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一种在中低通量条件下鉴定影响培养哺乳动物细胞生长与存活化合物的策略

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DOI：

10.3791/59333

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2019年9月22日

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1National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), Neurotherapeutic Development Unit (NTDU), National Institutes of Health (NIH)

本文内容

摘要

通常需要评估一组化合物对培养细胞的潜在细胞毒性。本文介绍了一种在96孔板体系中可靠筛选有毒化合物的策略。

摘要

在研究可能具有治疗益处的药物时，细胞毒性是一个需要量化的关键参数。因此，许多药物筛选实验都将细胞毒性作为评估单个化合物的关键特征之一。培养中的细胞是一种有用的模型，可在进入成本更高、劳动更密集的动物模型研究之前，用于评估细胞毒性及后续有前景的先导化合物。本文描述了一种用于鉴定影响表达tdTomato的人类神经干细胞（NSC）系细胞生长的化合物的策略。该策略采用两种互补的检测方法来评估细胞数量：一种方法通过检测3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）还原为甲臜的程度来间接反映细胞数量，另一种方法则直接计数表达tdTomato的NSCs。这两种检测可在同一实验中同时进行，操作简便、快速且成本低廉。本演示中所述策略采用96孔板格式，在初步探索性筛选中测试了57种化合物的毒性。其中三个阳性结果进一步通过六点剂量反应实验进行表征，实验设置与初筛相同。除了能有效验证化合物毒性外，比较两种检测方法的结果还有助于识别影响细胞生长其他方面的化合物。

引言

确定具有治疗潜力的化合物对动物细胞的毒性，是其最重要的特性之一。该特性将决定一种药物是否适合作为深入研究的候选对象。大多数情况下，人们倾向于寻找毒性最小的化合物，但在某些情况下，能够杀死特定细胞类型的化合物也具有研究价值，例如抗肿瘤药物。尽管整体动物模型是评估系统性毒性的最佳体系，但当需要测试的化合物数量较多时，其成本和劳动投入过高，难以实施。因此，哺乳动物细胞培养通常被用作最有效的替代方法1,2。中小通量药物筛选是一种在细胞培养中评估毒性的关键手段。此类筛选可用于检测针对特定信号通路的注释化合物文库。此类筛选的一般流程为：首先在初步毒性筛选中以单一浓度（通常为 10 µM）测试文库中的所有化合物，然后对初筛中发现的阳性化合物进行深入的二次剂量-反应关系筛选，以全面表征其毒性特征。本文将描述实施该策略的具体方法，为识别和表征有毒化合物提供一种快速、高效且经济的途径。

已开发出多种方法用于评估小分子化合物和纳米材料对哺乳动物细胞的细胞毒性3,4需要注意的是，某些材料可能会与检测发生相互作用，从而产生误导性结果；因此在对毒性筛选中的阳性结果进行表征时，应测试此类相互作用。4细胞毒性检测包括台盼蓝排斥法5乳酸脱氢酶（LDH）释放实验6，Alamar blue检测7钙黄绿素乙酰甲酯（AM）8，以及ATP检测9所有这些检测方法均通过测量细胞代谢的不同方面来间接反映细胞数量。尽管这些方法各有优势，但基于四唑盐的检测法，如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）、2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑-5-羧苯胺内盐（XTT）和4-(3-[4-碘苯基]-2-[4-硝基苯基]-2H-5-四唑鎓)-1,3-苯二磺酸盐（WST-1），10,11 以低成本提供良好的准确性和易用性。本演示中将使用的 MTT 可被线粒体还原酶还原为不溶性的甲臜，该转化速率与细胞数量高度相关。该检测方法已被常规用于小规模实验，以及包含多达 2,000 种化合物的文库筛选。12通过标记物直接计数细胞是评估细胞数量的另一种方法，与MTT法不同，该方法可提供有关细胞生长动态的额外信息。目前已有多种公开可用的算法可用于自动细胞计数分析，此外，一些成像读板仪配套软件包中也包含专有的细胞计数算法。13,14在此方法描述中，使用了一株经基因编辑后持续表达tdTomato的人类神经干细胞（NSC）系15 将作为测试线，用于在评估57种测试化合物毒性的筛选实验中，比较MTT法与自动细胞计数法的细胞活力结果。尽管该策略的主要目标是鉴定和表征毒性化合物，但其额外优势在于可能识别出抑制生长或促进生长的化合物，从而为筛选能够调节细胞生长的药物提供一种有效方法。

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方案

1. NSC 培养

注意：下文将描述人类神经干细胞系的操作，但本方案可适用于任何细胞系。所有细胞培养操作均须在生物安全柜中进行。

  1. 用基底膜/细胞外基质（ECM）包被96孔板。
    1. 将一份ECM（材料表）在冰上解冻，以促进神经干细胞（NSC）的贴附。将ECM用10 mL基础培养基（材料表）稀释至适当浓度（通常为1:100），每孔加入50 µL，共加至96孔板的60个内圈孔中（图1）。仅使用内圈60个孔，以避免边缘效应可能引起的实验偏差16。
    2. 将板置于室温或细胞培养孵箱（37 °C，5% CO2）中静置至少30分钟。
  2. 消化并接种神经干细胞。
    注意：用于本方法的细胞应在T75培养瓶中培养至至少80%融合度。
    1. 在细胞培养孵箱（37 °C，5% CO2）中，使用神经干细胞培养基（含基础培养基、B27、非必需氨基酸、2 mM谷氨酰胺和10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（FGFb或FGF2））培养细胞。
    2. 当细胞达到80%融合度时，从孵箱中取出，吸除神经干细胞培养基。加入适量细胞消化试剂（T75培养瓶加3 mL；材料表），在孵箱中孵育5分钟。
    3. 孵育结束后，在T75培养瓶中加入7 mL神经干细胞培养基，用力吹打以确保所有细胞脱落。将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在200 × g 条件下离心5分钟。
    4. 离心后，弃去上清液，用10 mL神经干细胞培养基重悬细胞，并进行细胞计数。
    5. 用神经干细胞培养基将细胞浓度调整为200,000个细胞/mL。确保细胞充分重悬，以实现各孔接种的均一性。
    6. 将100 µL细胞悬液（含20,000个细胞）接种至三个已按第1.1节所述方法包被的96孔板的60个内圈孔中。使用八通道移液器的六个通道，按列逐列加样。
    7. 向所有未接种细胞的孔中加入100 µL基础培养基或神经干细胞培养基，以减少最外圈孔的潜在蒸发。
    8. 在细胞培养显微镜下，目视检查三个96孔板中至少10个孔，确认细胞接种密度符合预期。若细胞接种过稀或过密，则不应继续进行后续检测。

2. 用化合物处理细胞

注意：本演示中测试的自制文库包含可调节无翅型/整合型（Wnt）、视黄酸、转化生长因子-β（TGF-β）和 sonic hedgehog 信号通路以及多种酪氨酸激酶的化合物。

  1. 毒性/细胞数量初筛
    1. 将最多57种待测化合物（补充表1）以10 mM浓度溶于100%二甲基亚砜（DMSO）中，每种取50−100 μL分装至U型底、V型底或圆底96孔板的内部60个孔中，并设置3个仅含DMSO的孔作为对照（参见图1中的孔板布局）。此板作为母板化合物板，每孔含25 µL化合物溶液，可多次冻融使用。
      注意：不应使用平底板，因其在使用台式移液器吸取小体积化合物时更为困难。
    2. 在细胞传代后16–24小时，将细胞培养板从培养箱中取出，使用8通道多通道移液器（仅使用其中6个通道）逐列吸除NSC培养基。向三个重复板中的每块板的细胞中加入95 µL新鲜NSC培养基，并将板放回培养箱，直至完成下文步骤2.1.4。
    3. 使用8通道多通道移液器向另一个空的U型底、V型底或圆底96孔板的内部60个孔中各加入49 µL NSC培养基。打开母板化合物板，使用台式移液器或等效仪器从母板中吸取1 µL化合物，加入至该96孔板内部60个孔中各49 µL NSC培养基内。
    4. 使用台式移液器将稀释后的化合物上下吹打混匀3次。
    5. 将三块含NSC的96孔板从培养箱中取出，使用台式移液器吸取每种稀释后的化合物15 µL，并向每块板中各加入5 µL化合物溶液。
      注意：此步骤将化合物以1:20比例加入细胞，结合步骤2.1.3中的初始1:50稀释，最终实现1:1000的总稀释倍数，使NSC上的化合物终浓度为10 µM，DMSO终浓度为0.1%；DMSO对照组的终浓度也为0.1%。
    6. 将细胞与化合物共同孵育72小时，随后进行细胞毒性检测。可采用更短的孵育时间，但72小时孵育期有助于最大化检测所测试化合物的潜在细胞毒性效应。
  2. 剂量反应实验
    注意：用于剂量反应实验的96孔板设置如 图2所示。
    1. 使用第2列设置6个DMSO对照重复，并对最多三种不同化合物进行三重复测试，每种化合物进行六梯度的两倍系列稀释，起始高剂量为10 µM。
    2. 将4 µL DMSO或测试化合物（溶于DMSO）加入196 µL NSC培养基中，置于1.5 mL微量离心管内。使用移液器向B2–G2列的孔中各加入25 µL DMSO，向B3–B11行中各加入50 µL测试化合物；三种待测化合物以10 mM浓度分别在B3–B5、B6–B8和B9–B11行中设置三重复。
    3. 向96孔板内部其余空列中各加入25 µL NSC培养基。使用多通道移液器从B3–B11孔中吸取25 µL化合物溶液，加入C3–C11孔中，并至少吹打混匀5次。重复此操作至后续各列，为每种化合物生成共六梯度的两倍稀释三重复体系。
    4. 剂量反应实验所用NSC的制备方法与2.1节中初筛实验完全相同。剂量反应所用化合物的添加及细胞孵育步骤均按2.1.5和2.1.6所述操作。
      注意：通过在不同传代次数、不同日期重复实验，共进行三次生物学重复的剂量反应检测。

3. 在酶标仪上对细胞进行成像

  1. 在细胞与化合物孵育指定时间后，使用酶标仪对细胞进行成像，以确定每个孔的处理前细胞数量。
    注意：细胞成像的具体操作步骤因仪器而异，但通常遵循相似的策略。以下说明适用于本实验所用的仪器（材料表）。
  2. 将培养板从培养箱中取出，放入酶标仪中。打开成像软件，为本研究设置实验方案和实验文件。在任务管理器中进入成像仪手动模式，然后点击立即捕获…。
  3. 选择96孔板作为容器类型，放大倍数设为10倍，选择红色荧光蛋白（RFP）531和593通道用于成像tdTomato。选择一个孔，点击自动对焦以调整图像焦点，点击自动曝光以获得合适的曝光时间。如有需要，可手动调整对焦和曝光参数。
  4. 在获得合适的对焦和曝光后，点击相机图标以捕获图像。然后点击图像上方的处理/分析以继续构建实验方案，并选择“分析”选项卡。
  5. 在图像右侧的“添加分析步骤”中点击细胞分析，然后点击“开始”。图像将显示被高亮标记的细胞，以标识每一个单独的细胞。可点击“选项”以调整参数，根据荧光强度阈值或细胞大小更准确地识别细胞。若成像仪能正确计数细胞，则点击屏幕底部的“添加步骤”。
  6. 点击屏幕顶部的图标以从图像集创建实验，系统将打开一个包含实验设置的窗口。打开后，点击“方案”选项卡下的程序，在新窗口中选择读取，然后在下一个窗口中点击“整块板”以仅选择包含细胞的60个孔（B2...G11）。点击确定保存更改，然后点击“程序”窗口中的确定。
  7. 现在可使用该方案对培养板进行成像，并保存实验文件。点击播放图标以运行培养板。第一块板成像完成后，继续对另外两块板进行成像。成像结束后，将细胞计数数据下载至电子表格中进行分析。所有图像均以10倍放大倍数采集。

4. 终点 MTT 细胞毒性检测

注意：完成 tdTomato 成像后两小时内开始 MTT 检测。

  1. 称取25 mg MTT，溶于5 mL NSC培养基中，配制成5 mg/mL的MTT储存液。涡旋振荡溶液直至无可见MTT沉淀，可能需要数分钟。
  2. 从培养箱中取出细胞培养板，吸除培养基。将MTT用细胞培养基按1:10稀释，每孔加入100 µL。
  3. 在37 °C孵育2小时。孔中应出现紫色沉淀，其量大致与细胞数量成正比。用移液器吸除MTT溶液，或快速倒置培养板将溶液甩出。
  4. 每孔加入50 µL 100% DMSO，在室温下以400 rpm振荡10分钟。使用酶标仪在595 nm波长下测定各孔吸光度，并将数据导出至电子表格进行分析。

5. 数据分析

  1. 使用适当的软件（商业电子表格软件、R）对tdTomato细胞计数和吸光度进行分析。计算每块板上三个DMSO重复样本的吸光度或细胞计数的平均值，用于归一化处理；然后将每孔的细胞计数或吸光度值除以该平均值，并转换为百分比形式。由此得到每块板相对于DMSO对照组的归一化细胞计数或吸光度。
  2. 计算三块板上重复孔的归一化计数或吸光度的均值及标准差。
    注意：此时应得到四组不同的归一化数值：每块板各一组，以及三块重复板的总体均值一组。
  3. 采取保守策略，若某化合物在三块重复板上的平均归一化值≤25%，则将其归类为有毒。此外，由于每块板上每种化合物仅进行一次处理，因此只有在三块重复板上均低于该阈值的化合物才标记为有毒。对本分析筛选出的所有潜在有毒化合物，应检查其荧光图像，以视觉确认毒性表现。
    注意：在此类探索性检测中，由于每块板缺乏重复实验，评估具有生长抑制或促进作用的化合物较为困难。但以下方法可快速识别可能减缓或促进细胞生长的化合物。
  4. 计算每块板上三个重复DMSO对照组的标准差，筛选出平均值比DMSO对照组高或低至少两个标准差的任何化合物。在三块板上均通过该筛选条件的化合物可能值得进一步研究。
  5. 对剂量反应实验采用与初步毒性筛选相同的分析策略。计算每个生物学重复中DMSO对照组的平均值，并用这些值对每种化合物/剂量组合的活细胞百分比或吸光度百分比进行归一化处理。计算三组生物学重复中所有化合物/剂量组合的均值及其均值的标准误差。
  6. 将浓度转换为其对数值，绘制浓度对数值与归一化存活率的关系剂量反应曲线，并通过非线性回归分析拟合曲线（可在R或多种商业统计软件包中完成分析）。根据该曲线方程计算致死剂量50（或严格来说，本实验中的存活剂量50），即导致50%毒性的化合物浓度。许多软件包可自动计算此数值。

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结果

自动细胞计数数据鉴定出11种化合物在归一化至DMSO对照后存活率低于25%，而MTT数据除这11种化合物外还额外鉴定出两种化合物（表1 和 表2，红色阴影部分）。仅在MTT检测中显示具有毒性的两种化合物（F3孔和G10孔）的tdTomato阳性细胞数量分别为对照组的31%和39%，按毒性排序，在该化合物库中仅次于已判定为有毒的化合物，位列其后两位。这两个孔的标准差数值未提示三块板之间存在显著离群值从而影响平均值，且在分别查看三块重复板的数据时，这两种化合物在任一板上均未低于25%的阈值（数据未显示）。多个孔的tdTomato荧光代表性图像见图3。对MTT检测与细胞计数检测在毒性判断上存在差异的两个孔进行图像分析后发现，F3孔（图3B）和G10孔（图3C）中的化合物均具有毒性，尽管在三块重复板中有一块板的G10孔内残留少量活细胞...

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讨论

本文的主要目标是描述一种能够高效且低成本地在低至中等通量筛选中鉴定影响细胞生长化合物的策略。研究采用了两种正交技术来评估细胞数量，以增强结论的可信度，并提供仅使用单一检测方法时无法获得的额外信息。其中一种检测方法利用荧光细胞成像仪直接计数tdTomato阳性细胞，另一种则依赖于线粒体将MTT裂解为甲臜这一已被充分表征的能力，从而作为细胞数量的间接指标10。本研究共评估了57种测试化合物，尽管该实验的MTT检测部分此前已被用于测试多达2,000种化合物的文库14。筛选结果表明，这两种检测方法如何相互印证，从而更有把握地得出特定结论，并突出了两者互补的情形，提供了通常需要至少进行两个独立实验才能获得的附加信息。

在接种细胞之前，方案中最关键的步骤即将开始。细胞培养中的代谢条件可能变得极不稳定，特别是当细胞接种密度过高时，谷氨酰胺和葡萄糖的消耗会尤为显著17,18。在此情况下，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由 NINDS 所内研究计划资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
B-27 (50X)ThermoFisher Scientific17504001神经干细胞培养基组分。  
BenchTop 移液器Sorenson Bioscience73990可一次性将化合物文库移液至96孔板中。
BioLite 96孔多孔培养板Thermo Scientific130188任何96孔细胞培养板均可使用。  我们在实验中使用此类产品。
细胞培养显微镜NikonEclipse TS100用于肉眼观察细胞，确保细胞密度适当。
Cytation 5/成像读板仪BioTekCYT3MFV用于细胞成像和吸光度检测。
DMSOFisher Scientific610420010筛选实验中所用化合物的溶剂。可溶解MTT沉淀，便于进行吸光度测定。
FGF-basicPeprotech100-18B神经干细胞培养基组分。  
GelTrexThermoFisher ScientificA1413202神经干细胞基底膜基质。  使细胞能够贴附于细胞培养板表面。
Gen5 3.04BioTek用于分析表达tdTomato的细胞数量的分析软件。
谷氨酰胺ThermoFisher Scientific25030081神经干细胞培养基组分。  
Microtest U型底板Becton Dickinson3077用于储存化合物文库。
MTTThermoFisher ScientificM6494用于检测细胞活力的活性检测试剂。
多通道移液器RaininE8-1200用于逐列添加细胞培养基、MTT或DMSO。
Neurobasal 培养基ThermoFisher Scientific21103049神经干细胞基础培养基。
RFP滤光片组BioTek1225103Cytation 5中用于成像表达tdTomato细胞的滤光片。
TrypLEThermoFisher Scientific12605036细胞解离试剂。

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MTT tdTomato DMSO

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