一种在中低通量条件下鉴定影响培养哺乳动物细胞生长与存活化合物的策略

摘要

通常需要评估一组化合物对培养细胞的潜在细胞毒性。本文介绍了一种在96孔板体系中可靠筛选有毒化合物的策略。

摘要

在研究可能具有治疗益处的药物时，细胞毒性是一个需要量化的关键参数。因此，许多药物筛选实验都将细胞毒性作为评估单个化合物的关键特征之一。培养中的细胞是一种有用的模型，可在进入成本更高、劳动更密集的动物模型研究之前，用于评估细胞毒性及后续有前景的先导化合物。本文描述了一种用于鉴定影响表达tdTomato的人类神经干细胞（NSC）系细胞生长的化合物的策略。该策略采用两种互补的检测方法来评估细胞数量：一种方法通过检测3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）还原为甲臜的程度来间接反映细胞数量，另一种方法则直接计数表达tdTomato的NSCs。这两种检测可在同一实验中同时进行，操作简便、快速且成本低廉。本演示中所述策略采用96孔板格式，在初步探索性筛选中测试了57种化合物的毒性。其中三个阳性结果进一步通过六点剂量反应实验进行表征，实验设置与初筛相同。除了能有效验证化合物毒性外，比较两种检测方法的结果还有助于识别影响细胞生长其他方面的化合物。

引言

确定具有治疗潜力的化合物对动物细胞的毒性，是其最重要的特性之一。该特性将决定一种药物是否适合作为深入研究的候选对象。大多数情况下，人们倾向于寻找毒性最小的化合物，但在某些情况下，能够杀死特定细胞类型的化合物也具有研究价值，例如抗肿瘤药物。尽管整体动物模型是评估系统性毒性的最佳体系，但当需要测试的化合物数量较多时，其成本和劳动投入过高，难以实施。因此，哺乳动物细胞培养通常被用作最有效的替代方法^1,2。中小通量药物筛选是一种在细胞培养中评估毒性的关键手段。此类筛选可用于检测针对特定信号通路的注释化合物文库。此类筛选的一般流程为：首先在初步毒性筛选中以单一浓度（通常为 10 µM）测试文库中的所有化合物，然后对初筛中发现的阳性化合物进行深入的二次剂量-反应关系筛选，以全面表征其毒性特征。本文将描述实施该策略的具体方法，为识别和表征有毒化合物提供一种快速、高效且经济的途径。

已开发出多种方法用于评估小分子化合物和纳米材料对哺乳动物细胞的细胞毒性^3,4需要注意的是，某些材料可能会与检测发生相互作用，从而产生误导性结果；因此在对毒性筛选中的阳性结果进行表征时，应测试此类相互作用。⁴细胞毒性检测包括台盼蓝排斥法....

方案

1. NSC 培养

注意：下文将描述人类神经干细胞系的操作，但本方案可适用于任何细胞系。所有细胞培养操作均须在生物安全柜中进行。

1. 用基底膜/细胞外基质（ECM）包被96孔板。
   1. 将一份ECM（材料表）在冰上解冻，以促进神经干细胞（NSC）的贴附。将ECM用10 mL基础培养基（材料表）稀释至适当浓度（通常为1:100），每孔加入50 µL，共加至96孔板的60个内圈孔中（图1）。仅使用内圈60个孔，以避免边缘效应可能引起的实验偏差¹⁶。
   2. 将板置于室温或细胞培养孵箱（37 °C，5% CO₂）中静置至少30分钟。
2. 消化并接种神经干细胞。
   注意：用于本方法的细胞应在T75培养瓶中培养至至少80%融合度。
   1. 在细胞培养孵箱（37 °C，5% CO₂）中，使用神经干细胞培养基（含基础培养基、B27、非必需氨基酸、2 mM谷氨酰胺和10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（FGFb或FGF2））培养细胞。
   2. 当细胞达到80%融合度时，从孵箱中取出，吸除神经干细胞培养基。加入适量细胞消化试剂（T75培养瓶....

结果

自动细胞计数数据鉴定出11种化合物在归一化至DMSO对照后存活率低于25%，而MTT数据除这11种化合物外还额外鉴定出两种化合物（表1 和 表2，红色阴影部分）。仅在MTT检测中显示具有毒性的两种化合物（F3孔和G10孔）的tdTomato阳性细胞数量分别为对照组的31%和39%，按毒性排序，在该化合物库中仅次于已判定为有毒的化合物，位列其后两位。这两个孔的标准差数值未提示三块板之间存在显著离群值从而影响平均值，且在分别查看三块重复板的数据时，这两种化合物在任一板上均未低于25%的阈值（数据未显示）。多个孔的tdTomato荧光代表性图像见图3。对MTT检测与细胞计数检测在毒性判断上存在差异的两个孔进行图像分析后发现，F3孔（图3B）和G10孔（图3C）中的化合物均具有毒性，尽管在三块重复板中有一块板的G10孔内残留少量活细胞.......

讨论

本文的主要目标是描述一种能够高效且低成本地在低至中等通量筛选中鉴定影响细胞生长化合物的策略。研究采用了两种正交技术来评估细胞数量，以增强结论的可信度，并提供仅使用单一检测方法时无法获得的额外信息。其中一种检测方法利用荧光细胞成像仪直接计数tdTomato阳性细胞，另一种则依赖于线粒体将MTT裂解为甲臜这一已被充分表征的能力，从而作为细胞数量的间接指标¹⁰。本研究共评估了57种测试化合物，尽管该实验的MTT检测部分此前已被用于测试多达2,000种化合物的文库¹⁴。筛选结果表明，这两种检测方法如何相互印证，从而更有把握地得出特定结论，并突出了两者互补的情形，提供了通常需要至少进行两个独立实验才能获得的附加信息。

在接种细胞之前，方案中最关键的步骤即将开始。细胞培养中的代谢条件可能变得极不稳定，特别是当细胞接种密度过高时，谷氨酰胺和葡萄糖的消耗会尤为显著^17,18。在此情况下，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B-27 (50X)	ThermoFisher Scientific	17504001	神经干细胞培养基组分。
BenchTop 移液器	Sorenson Bioscience	73990	可一次性将化合物文库移液至96孔板中。
BioLite 96孔多孔培养板	Thermo Scientific	130188	任何96孔细胞培养板均可使用。  我们在实验中使用此类产品。
细胞培养显微镜	Nikon	Eclipse TS100	用于肉眼观察细胞，确保细胞密度适当。
Cytation 5/成像读板仪	BioTek	CYT3MFV	用于细胞成像和吸光度检测。
DMSO	Fisher Scientific	610420010	筛选实验中所用化合物的溶剂。可溶解MTT沉淀，便于进行吸光度测定。
FGF-basic	Peprotech	100-18B	神经干细胞培养基组分。
GelTrex	ThermoFisher Scientific	A1413202	神经干细胞基底膜基质。  使细胞能够贴附于细胞培养板表面。
Gen5 3.04	BioTek		用于分析表达tdTomato的细胞数量的分析软件。
谷氨酰胺	ThermoFisher Scientific	25030081	神经干细胞培养基组分。
Microtest U型底板	Becton Dickinson	3077	用于储存化合物文库。
MTT	ThermoFisher Scientific	M6494	用于检测细胞活力的活性检测试剂。
多通道移液器	Rainin	E8-1200	用于逐列添加细胞培养基、MTT或DMSO。
Neurobasal 培养基	ThermoFisher Scientific	21103049	神经干细胞基础培养基。
RFP滤光片组	BioTek	1225103	Cytation 5中用于成像表达tdTomato细胞的滤光片。
TrypLE	ThermoFisher Scientific	12605036	细胞解离试剂。