体外受精是一种常用的技术，可用于多种模式生物，以维持实验室种群并为下游应用提供同步发育的胚胎。本文介绍了一种针对墨西哥盲鱼（Astyanax mexicanus）不同种群实施该技术的实验方案。
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方法文章
Astyanax mexicanus 配子采集与体外受精
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
Astyanax mexicanus 正逐渐成为生物科学多个研究领域的模式生物。该辐鳍鱼类物种近年来取得成功的原因之一，在于其洞穴种群与河流种群之间具有可育的杂交能力。这使得研究人员能够对在适应不同环境过程中被固定的可遗传性状进行基因定位。尽管该物种可在实验室中进行饲养和繁殖，但在白天获取胚胎以及在不同品系之间产生杂交胚胎仍具挑战性。体外受精（IVF）技术已被广泛应用于多种模式生物，可在实验室中实现动物的稳定且可重复的繁殖。在本实验方案中，我们展示了通过将 A. mexicanus 适应不同的光照周期并结合水温调节，可将其繁殖周期调整至预定的白天时段。随后，我们介绍了如何筛选合适的亲本鱼，从雄鱼和雌鱼中收集健康的配子，并通过体外受精获得可存活的后代。该方法使得诸如遗传载体注射或发育过程分析等相关实验操作能够在正常的实验工作时间内进行。此外，该技术还可用于创建洞穴种群与地表种群之间的杂交个体，从而推动对表型适应不同环境的遗传基础的研究。
引言
近年来，Astyanax mexicanus 已成为发育生物学、进化生物学、行为生物学和生理学等多个领域的模式生物1,2,3,4。该系统的特点在于该物种具有多个适应了截然不同环境的形态类型。栖息于地表的形态类型生活在河流中，那里生物多样性高，鱼类的食物来源丰富。相比之下，A. mexicanus 的洞穴形态类型（即洞穴鱼）则生活在洞穴中，其环境中的生物多样性、食物来源和氧气含量均显著减少1。洞穴鱼在多种表型上与地表鱼存在差异，例如缺乏眼睛和色素、存在胰岛素抵抗以及具有储存脂肪的能力2,3,4。然而，地表鱼与洞穴鱼仍属于同一物种，因此可相互交配并产生可育后代。
对于这两种形态型，已确定了一套可在实验室条件下进行常规维持和繁殖的条件5,6。然而，由于多种原因，基因改造、胚胎发育的深入研究以及杂交个体的制备仍然具有挑战性。A. mexicanus 主要在夜间产卵 这给后续针对早期胚胎阶段的实验操作带来了不便 例如遗传载体的显微注射或早期胚胎发育过程的监测。此外，利用自然产卵方式获得表型鱼与洞穴型鱼的杂交后代较为困难，因为洞穴形态型具有改变的昼夜节律7，最终影响可育卵子的产生。已有报道针对其他 Astyanax 物种建立了有效的但具侵入性的体外受精（IVF）技术，通过激素注射诱导配子生成和产卵行为8,9。也有报道采用较非侵入性的体外受精方法（即通过人工挤卵获得配子，无需注射激素制剂），但这些方法未考虑 A. mexicanus 洞穴型与表型鱼之间在产卵周期上的差异6。
其他鱼类模式生物（如斑马鱼）由于上述障碍已成功解决，可轻松进行遗传改造并在胚胎水平上开展研究。标准化繁育技术、体外受精以及精子冷冻保存等技术的应用，均推动了斑马鱼的发展，并巩固了其在生物科学领域中的模型地位10。因此，将这些技术拓展至 A. mexicanus，将进一步增强其作为模式系统的优势。
本文介绍了一种详细的 A. mexicanus 体外受精（IVF）实验方案，有助于提高该物种的可操作性。我们将展示一种繁殖装置，可通过将鱼类的光照周期从白天调整为夜间，从而在白天时段获取具有活性的卵子，且无需注射激素制剂。随后，我们详细描述了用于体外受精的卵子和精液的获取方法。该技术使得胚胎的制备可在正常工作时间内完成，相较于利用自然产卵获得的胚胎，更有利于后续各项实验操作的开展。
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方案
本文所述所有方法均已获得斯托尔斯医学研究所机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 光照周期调控
- 在不透明、完全封闭（避光）的循环水养殖系统中设置鱼缸，该系统包含多排鱼缸（图1）。
注意：如图1所示，该循环水系统利用系统水通过每个鱼缸后部的排水管将废物冲入集水坑，再排入卫生排水管。本实验中，通过滴流装置实现每小时一加仑（美国）的水交换速率。 - 使用独立的加热元件维持每个鱼缸的温度，并在诱导过程中手动调节温度。
- 以允许每排鱼缸独立设置光周期的方式布置各排鱼缸。为每排鱼缸安装可关闭的门，以防止光线进入或逸出。
注意：自动控制器可实现对所有光周期的调控，同时对鱼类的干扰最小。 - 在鱼缸架上配备红光工作灯和遮光帘，以便在黑暗时段进行操作。
2. 调整光周期及对鱼类进行配子采集前的诱导处理
- 从通用系统架中取出所需鱼类（图2a），并将其放入繁殖架中，以便在诱导前14天调整光周期。
注意：这可使鱼类适应新环境。 - 在此期间，使用安装的水生加热系统将水温维持在22.8 °C（73 °F）。正常光周期为上午6点至晚上8点光照，晚上8点至次日早上6点黑暗。对于光照循环架，通过调节控制架内灯光的定时器，将光周期调整为晚上10点至中午12点光照，中午12点至晚上10点黑暗。
注意：雄鱼和雌鱼共同饲养于同一水箱中，以允许自然诱导行为的发生。尽管产卵可能在水箱中发生，鱼类仍可用于体外受精，因为配子是分阶段释放的11。 - 待鱼类适应环境后，按照步骤2.3.1至2.3.5所述开始诱导动物产卵5。
注意：该程序总共需要六天。在此期间，使用安装的水生加热系统调节温度以促进卵子生成。使用50W水生加热器（见材料表），将加热器直接设置为各步骤协议中指定的温度（加热器上的刻度为华氏度）。根据水箱大小和水流速率，温度调节所需时间可能有所不同。本实验中，温度在中午进行调整，温度平衡需持续约18小时。- 第1天，将温度从22.8 °C（73 °F）升高至24.4 °C（76 °F）。
- 第2天，将温度从24.4 °C（76 °F）升高至26.1 °C（79 °F）。
- 第3天和第4天，保持温度在26.1 °C（79 °F）。鱼类将在白天准备产卵，可进行体外受精。
注意：根据个体差异，雌鱼可能在第3天和/或第4天产卵。建议根据卵子采集的成功情况，在第3天和/或第4天尝试获取卵子。 - 第5天，将温度从26.1 °C（79 °F）降低至24.4 °C（76 °F）。
- 第6天，将温度从24.4 °C（76 °F）降低至22.8 °C（73 °F）。
注意：重复此温度循环前应间隔7天。建议继续将鱼类维持在此光周期下，以减少鱼类适应此调整后光周期所需的总时间。
3. 雌性配子采集
- 首先，将一张湿润的擦拭纸放入培养皿盖中，并盖上培养皿以形成一个加湿的环境，防止卵子在收集过程中干燥。
- 接下来选择一条雌鱼进行收集。腹部大且明显膨出的怀卵鱼通常是本操作的最佳选择（图2a）。
注意：为区分成年A. mexicanus的雌雄，采用棉球法12。 - 使用低温水使雌鱼固定，并将其仰卧置于湿润的海绵动物固定装置中。具体操作是将鱼放入4 °C的系统水中至少30秒，或直至鱼体完全不动（即鳃部运动停止，详见Ross和Ross13）。
注意：操作应迅速，并尽量避免在操作完成前使鱼体升温。可定期将戴手套的手指尖浸入冷水中，或辅以额外麻醉。也可使用其他麻醉方法（如MS-22213）。根据斯托尔斯医学研究所IACUC指南，卵子的人工采集被视为非侵入性操作，无需完全麻醉（例如通过MS-222）。 - 固定好鱼体后，用柔软的擦拭纸轻轻吸干鱼体腹侧，因为接触水分会导致卵子激活。
- 用拇指和食指夹住雌鱼，轻轻从体腔两侧向泌尿生殖孔方向挤压，同时略微滚动手指。用一次性刮铲收集排出的卵子。
- 将收集的卵子转移至加湿的培养皿中。
注意：若无需特定亲本信息，可将多批卵子合并于同一培养皿中。卵子可在24 °C下保存，最好在收集后30–60分钟内用于体外受精（IVF）。 - 收集完成后，轻柔地将鱼放回装有系统水的恢复缸中。
注意：必要时可将鱼放回暗柜中的养殖缸，以备后续卵子收集。
4. 雄性配子采集
- 选择一条雄鱼进行采集。
注意：雄性配子质量无明显的外部可见特征。然而，用于本实验的鱼类应外观健康。为区分成年 A. mexicanus 的雌雄，采用棉球法12。 - 使用低温水使雄鱼固定，并将其置于湿润海绵制成的动物固定装置中，保持仰卧位。将鱼放入 4 °C 的系统水中至少 30 秒，或直至鱼体完全固定（即鳃部运动停止），具体可参见 Ross 和 Ross13 的详细说明。
注意：操作应迅速，并尽量避免在操作完成前使鱼体升温。必要时可定期将戴手套的手指尖浸入冷水中，或辅以额外麻醉。也可采用其他麻醉方法（如 MS-22213）。根据美国斯托尔斯医学研究所 IACUC 指南，手工采集精子被视为非侵入性操作，无需完全麻醉（例如使用 MS-222）。 - 用柔软的纸巾轻轻吸干鱼体腹部，因接触水会激活精液。
- 将毛细管末端轻柔地置于泌尿生殖孔处。
- 用拇指和食指轻轻挤压鱼体两侧，从鳃部远端开始，向泌尿生殖孔方向推进，以排出精液。
- 用毛细管末端收集精液。必要时可使用吸管施加轻微负压辅助吸取。注意避免混入可能随精液排出的粪便。
- 将精液排入一个空的 1.5 mL 离心管中，并加入两倍体积的精子稀释液 E400（见材料表）。置于冰上保存。
注意：若无需特定亲本信息，可将多条雄鱼的精液混合使用。此步骤可延长精液的可用时间至数小时，但若立即进行受精则非必需。 - 采集完成后，轻柔地将鱼放回盛有系统水的恢复缸中。
注意：如需后续再次采集精子，应将鱼放回黑暗环境的饲养缸中。
5. 体外受精
- 每次使用新的移液器，吸取不同储存液前，通过移液或轻轻振荡管壁混匀精子，因为在受精前，精液中的精子在E400溶液中会随时间沉降。
- 将精液或稀释后的精液溶液加入新采集的卵子中。
- 迅速向抱卵装置中加入1 mL系统水，以激活精子和卵子进行受精。避免混合或搅动培养皿中的内容物，静置2分钟以完成受精过程。
注意：混合和振荡会显著降低受精率，因此应避免。14. - 加入E2胚胎培养基至培养皿的2/3处rd 完整
注意：根据后续实验步骤的不同，胚胎可立即使用（例如，用于基因构建体的显微注射，如前所述）15）或胚胎可在23 °C下用E2胚胎培养基孵育至5 dpf。此时，使用系统用水将胚胎转移至主循环饲养系统中。
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结果
本文所述方案主要基于先前发表的方案6。然而，由于 A. mexicanus 在夜间产卵，我们设计了一种鱼类繁殖用饲养架，可在不依赖工作时间的情况下独立调节光周期（图1）。该光周期调节在一套完全封闭的循环水养殖系统中进行，系统包含三排鱼缸（图1）。每个鱼缸均配备独立的加热元件，用于在诱导过程中手动升高温度。各个层架可设置不同的光周期，并可关闭以防止光线进入或逸出。所有光周期均可通过安装在光周期架侧面的自动控制器进行调控。为便于在黑暗时段操作，该饲养架配备了红色工作灯和遮光帘。当温度从23 - 26 °C以每天1.5 °C的增幅上升时，A. mexicanus 即可产卵16。为在我们的暗柜中实现这一升温过程，我们在每个鱼缸中使用了浸入式水族加热器（图1）。
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讨论
尽管体外受精（IVF）已成为斑马鱼等多种模式生物的标准化方法，但现有的A. mexicanus操作方案并未考虑到该物种在夜间自然产卵的习性6。由于洞穴鱼与表层鱼在昼夜节律上存在显著差异，其卵母细胞的成熟周期在洞穴型和表层型之间也有所不同。虽然表层型A. mexicanus的胚胎发育阶段温度和时间已得到充分研究12，但洞穴鱼在产卵行为和成熟周期方面可能存在差异。因此，由于A. mexicanus洞穴型失去了正常的昼夜节律7,导致其产卵时间发生改变，传统的杂交制备方法变得极为困难且不可靠。通过调整光照周期，我们可以在特定时间获得杂交胚胎，而无需依赖两种形态之间罕见的自然产卵事件。同时，将洞穴鱼与表层鱼分开饲养也可避免具有攻击性的表层型对繁殖产生不利影响。
该方法存在一些局限性，例如卵子质量的差异。确定一条雌性鱼（表型鱼或洞穴鱼）是否具有成熟卵子并非易事，需要仔细观察鱼类的行...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Philippe Noguera和Kimberly Bland在视频制作过程中提供的支持。作者还感谢Stowers研究所水生动物团队在动物饲养方面给予的全面协助。本研究由机构经费资助，资助对象为DPB和NR。NR获得了Edward Mallinckrodt基金会和JDRF的支持。RP获得了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号PE 2807/1-1）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm 培养皿 | VWR International | #25384-302 | |
| 吸液管 | Drummond | #2-000-000 | |
| 校准的 1–5 µL 毛细管 | Drummond | #2-000-001 | |
| 一次性刮棒 | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W 水生加热器 | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 移液器 | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 移液器吸头 | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 培养箱 | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| 精子稀释液 E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-葡萄糖, 30 mM HEPES 用 5M KOH 调节至 pH 7.9，并过滤除菌。溶液可在 4 ?C 下保存最多 6 个月。 | ||
| 海绵动物固定器 | 由废弃泡沫制成 | ||
| 系统用水 | 去离子水中添加 Instant Ocean 海盐 [Blacksburg, VA]，使电导率达到 800 µS/cm。 水质参数维持在安全范围内（总氨氮上限 1 mg/L；亚硝酸盐上限 0.5 mg/L；硝酸盐上限 60 mg/L；温度 22 °C；pH 7.65；溶解氧 100%） | ||
| 擦拭纸巾 | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 胚胎培养基 | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. 使用 2 N 盐酸将 pH 调至 7.2–7.4。过滤除菌，室温保存，最长两周。 |
参考文献
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