通过构建一锅法双酶级联反应实现黄烷酮向黄酮醇的生物合成

摘要

黄酮醇的衍生化对其在医疗保健和食品工业中的应用至关重要。本文提供了一种由黄烷酮生物合成黄酮醇的详细实验方案，并讨论了其中的关键步骤及其相较于其他方法的优势。

摘要

黄酮醇是黄酮类化合物中的一个重要亚类，具有多种生物学和药理学活性。本文提供一种黄酮醇的体外酶法合成方法。该方法将黄酮醇生物合成途径中的两个关键基因Atf3h和Atfls1克隆并在大肠杆菌（Escherichia coli）中过表达。通过亲和层析纯化获得重组酶，随后在特定的合成缓冲体系中构建双酶级联反应。以该体系合成了两种黄酮醇作为示例，并通过薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC/LC/MS）进行鉴定。该方法在黄酮醇的制备方面相较于其他方法具有明显优势，具有省时、省力且成本效益高的特点。反应过程易于精确控制，因而可放大用于大规模生产。由于反应体系组分简单，目标产物易于纯化。然而，该体系通常仅限于由黄烷酮前体合成黄酮醇。

引言

黄酮醇是植物黄酮类化合物的一个主要亚类，参与植物的发育和着色过程^1,2,3。更重要的是，这类化合物具有多种有益健康的活性，例如抗癌^4,5、抗氧化⁶、抗炎⁷、抗肥胖⁸、抗高血压⁹以及改善记忆的能力¹⁰，因而引发了大量针对这些植物来源的次生代谢产物的研究。传统上，这些化合物主要通过有机溶剂从植物中提取获得。然而，由于其在植物中的含量极低^11,12,13，大多数黄酮醇的生产成本仍然较高，严重限制了其在医疗保健和食品工业中的应用。

在过去的几十年中，科学家已开发出多种获取黄酮类化合物的方法^14,15。然而，这些复杂分子的化学合成存在多种固有缺陷¹⁶。该方法不仅需要使用有毒试剂和极端反应条件，还需要经过多个步骤才能获得目标黄酮类化合物^14,17。此外，该策略面临的另一个重要挑战是活性黄酮类分子的手性合成。因此，通过化学合成法大规模生产黄酮类化合物并非理想的策略^16,17。

近年来，科学家开发出一种颇具前景的替代策略，通过构建含有黄酮类生物合成途径的微生物来生产这些复杂的天然化合物^{18,19,20,21,22}，该途径在植物中已被成功解析²³。例如，Duan 等人将一条生物合成途径导入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，实现了山奈酚（KMF）的生产²⁴。Malla 等人则通过将黄烷酮3-羟化酶（f3h）、黄酮醇合酶（fls1）以及UDP-葡萄糖：黄酮类3-O-葡萄糖基转移酶UGT78K1基因导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，成功合成了糖基化黄酮醇——毛蕊异黄酮苷（astragalin）¹⁷。尽管已有不少成功范例，但由于细胞平台的复杂性、人工合成的遗传元件与宿主之间的不兼容性、目标产物对宿主细胞的抑制作用，以及工程化细胞系统本身的不稳定性，许多基因工程微生物仍无法有效生成目标产物¹⁶。

黄酮类化合物生产的另一种有前景的替代策略是在体外构建多酶级联反应。Cheng 等人报道，通过在一锅体系中组装完整的酶促途径，可成功合成 enterocin 聚酮化合物²⁵。这种无细胞合成策略规避了微生物生产工厂的限制，因此适用于大量生产某些黄酮类化合物¹⁶。

最近，我们已成功开发出一种双酶合成系统，可将柚皮素（NRN）在一锅反应中转化为KMF¹⁶。本文详细描述了该系统及产物分析所涉及的方法。此外，我们还展示了两个应用该系统分别从柚皮素（NRN）和埃里多替醇（ERD）生成KMF和槲皮素（QRC）的实例。同时，我们讨论了该方法中的关键步骤以及黄酮类化合物生物合成领域的未来研究方向。

方案

1. 从植物组织中分离总RNA^26,27

1. 匀浆植物组织。
   1. 取100 mg新鲜植物组织（例如拟南芥Arabidopsis thaliana的4周龄幼苗）。用液氮速冻组织以及研钵和研杵，随后将组织研磨成粉末。
   2. 向研钵中加入1 mL RNA提取试剂（见材料表）。试剂会立即冻结，在冻结的试剂融化后，用研杵充分匀浆组织样品。
   3. 将匀浆液转移至1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以12,000 × g离心5分钟，然后将澄清的匀浆液上清转移至另一新的1.5 mL离心管中。
   4. 将匀浆样品在室温下孵育5分钟。
2. 提取总RNA。
   1. 向匀浆液中加入0.2 mL氯仿，盖紧管盖，用手剧烈振荡15秒，并在室温下孵育5分钟。
   2. 在4 °C条件下以12,000 × g离心15分钟，将无色的上层水相转移至新的1.5 mL离心管中。离心后样品分为三层。
   3. 向上层水相中加入0.5 mL异丙醇，用手剧烈振荡混匀，并在室温下孵育10分钟。
   4. 在4 °C条件下以12,000 × g离心10分钟，弃去上清液。
   5. 用1 mL 75%乙醇通过涡旋洗涤RNA沉淀一次，随后在4 °C条件下以7,500 × g离心5分钟。
   6. 重复步骤1.2.5。
   7. 将沉淀在空气中干燥5–10分钟，然后用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水通过吹打重悬RNA，随后使用微量分光光度计测定总RNA浓度（见材料表）。

2. 合成互补DNA（cDNA）²⁸

1. 使用试剂盒合成 cDNA 第一链（参见材料表）。按照表 1建立 20 μL 反应体系，在 PCR 仪中于 42 °C 孵育 50 分钟，随后在 85 °C 终止反应 5 分钟。将反应产物于 -20 °C 保存，用于后续基因扩增。

试剂	体积
dNTP Mix, 2.5mM each	4.0 μL
引物混合液	2.0 μL
RNA 模板	1.0 μg
逆转录酶缓冲液, 5×	4.0 μL
逆转录酶, 200 U/μL	1.0 μL
无RNase水 H2O	加至 20.0 μL

表1：将总RNA逆转录为cDNA

3. 构建重组质粒²⁹

1. 设计PCR引物。
   1. 使用软件（参见材料表）根据从GenBank数据库获得的关键酶基因序列设计PCR引物，并由公司（参见材料表）合成引物。在引物的5’端添加限制性酶切位点（例如，本方案中使用BamHI或EcoRI）。
      注意：本研究中使用的引物见表2。

序列，5' → 3'	目的
AAGGATCCATGGCTCCAGGAACTTTGACT	用于PCR扩增的上游引物 Atf3h 基因来自 拟南芥 BamHI位点以斜体标出，并附上用于克隆至pET32a(+)中。
AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTGGTCGA	用于PCR扩增的反向引物 Atf3h 基因来自 A. thaliana 大肠杆菌RI位点以斜体标出，并附上用于克隆至pET32a(+)中。
AAGGATCCATGGAGGTCGAAAGAGTCCA	用于PCR扩增的上游引物 Atfls1 基因来自 A. thaliana BamHI位点以斜体标出，并附上用于克隆至pET32a(+)中。
AAGAATTCTCAATCCAGAGGAAGTTTAT	用于PCR扩增的反向引物 Atfls1 基因来自 A. thaliana 生态RI位点以斜体标出，并附上用于克隆至pET32a(+)中。

表2：本研究中使用的寡核苷酸引物

2. 将基因克隆至原核表达载体中。
   1. 使用高保真DNA聚合酶（参见材料表），从合成的cDNA第一条链中扩增目标基因。按照表3所示配置100 μL PCR反应体系，并运行以下PCR循环程序：94 °C预变性2 min；随后进行35个循环，每个循环包括94 °C变性30 s、55 °C退火2 min、72 °C延伸1 min；最后在72 °C下终延伸10 min。将反应体系冷却至12 °C。
      注：延伸时间可变，通常由基因长度决定，大多数DNA聚合酶的聚合速度约为每分钟1000个碱基。
   2. 取PCR产物（通常为5 μL）在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，并使用DNA纯化试剂盒（参见材料表）从剩余产物中纯化目标DNA片段。
   3. 使用限制性内切酶（本实验方案中例如BamHI或EcoRI）对纯化的DNA片段和载体（如pET-32a(+)）进行双酶切。按照表4所示在0.2 mL PCR管中配置50 μL反应体系，37 °C孵育3 h。将酶切后的DNA在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。
   4. 使用凝胶回收试剂盒回收目标DNA条带（参见材料表）。进一步使用DNA纯化试剂盒进行纯化（参见材料表），随后使用微量分光光度计测定DNA浓度（参见材料表）。
   5. 使用T4 DNA连接酶（参见材料表）将基因片段连接至线性化载体DNA中。按照表5所示在1.5 mL离心管中配置连接反应体系，室温孵育2–3 h。
      注：插入片段与载体的摩尔比可变，通常在3:1至10:1之间。
   6. 取2.5 μL连接反应产物加入50 μL化学感受态Escherichia coli细胞（如TOP10或DH5α）中，轻轻混匀，冰上静置30 min。42 °C热激90 s后立即置于冰上冷却2 min。
   7. 向管中加入200 μL不含抗生素的液体LB培养基，37 °C、220 rpm振荡培养1 h。取50–100 μL菌液涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37 °C过夜培养。

试剂	体积
Pfu Master Mix, 2×	50.0 μL
正向引物, 10 μM	4.0 μL
反向引物, 10 μM	4.0 μL
cDNA	2.0 μL
H2O	40.0 μL

表3：PCR反应体系的建立

试剂	体积
DNA 片段/载体	3.0 μg
BamHI	1.0 μL
EcoRI	1.0 μL
Cutsmart Buffer, 10×	5.0 μL
H2O	加至 50.0 μL

表4：DNA片段/载体的双酶切

试剂	体积
插入片段	X μL (0.09 pmol)
载体	Y μL (0.03 pmol)
连接缓冲液，10×	1.0 μL
T4 DNA 连接酶，400 U/μL	1.0 μL
H2O	加至 10.0 μL

表5：将基因片段连接至线性化载体

3. 筛选阳性克隆。
   1. 从LB平板上挑取单个菌落，接种于200 μL含有100 μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37 °C、250 rpm振荡培养2 - 3小时。
      注：通常挑选4 - 8个菌落进行阳性克隆的筛选。
   2. 设置10 μL的菌落PCR反应，反应体系与步骤3.2.1类似。
      注：使用1 μL LB培养物代替1 μL cDNA模板。
   3. 在1%琼脂糖凝胶上检测PCR产物。将PCR结果为阳性的剩余菌液接种于3 mL含有100 μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37 °C、250 rpm振荡培养14 - 16小时。
   4. 使用质粒小提试剂盒（见材料表）从重组E. coli培养物中提取质粒DNA。
   5. 通过双酶切分析（例如本实验方案中的BamHI和EcoRI）鉴定纯化的重组质粒。设置10 μL反应体系，方法同步骤3.2.3，随后在37 °C孵育3小时。在1%琼脂糖凝胶上观察从重组质粒中释放出的特异性条带。
4. 验证阳性重组质粒的序列。
   1. 将质粒送至测序公司进行测序。使用DNA序列分析软件（见材料表）分析测序结果，将测序公司提供的序列与GenBank数据库中的参考序列进行比对。

4. 表达重组酶蛋白³⁰

1. 将正确的重组质粒转化至感受态E. coli BL21(DE3)中。
   1. 在1.5 mL离心管中，将0.1 μL质粒加入10 μL置于冰上的感受态E. coli BL21(DE3)中，冰浴5分钟。
   2. 在42 °C水浴中热激90秒，然后再次置于冰上2分钟。
   3. 加入200 μL不含抗生素的LB液体培养基，于37 °C、220 rpm摇床中培养5分钟。
   4. 取50 μL转化产物涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，37 °C培养箱中过夜培养。
2. 诱导基因表达。
   1. 从平板上挑取3 - 5个单菌落，接种至含3 mL、100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基的离心管中，于37 °C、250 rpm摇床中过夜培养。
   2. 将全部过夜培养物转移至含300 mL、100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37 °C、250 rpm摇床中培养，直至菌液在600 nm处的光密度值达到0.4 - 0.6。
   3. 向培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为0.2 mM，在20 - 22 °C、250 rpm条件下诱导表达3小时。

5. 纯化重组酶蛋白³¹

1. 在 4 °C、12,000 × g 条件下离心培养物 10 分钟，收集细菌。
2. 将菌体沉淀重悬于 15 mL 细菌裂解缓冲液中，缓冲液含有 0.1% Triton X-100、1 mM EDTA、10% 甘油、150 mM NaCl、0.5 mM DTT、0.1 mM PMSF、1 μg/mL 抑肽酶（aprotinin）、1 μg/mL 亮抑蛋白酶肽（leupeptin）和 1 μg/mL 胃蛋白酶抑制剂（pepstatin），溶于 50 mM Tris-Cl（pH 8.0）。
3. 超声处理细菌悬液以释放重组酶蛋白，随后在 4 °C、13,000 × g 条件下离心 10 分钟。
4. 收集上清液，分装至 1.5 mL 离心管中，每管 1 mL，并于 -70 °C 保存以备后续使用。
5. 将 500 μL His-tag 纯化树脂（见材料表）装入可重复使用的空亲和层析柱中。用 5 个柱体积的去离子水洗涤树脂，以去除储存液中的乙醇。再用 10 个柱体积的结合缓冲液（含 Tris-Cl（20 mM，pH 7.9）、咪唑（10 mM）和 NaCl（0.5 M））平衡树脂。
6. 将第 5.4 步所得 4 mL 上清液加入上述树脂的悬液中，并用塞子封闭层析柱两端。
7. 将混合物在 4 °C 下低速旋转孵育 2 小时。
8. 在洗脱前，以 1 mL/min 的流速，用 15 个柱体积的结合缓冲液在 4 °C 下洗涤与融合蛋白结合的树脂。
9. 向层析柱中加入 500 μL 洗脱缓冲液（含 20 mM Tris-Cl（pH 7.9）、500 mM 咪唑、0.5 M NaCl），并在 4 °C 下低速旋转孵育 10 分钟。收集洗脱液作为纯化的蛋白样品。
10. 重复步骤 5.5 共四次。
11. 依次用 10 个柱体积的去离子水和 3 个柱体积的 20% 乙醇洗涤树脂。将树脂浸泡在 20% 乙醇中，用塞子封闭层析柱，并于 4 °C 保存。
12. 采用 Bradford 蛋白定量法测定纯化蛋白的浓度。通过 10% SDS-PAGE 凝胶电泳分析蛋白纯度，并用考马斯亮蓝染色法显色观察蛋白条带。
13. 向纯化的蛋白溶液中加入甘油，使其终浓度为 10%，以稳定酶活性。分装后于 -80 °C 保存。

6. 从黄烷酮制备黄酮醇 在一个 体外 双酶合成系统¹⁶

1. 准备缓冲液。
   1. 配制不含硫酸亚铁的2×合成缓冲液，其成分为200 mM Tris-HCl（pH 7.2）、16.4 mM α-酮戊二酸、0.8% 抗坏血酸钠和20% 甘油。将1.938 g Tris碱、0.640 g 抗坏血酸钠、0.250 g α-酮戊二酸和16 mL 甘油溶解于64 mL 去离子水中。用盐酸（HCl）调节pH至7.2，再加去离子水定容至80 mL。将缓冲液于4 °C保存以备后续使用。
   2. 配制100×硫酸亚铁储备液（2 mM）。将55.6 mg 七水合硫酸亚铁溶解于50 mL 去离子水中，搅拌后加水定容至100 mL。
   3. 配制25 mM 黄酮类化合物储备液。将黄酮类化合物充分溶解于甲醇中，并于-20 °C保存。
2. 建立由黄烷酮合成黄酮醇的反应体系。
   1. 按照表6所示准备合成反应体系。
   2. 在40 °C、600 rpm条件下（使用振荡加热金属块），于敞口的2.0 mL离心管中孵育反应40分钟。
   3. 加入10 μL乙酸和100 μL乙酸乙酯终止反应。
   4. 两小时后，将有机相转移至1.5 mL离心管中，在室温下通风橱内进行空气干燥。

试剂	体积
不含硫酸亚铁的2×合成缓冲液	50.0 μL
25 mM 黄酮醇	2.0 μL
2 mM 硫酸亚铁	0.5 μL
1 mg/mL AtF3H	2.5 μL
1 mg/mL AtFLS1	2.5 μL
25 mM 黄烷酮	2.0 μL
H2O	加至 100.0 μL

表6：本方案中使用的合成系统。

7. 分析反应产物

1. 薄层色谱（TLC）分析。
   1. 合并步骤 6.2.4 中得到的 5 管黄酮类样品，取出 300 μL 进行风干。将黄酮粉末重新溶解于 160 μL 甲醇中。用甲醇配制浓度分别为 12.5、25、50、100 和 200 ng/μL 的标准黄酮类化合物样品。取 1 μL 反应样品和标准黄酮类样品点样至聚酰胺 6 薄层板上。
   2. 使用氯仿/甲醇/乙酸乙酯/甲酸按 5.0:1.5:1.0:0.5 比例组成的展开剂系统展开点样后的薄层板。
   3. 在室温下将薄层板风干，喷洒 1% 的三氯化铝（AlCl₃）乙醇溶液，随后再次于室温下风干。
   4. 30 分钟后，在 254 nm 紫外光下观察并成像薄层板上的斑点。
   5. 使用图像处理软件（例如本方案中的 ImageJ v1.51j8）分析图像中各斑点的灰度值。
      1. 打开 ImageJ 软件。点击 文件 > 打开，以打开待分析的图像。
      2. 点击 ImageJ 用户界面中最左侧的矩形选择工具。用鼠标圈定图像中的感兴趣区域（ROI），然后按下 键标记第一个 ROI。
      3. 用鼠标将矩形选择框向右移动至下一个 ROI，然后按下 键标记第二个 ROI。
      4. 重复上一步操作，标记所有其他 ROI。
      5. 按下 键，在弹出窗口中生成所有 ROI 的轮廓图。
         注意：此时 ImageJ 用户界面中的直线选择工具将自动激活。
      6. 使用直线选择工具绘制基线，为每个感兴趣的峰定义封闭区域。
      7. 点击 ImageJ 用户界面中对应的图标以激活魔棒工具。点击峰内部区域，结果将在弹出窗口中显示所有峰的数据。
   6. 以步骤 7.1.5.7 得到的灰度值对步骤 7.1.1 中对应的标准黄酮浓度作图，绘制基于 TLC 的标准曲线。然后根据所得公式计算本方案中目标黄酮的产量。
2. 高效液相色谱（HPLC）和液相色谱/质谱（LC/MS）分析
   1. 将步骤 7.1.1 得到的样品依次通过 0.45 μm 和 0.22 μm 滤膜处理。
   2. 将样品注入 HPLC/LC/MS 系统（参见材料表），使用 C18 色谱柱（4.6 × 150 mm；内径 5 μm）在 30 °C 下进行分离。以乙腈（ACN）-水体系进行梯度洗脱，流速为 1.0 mL/min（0 - 10 min，10 - 25% ACN；10 - 35 min，25 - 50% ACN；35 - 45 min，50 - 85% ACN；45 - 50 min，85 - 10% ACN；50 - 60 min，10% ACN），同时监测 200 至 800 nm 范围内的洗脱液吸光度。在负离子模式下进行 LC/MS 分析，干燥氮气流速为 10 L/min，温度 300 °C，鞘气流速为 7 L/min，温度 250 °C，并使用内置软件采集数据（参见材料表）。
   3. 使用软件提取单波长色谱图，计算反应样品和标准黄酮化合物的峰面积（参见材料表）。
      1. 打开定性分析程序，点击 文件 > 打开数据文件。在打开数据文件窗口中选择待分析的文件，点击打开以加载文件。
      2. 在色谱图结果窗口中右击鼠标，从弹出菜单中选择提取色谱图。
      3. 打开提取色谱图对话框。在类型列表中点击其他色谱图，在检测器下拉框中选择 DAD1，然后点击确定，在色谱图结果窗口中显示 HPLC 结果。
      4. 点击位于色谱图结果窗口顶部的手动积分图标。使用鼠标为需要手动积分分析的峰绘制基线。
      5. 点击 查看 > 积分峰列表 以显示结果。
   4. 以步骤 7.2.3.5 得到的峰面积对步骤 7.2.1 中对应的标准黄酮浓度作图，绘制基于 HPLC 的标准曲线。然后根据所得公式计算本方案中目标黄酮的产量。
   5. 使用软件分析黄酮类化合物的质谱数据以确定其精确分子量（参见材料表）。
      1. 重复步骤 7.2.3.1 - 7.2.3.3。
      2. 点击色谱图结果工具栏上的范围选择图标。
      3. 选择目标峰，在选定范围内右击鼠标，从弹出菜单中点击提取质谱图，结果将在质谱图结果窗口中显示。

结果

F3H 和 FLS1 是植物中将黄烷酮转化为黄酮醇的两个关键酶，如图1所示。为了建立一个体外生物合成系统以从黄烷酮生产黄酮醇，从4周龄的A. thaliana幼苗中克隆了Atf3h（GenBank登录号NM_114983.3）和Atfls1（GenBank登录号NM_120951.3）基因，并将其插入原核表达载体pET-32a(+)中。将重组质粒转化至E. coli BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达融合蛋白，随后使用Ni-IDA琼脂糖树脂进行纯化。如图2所示，纯化后的融合蛋白在10% SDS-PAGE凝胶上的纯度超过95%，足以用于建立体外双酶级联反应系统。

讨论

许多研究致力于黄酮醇的制备，因其在医疗保健和食品工业中具有潜在应用价值。然而，传统的植物提取方法使用有机溶剂，以及化学合成方法，均存在固有缺陷，限制了黄酮醇的生产应用。本文报道了一种通过构建体外双酶级联反应，在单一体系中由黄烷酮一步生成黄酮醇的详细方法。该方案的关键步骤包括：1）获得高活性的纯化重组酶；2）建立单一体系中的双酶反应级联。通常情况下，植物来源的基因在细菌中表达时倾向于形成包涵体，导致酶活性丧失。众所周知，某些肽段（如TrxA和SUMO）有助于提高在细菌中表达的重组蛋白的表达量和可溶性¹⁶。因此，将目标基因克隆至含有此类表达标签的质粒（如pET-32a(+)和pET SUMO）中将有助于蛋白表达（步骤3.2.3）。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导温度是影响原核表达蛋白可溶性的另外两个关键参数¹⁶。为进一步减少包涵体的形成，需对IPTG浓度和诱导温度进行优化。最佳IPTG浓度和诱导温度主要取决于质粒类型和菌株种类。在本方案中，IPTG浓度和诱导温度分别优化为0.2 mM和20–22 °C（步骤4.2.3）。此外，温...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2× Pfu MasterMix	北京科为博生物科技有限公司	CW0717A	高保真基因的PCR扩增
Agilent 1200 系列 RRLC 系统配备 Agilent 6460 三重四极杆 LC/MS 系统	Agilent Technologies, Inc	N/A	用于黄酮类化合物HPLC/MS分析的设备
Agilent MassHunter 工作站（版本 B.03.01）	安捷伦科技有限公司	N/A	用于从配备安捷伦6460三重四极杆LC/MS系统的安捷伦1200系列RRLC系统采集数据的软件
二氢槲皮素	Sigma-Aldrich 公司有限责任公司	91216	从柚皮素生产山奈酚的中间产物
二氢槲皮素	中国四川中药标准物质中心	PCS0371	从柚皮芹菜素合成槲皮素的中间产物
DNA 纯化试剂盒	北京科为博生物科技有限公司	CW2301	PCR扩增或凝胶纯化DNA的纯化
柚皮素	上海源野生物科技有限公司	B21160	生产槲皮素的底物
Escherichia coli BL21(DE3)	北京科为博生物科技有限公司	CW0809	用于表达目的基因的细菌菌株
Escherichia coli DH5α	北京科为博生物科技有限公司	CW0808	用于质粒扩增的细菌菌株
FreeZone 1 升台式冷冻干燥系统	Labconco Corporation	7740020	用于冻干溶解于有机溶剂中黄酮类化合物的设备
凝胶回收试剂盒	北京科为博生物科技有限公司	CW2302	从琼脂糖凝胶中纯化DNA条带
凝胶成像系统	上海塔能科学 & Technology Co. Ltd.	中国台湾<黄酮醇是一类具有多种生物和药理活性的黄酮类化合物主要亚类。本文提供一种体外酶法合成黄酮醇的方法。该方法将黄酮醇生物合成途径中的两个关键基因 Atf3h 和 Atfls1 克隆并在大肠杆菌中过表达。通过亲和层析纯化重组酶后，在特定合成缓冲液中构建双酶级联反应体系。以两种黄酮醇的合成为例，通过薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC/LC/MS）进行分析鉴定。该方法在黄酮醇衍生物制备方面较其他方法具有显著优势，省时省力且成本效益高。反应过程易于精确控制，便于放大进行大规模生产。由于反应体系组分简单，目标产物易于纯化。然而，该体系通常仅限于由黄烷酮合成黄酮醇。> 2500	用于在琼脂糖凝胶上可视化DNA条带或在聚酰胺TLC板上可视化黄酮类斑点的设备
GenElute 质粒小提试剂盒	Sigma-Aldrich 公司有限责任公司	PLN350-1KT	质粒的小量制备
山奈酚	Sigma-Aldrich 公司有限责任公司	60010	最终反应产物与标准物质
MassHunter 定性分析（版本 B.01.04）	安捷伦科技有限公司	N/A	一种用于分析HPLC/LC/MS数据的软件
NanoDrop 微量紫外-可见分光光度计	Thermo Fisher Scientific	ND-8000-GL	用于测定 DNA/RNA 浓度的设备
柚皮素	Sigma-Aldrich 公司有限责任公司	N5893	产生山奈酚的底物
Ni-IDA 琼脂糖树脂	北京科为博生物科技有限公司	CW0010	His标签融合蛋白的纯化
pET-32a(+)	Novagen	69015-3	用于克隆和表达目的基因的质粒
质粒测序	GENEWIZ 苏州	N/A	重组质粒测序
引物合成	GENEWIZ 苏州	N/A	PCR引物的合成
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