黄酮醇的衍生化对其在医疗保健和食品工业中的应用至关重要。本文提供了一种由黄烷酮生物合成黄酮醇的详细实验方案，并讨论了其中的关键步骤及其相较于其他方法的优势。
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本文内容
摘要
摘要
黄酮醇是黄酮类化合物中的一个重要亚类，具有多种生物学和药理学活性。本文提供一种黄酮醇的体外酶法合成方法。该方法将黄酮醇生物合成途径中的两个关键基因Atf3h和Atfls1克隆并在大肠杆菌（Escherichia coli）中过表达。通过亲和层析纯化获得重组酶，随后在特定的合成缓冲体系中构建双酶级联反应。以该体系合成了两种黄酮醇作为示例，并通过薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC/LC/MS）进行鉴定。该方法在黄酮醇的制备方面相较于其他方法具有明显优势，具有省时、省力且成本效益高的特点。反应过程易于精确控制，因而可放大用于大规模生产。由于反应体系组分简单，目标产物易于纯化。然而，该体系通常仅限于由黄烷酮前体合成黄酮醇。
引言
黄酮醇是植物黄酮类化合物的一个主要亚类，参与植物的发育和着色过程1,2,3。更重要的是，这类化合物具有多种有益健康的活性，例如抗癌4,5、抗氧化6、抗炎7、抗肥胖8、抗高血压9以及改善记忆的能力10，因而引发了大量针对这些植物来源的次生代谢产物的研究。传统上，这些化合物主要通过有机溶剂从植物中提取获得。然而，由于其在植物中的含量极低11,12,13，大多数黄酮醇的生产成本仍然较高，严重限制了其在医疗保健和食品工业中的应用。
在过去的几十年中，科学家已开发出多种获取黄酮类化合物的方法14,....
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方案
1. 从植物组织中分离总RNA26,27
- 匀浆植物组织。
- 取100 mg新鲜植物组织（例如拟南芥 Arabidopsis thaliana 的4周龄幼苗）。用液氮速冻组织以及研钵和研杵，随后将组织研磨成粉末。
- 向研钵中加入1 mL RNA提取试剂（见材料表）。试剂会立即冻结，在冻结的试剂融化后，用研杵充分匀浆组织样品。
- 将匀浆液转移至1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以12,000 × g 离心5分钟，然后将澄清的匀浆液上清转移至另一新的1.5 mL离心管中。
- 将匀浆样品在室温下孵育5分钟。
- 提取总RNA。
- 向匀浆液中加入0.2 mL氯仿，盖紧管盖，用手剧烈振荡15秒，并在室温下孵育5分钟。
- 在4 °C条件下以12,000 × g 离心15分钟，将无色的上层水相转移至新的1.5 mL离心管中。离心后样品分为三层。
- 向上层水相中加入0.5 mL异丙醇，用手剧烈振荡混匀，并在室温下孵育10分钟。
- 在4 °C条件下以12,000 × g 离心10分钟，弃去上清液。<....
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结果
F3H 和 FLS1 是植物中将黄烷酮转化为黄酮醇的两个关键酶，如图1所示。为了建立一个体外生物合成系统以从黄烷酮生产黄酮醇，从4周龄的A. thaliana幼苗中克隆了Atf3h（GenBank登录号NM_114983.3）和Atfls1（GenBank登录号NM_120951.3）基因，并将其插入原核表达载体pET-32a(+)中。将重组质粒转化至E. coli BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达融合蛋白，随后使用Ni-IDA琼脂糖树脂进行纯化。如图2所示，纯化的融合蛋白在10% SDS-PAGE凝胶上的纯度超过95%，足以用于建立体外双酶级联反应系统。
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讨论
许多研究致力于黄酮醇的制备，因其在医疗保健和食品工业中具有潜在应用价值。然而，传统的植物提取方法使用有机溶剂，以及化学合成方法，均存在固有缺陷，限制了黄酮醇的生产应用。本文报道了一种通过构建体外双酶级联反应，在单一体系中由黄烷酮一步生成黄酮醇的详细方法。该方案的关键步骤包括：1）获得高活性的纯化重组酶；2）建立单一体系中的双酶反应级联。通常情况下，植物来源的基因在细菌中表达时倾向于形成包涵体，导致酶活性丧失。众所周知，某些肽段（如TrxA和SUMO）有助于提高在细菌中表达的重组蛋白的表达量和可溶性16。因此，将目标基因克隆至含有此类表达标签的质粒（如pET-32a(+)和pET SUMO）中将有助于蛋白表达（步骤3.2.3）。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导温度是影响原核表达蛋白可溶性的另外两个关键参数16。为进一步减少包涵体的形成，需对IPTG浓度和诱导温度进行优化。最佳IPTG浓度和诱导温度主要取决于质粒类型和菌株种类。在本方案中，IPTG浓度和诱导温度分别优化为0.2 mM和20–22 °C（步骤4.2.3）。此外，温.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
本工作得到了扬州大学特聘教授启动基金、江苏省特聘教授启动基金、江苏省“六大人才高峰”项目（项目编号：2014-SWYY-016）以及江苏省高校优势学科建设工程（兽医学）项目的资助。感谢扬州大学测试中心在黄酮类化合物的高效液相色谱和质谱分析方面提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2× Pfu MasterMix | 北京科为博生物科技有限公司 | CW0717A | 高保真基因的PCR扩增 |
| Agilent 1200 系列 RRLC 系统配备 Agilent 6460 三重四极杆 LC/MS 系统 | Agilent Technologies, Inc | N/A | 用于黄酮类化合物HPLC/MS分析的设备 |
| Agilent MassHunter 工作站（版本 B.03.01） | 安捷伦科技有限公司 | N/A | 用于从配备安捷伦6460三重四极杆LC/MS系统的安捷伦1200系列RRLC系统采集数据的软件 |
| 二氢槲皮素 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | 91216 | 从柚皮素生产山奈酚的中间产物 |
| 二氢槲皮素 | 中国四川中药标准物质中心 | PCS0371 | 从柚皮芹菜素合成槲皮素的中间产物 |
| DNA 纯化试剂盒 | 北京科为博生物科技有限公司 | CW2301 | PCR扩增或凝胶纯化DNA的纯化 |
| 柚皮素 | 上海源野生物科技有限公司 | B21160 | 生产槲皮素的底物 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 北京科为博生物科技有限公司 | CW0809 | 用于表达目的基因的细菌菌株 |
| Escherichia coli DH5α | 北京科为博生物科技有限公司 | CW0808 | 用于质粒扩增的细菌菌株 |
| FreeZone 1 升台式冷冻干燥系统 | Labconco Corporation | 7740020 | 用于冻干溶解于有机溶剂中黄酮类化合物的设备 |
| 凝胶回收试剂盒 | 北京科为博生物科技有限公司 | CW2302 | 从琼脂糖凝胶中纯化DNA条带 |
| 凝胶成像系统 | 上海塔能科学 & Technology Co. Ltd. | 中国台湾<黄酮醇是一类具有多种生物和药理活性的黄酮类化合物主要亚类。本文提供一种体外酶法合成黄酮醇的方法。该方法将黄酮醇生物合成途径中的两个关键基因 Atf3h 和 Atfls1 克隆并在大肠杆菌中过表达。通过亲和层析纯化重组酶后，在特定合成缓冲液中构建双酶级联反应体系。以两种黄酮醇的合成为例，通过薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC/LC/MS）进行分析鉴定。该方法在黄酮醇衍生物制备方面较其他方法具有显著优势，省时省力且成本效益高。反应过程易于精确控制，便于放大进行大规模生产。由于反应体系组分简单，目标产物易于纯化。然而，该体系通常仅限于由黄烷酮合成黄酮醇。> 2500 | 用于在琼脂糖凝胶上可视化DNA条带或在聚酰胺TLC板上可视化黄酮类斑点的设备 |
| GenElute 质粒小提试剂盒 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | PLN350-1KT | 质粒的小量制备 |
| 山奈酚 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | 60010 | 最终反应产物与标准物质 |
| MassHunter 定性分析（版本 B.01.04） | 安捷伦科技有限公司 | N/A | 一种用于分析HPLC/LC/MS数据的软件 |
| NanoDrop 微量紫外-可见分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | 用于测定 DNA/RNA 浓度的设备 |
| 柚皮素 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | N5893 | 产生山奈酚的底物 |
| Ni-IDA 琼脂糖树脂 | 北京科为博生物科技有限公司 | CW0010 | His标签融合蛋白的纯化 |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | 用于克隆和表达目的基因的质粒 |
| 质粒测序 | GENEWIZ 苏州 | N/A | 重组质粒测序 |
| 引物合成 | GENEWIZ 苏州 | N/A | PCR引物的合成 |
| 槲皮素 | 上海阿拉丁生化科技股份有限公司 | Q111273 | 终反应产物与标准物质 |
| SuperRT cDNA合成试剂盒 | 北京科为博生物科技有限公司 | CW0741 | 从总RNA合成第一链cDNA |
| T4 DNA连接酶 | 赛默飞世尔科技 | EL0016 | 将插入片段连接至线性化载体DNA |
| Trizol | 赛默飞世尔科技 | 15596018 | 总RNA的提取 |
| Vector NTI Advance | 赛默飞世尔科技 | 12605099 | 一款用于PCR引物设计和DNA序列分析的软件 |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | 一种用于分析HPLC数据的软件 |
参考文献
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222(2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Cha....
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重印与许可
