复1小时，涂布于LB（溶菌肉汤）琼脂培养基上，37 °C过夜培养。
   4. 挑取单菌落接种至LB培养基中，37 °C培养8小时。
   5. 使用优选的商业化试剂盒提取质粒。

2. 优化筛选条件

1. 将用于诱变的亲本菌株制备成感受态细胞¹⁷。
2. 取50 μL感受态细胞，加入1 μL携带野生型kan^R的质粒进行转化；另取一组感受态细胞，用携带所有亮氨酸密码子被稀有密码子CTA替换的kan^R-RC29质粒进行转化。
3. 加入950 μL SOC培养基，将样品在37 °C、250 rpm条件下振荡培养1小时。
4. 取100 μL菌液涂布于含有50 μg·mL^-1卡那霉素的LB琼脂培养基上，37 °C培养约8小时，直至菌落出现。
5. 挑取含有野生型kan^R和富含亮氨酸稀有密码子的kan^R-RC29的菌落，分别接种于5 mL五倍稀释的LB培养基（0.2x LB）中，培养基中含50 μg·mL^-1卡那霉素。将样品在37 °C、250 rpm条件下振荡培养。
   注：培养基对该筛选系统至关重要。其碳源和氮源含量应仅足以支持野生型基因表达抗生素抗性蛋白，而不足以支持稀有密码子修饰后的衍生基因表达。在此情况下，1x LB培养基中的L-亮氨酸浓度过高，无法完全抑制富含稀有密码子的kan^R基因的蛋白表达。因此，使用稀释5倍的LB培养基可使野生型基因与富含稀有密码子基因之间的蛋白表达差异更加明显。
6. 在设定的时间点（例如8小时、16小时和24小时），将每种菌液各200 μL以三个重复加入96孔板中。使用酶标仪测定OD₆₀₀（600 nm处的光密度）。
   注：若无法检测到携带富含稀有密码子标记基因的菌株其OD₆₀₀低于携带野生型标记基因菌株的OD₆₀₀，可尝试增加标记基因中稀有密码子的数量，或使用更稀释的培养基。
7. 进行氨基酸补加实验，检测通过提高目标氨基酸浓度是否可恢复富含稀有密码子标记基因（例如kan^R-RC29）的表达。
   注：对于L-亮氨酸过量生产菌株的筛选，应使用L-亮氨酸进行补加。
   1. 将携带kan^R-RC29标记基因的菌株分别接种于5 mL 0.2x LB培养基（含50 μg·mL^-1卡那霉素）中，一组添加1 g·L^-1 L-亮氨酸，另一组不添加。另取5 mL 0.2x LB培养基接种携带野生型kan^R的菌株作为对照。将样品在37 °C、250 rpm条件下振荡培养。
   2. 在设定的时间点（例如15小时、17小时、19小时和22小时）测定各菌液的OD₆₀₀。

3. 优化筛选条件

1. 将50 μL用于诱变的亲本菌株与1 μL携带野生型gfp或野生型ppg的质粒（约50 ng·μL^-1）共转化。同时，将亲本菌株与含有稀有密码子富集的标记基因衍生物的质粒进行转化。
2. 加入950 μL SOC培养基，于37 °C、250 rpm条件下在摇床中孵育1小时。
3. 取100 μL菌液涂布于含有适当抗生素的LB琼脂培养基上（携带带有cm^R标记的gfp质粒时使用25 μg·mL^-1氯霉素，携带带有kan^R标记的ppg质粒时使用50 μg·mL^-1卡那霉素），于37 °C过夜培养。
4. 分别挑取一株含有野生型gfp或ppg的单菌落，以及一株含有相应稀有密码子富集型衍生物的单菌落，各自接种至5 mL适当稀释的LB液体培养基中。于37 °C、250 rpm摇床中孵育。
   注：对于携带亮氨酸稀有密码子富集型gfp-RC或ppg-RC的E. coli菌株，可使用未稀释的LB培养基（1x LB），以显著增强野生型与稀有密码子富集型标记基因表达水平之间的差异。此外，筛选标记基因的表达由诱导型启动子驱动。为获得更佳的区分效果，应在细胞进入对数生长期时开始诱导。
5. 对于荧光标记，于设定时间点（例如2 h、4 h和6 h）分别取200 μL菌液，每组设三个重复，加入96孔透明底黑色板中。测定OD₆₀₀和荧光值，并计算荧光强度（荧光值与OD₆₀₀的比值）。对于显色标记，测定菌液的颜色发育情况。
   注：若携带gfp-RC的菌株其荧光强度低于携带野生型gfp的菌株时无法被检测到，或表达来自ppg-RC的紫色蛋白的细胞其颜色较来自野生型基因的更浅却无法分辨，可尝试增加标记基因中稀有密码子的数量，或使用更稀释的培养基。
6. 进行喂养实验（参见步骤2.7.1和2.7.2）。在设定时间点（例如12 h、18 h和24 h）测定荧光强度或颜色发育情况。

4. 鉴定氨基酸过量生产菌株

1. 取100 μL突变株培养物接种于5 mL LB培养基（2% v/v）中，在37 °C、250 rpm条件下振荡培养，直至OD₆₀₀值达到0.4。
2. 将突变株制备成感受态细胞¹⁷。
3. 向50 μL突变株感受态细胞中加入1 μL质粒（~50 ng·μL^-1），该质粒携带筛选标记kan^R-RC29或报告标记gfp-RC或ppg-RC。随后加入950 μL SOC培养基，在37 °C振荡培养1小时。
4. 筛选氨基酸高产菌株。
   1. 将菌液在4,000 × g条件下离心5分钟，弃上清，加入含50 μg·mL^-1卡那霉素的5 mL 0.2× LB培养基，于37 °C振荡过夜培养。
   2. 取过夜培养物适量（例如100 μL，根据菌液密度调整）涂布于含50 μg·mL^-1卡那霉素的0.2× LB琼脂平板，37 °C培养12小时。
      注：形成的菌落为潜在的目标氨基酸高产菌株，在本实验中即L-亮氨酸高产菌株。
5. 对氨基酸高产菌株进行筛选。
   1. 将携带报告标记的适量菌液（例如100 μL，见步骤4.3）涂布于含相应抗生素的LB琼脂平板（使用gfp-RC时添加25 μg·mL^-1氯霉素，使用ppg-RC时添加50 μg·mL^-1卡那霉素），37 °C培养8小时。
   2. 从平板上挑取单菌落，分别接种至含相应抗生素的LB液体培养基（参见步骤4.5.1），于37 °C、250 rpm条件下振荡培养。
   3. 若使用gfp-RC，则测定OD₆₀₀和荧光强度，并计算单位细胞的荧光强度；若使用ppg-RC，则观察菌液显色情况。注意，荧光强度高于亲本菌株或显色更深的菌株为候选氨基酸高产菌株，在本实验中即L-亮氨酸高产菌株。
      注：当使用富含稀有密码子的荧光蛋白基因进行筛选时，荧光激活细胞分选技术也可用于鉴定单细胞水平的高产菌株。
6. 验证候选菌株的氨基酸生产能力。
   1. 将各候选菌株分别接种于5 mL LB培养基中，在37 °C、250 rpm条件下振荡过夜培养。
   2. 取1 mL菌液在4,000 × g条件下离心2分钟，弃上清，用1 mL无菌水重悬菌体沉淀。
   3. 取200 μL菌悬液接种至含4%葡萄糖的20 mL M9培养基中，在250 mL摇瓶中于37 °C、250 rpm条件下振荡培养24小时。
   4. 取1 mL培养液在4,000 × g条件下离心5分钟，取200 μL上清转移至洁净的1.5 mL离心管中。同时配制L-亮氨酸标准溶液（HPLC级），浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5和1 g·L^-1。
   5. 向上清液及标准品中各加入100 μL 1 mM三乙胺和100 μL 1 M苯基异硫氰酸酯，轻轻混匀后室温孵育1小时¹⁸。
      警告：三乙胺和苯基异硫氰酸酯可导致严重皮肤灼伤和眼部损伤，吸入有害。操作时应佩戴手套和口罩，尽可能在通风橱中进行。
   6. 向同一试管中加入400 μL正己烷，涡旋振荡10秒。用0.2 μm聚四氟乙烯膜过滤下层含有氨基酸衍生物的水相。
      警告：正己烷可引起皮肤刺激。操作时应佩戴手套和防护服。若接触皮肤，应立即用大量清水冲洗。
   7. 将0.1 M醋酸钠溶液（pH 6.5）与乙腈按99.3:0.7的体积比混合，配制流动相A；以80% v/v乙腈水溶液作为流动相B。所有流动相均需经0.2 μm聚四氟乙烯膜过滤。
      警告：乙腈吸入有害，可引起皮肤和眼睛刺激。操作时应佩戴手套和防护服，并在通风橱中进行。
   8. 采用C18色谱柱的超高效液相色谱仪，按照表1中的洗脱程序，以0.42 mL·min^-1流速和40 °C柱温进样1 μL样品。使用二极管阵列检测器在254 nm波长下检测目标氨基酸，并通过标准曲线法根据峰面积计算其浓度。

时间（分钟）	流动相 A（%）	流动相 B（%）
0	98	2
3.5	70	30
7	43	57
7.1	0	100
11	98	2

表1：氨基酸定量的洗脱程序。

结果

在筛选系统中，与携带野生型抗生素抗性基因的菌株相比，携带富含稀有密码子的抗生素抗性基因的菌株在适宜培养基中培养时，其OD₆₀₀应出现显著下降（图1a）。在相同条件下，随着抗生素抗性基因中稀有密码子数量的增加，细胞OD₆₀₀的下降更加明显（图1a）。需要注意的是，稀有密码子对蛋白表达的抑制主要发生在营养匮乏条件下。因此，若LB培养基未被适当稀释，则携带富含稀有密码子标记基因的菌株与携带野生型基因的菌株相比，其细胞OD₆₀₀不会出现显著下降（图1b）。在额外补充相应氨基酸后，携带富含稀有密码子抗生素抗性基因的菌株的OD₆₀₀将显著上升，并接近携带野生型基因菌株的水平（图1c）。

讨论

标记基因中稀有密码子的数量以及选择或筛选培养基对于抑制稀有密码子修饰标记基因的蛋白表达至关重要。如果无法检测到野生型标记基因与其衍生基因之间蛋白表达的显著差异，则增加稀有密码子数量或使用营养受限培养基可能放大这种差异。然而，如果抑制效应过强，即使额外补充相应的氨基酸，蛋白表达也可能无法恢复。此时，应减少标记基因中的稀有密码子数量，以部分缓解压力。另一种精细调节选择或筛选严格性的方法是调整富含稀有密码子的标记基因的拷贝数和表达水平。通常，降低标记基因的拷贝数和表达水平可增强氨基酸过量生产菌株与初始菌株之间的区分度。因此，应使用含有低拷贝数复制起点（如 p15A 或 pSC101）以及弱启动子的载体。若标记基因由可诱导启动子驱动，则建议采用低强度诱导。

基于稀有密码子的氨基酸高产菌株筛选或选择策略，是对常用“密码子优化”策略的一种反向应用，后者旨在促进外源蛋白的表达。在密码子优化过程中，目标基因中的稀有密码子被宿主中对应的同义常见密码子所取代，从而使来自其他生物体的基因能够比含有大量稀有密码子的外源基因更快速地翻译成蛋白质¹⁹。因此，可以...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈	Thermo	51101
EasyPure HiPure 质粒小提试剂盒	Transgen	EM111-01
EasyPure 快速凝胶回收试剂盒	Transgen	EG101-01
Gibson 组装预混液	NEB	E2611S
异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷	Solarbio	I8070
L-亮氨酸	Sigma	L8000
酶标仪	Biotek	Synergy 2
正己烷	Thermo	H3061
苯基异硫氰酸酯	Sigma	P1034
PrancerPurple CPB-37-441	ATUM	CPB-37-441
TransStar FastPfu Fly DNA 聚合酶	Transgen	AP231-01
三乙胺	Sigma	T0886
超高效液相色谱仪	Agilent	1290 Infinity II
野生型 C. glutamicum	ATCC	13032
XL10-Gold E. coli 感受态细胞	Agilent	200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 色谱柱	Agilent	959759-902K