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通过构建一锅法双酶级联反应实现黄烷酮向黄酮醇的生物合成

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DOI：

10.3791/59336

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2019年8月14日

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1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, 2Key Laboratory of Prevention and Control of Biological Hazard Factors (Animal Origin) for Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture of China, Yangzhou University, 3Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety, Yangzhou University, 4Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 5The Testing Center, Yangzhou University

本文内容

摘要

黄酮醇的衍生化对其在医疗保健和食品工业中的应用至关重要。本文提供了一种由黄烷酮生物合成黄酮醇的详细实验方案，并讨论了其中的关键步骤及其相较于其他方法的优势。

摘要

黄酮醇是黄酮类化合物中的一个重要亚类，具有多种生物学和药理学活性。本文提供一种黄酮醇的体外酶法合成方法。该方法将黄酮醇生物合成途径中的两个关键基因Atf3h和Atfls1克隆并在大肠杆菌（Escherichia coli）中过表达。通过亲和层析纯化获得重组酶，随后在特定的合成缓冲体系中构建双酶级联反应。以该体系合成了两种黄酮醇作为示例，并通过薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC/LC/MS）进行鉴定。该方法在黄酮醇的制备方面相较于其他方法具有明显优势，具有省时、省力且成本效益高的特点。反应过程易于精确控制，因而可放大用于大规模生产。由于反应体系组分简单，目标产物易于纯化。然而，该体系通常仅限于由黄烷酮前体合成黄酮醇。

引言

黄酮醇是植物黄酮类化合物的一个主要亚类，参与植物的发育和着色过程1,2,3。更重要的是，这类化合物具有多种有益健康的活性，例如抗癌4,5、抗氧化6、抗炎7、抗肥胖8、抗高血压9以及改善记忆的能力10，因而引发了大量针对这些植物来源的次生代谢产物的研究。传统上，这些化合物主要通过有机溶剂从植物中提取获得。然而，由于其在植物中的含量极低11,12,13，大多数黄酮醇的生产成本仍然较高，严重限制了其在医疗保健和食品工业中的应用。

在过去的几十年中，科学家已开发出多种获取黄酮类化合物的方法14,15。然而，这些复杂分子的化学合成存在多种固有缺陷16。该方法不仅需要使用有毒试剂和极端反应条件，还需要经过多个步骤才能获得目标黄酮类化合物14,17。此外，该策略面临的另一个重要挑战是活性黄酮类分子的手性合成。因此，通过化学合成法大规模生产黄酮类化合物并非理想的策略16,17。

近年来，科学家开发出一种颇具前景的替代策略，通过构建含有黄酮类生物合成途径的微生物来生产这些复杂的天然化合物18,19,20,21,22，该途径在植物中已被成功解析23。例如，Duan 等人将一条生物合成途径导入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，实现了山奈酚（KMF）的生产24。Malla 等人则通过将黄烷酮3-羟化酶（f3h）、黄酮醇合酶（fls1）以及UDP-葡萄糖：黄酮类3-O-葡萄糖基转移酶UGT78K1基因导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，成功合成了糖基化黄酮醇——毛蕊异黄酮苷（astragalin）17。尽管已有不少成功范例，但由于细胞平台的复杂性、人工合成的遗传元件与宿主之间的不兼容性、目标产物对宿主细胞的抑制作用，以及工程化细胞系统本身的不稳定性，许多基因工程微生物仍无法有效生成目标产物16。

黄酮类化合物生产的另一种有前景的替代策略是在体外构建多酶级联反应。Cheng 等人报道，通过在一锅体系中组装完整的酶促途径，可成功合成 enterocin 聚酮化合物25。这种无细胞合成策略规避了微生物生产工厂的限制，因此适用于大量生产某些黄酮类化合物16。

最近，我们已成功开发出一种双酶合成系统，可将柚皮素（NRN）在一锅反应中转化为KMF16。本文详细描述了该系统及产物分析所涉及的方法。此外，我们还展示了两个应用该系统分别从柚皮素（NRN）和埃里多替醇（ERD）生成KMF和槲皮素（QRC）的实例。同时，我们讨论了该方法中的关键步骤以及黄酮类化合物生物合成领域的未来研究方向。

方案

1. 从植物组织中分离总RNA26,27

  1. 匀浆植物组织。
    1. 取100 mg新鲜植物组织（例如拟南芥Arabidopsis thaliana的4周龄幼苗）。用液氮速冻组织以及研钵和研杵，随后将组织研磨成粉末。
    2. 向研钵中加入1 mL RNA提取试剂（见材料表）。试剂会立即冻结，在冻结的试剂融化后，用研杵充分匀浆组织样品。
    3. 将匀浆液转移至1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以12,000 × g离心5分钟，然后将澄清的匀浆液上清转移至另一新的1.5 mL离心管中。
    4. 将匀浆样品在室温下孵育5分钟。
  2. 提取总RNA。
    1. 向匀浆液中加入0.2 mL氯仿，盖紧管盖，用手剧烈振荡15秒，并在室温下孵育5分钟。
    2. 在4 °C条件下以12,000 × g离心15分钟，将无色的上层水相转移至新的1.5 mL离心管中。离心后样品分为三层。
    3. 向上层水相中加入0.5 mL异丙醇，用手剧烈振荡混匀，并在室温下孵育10分钟。
    4. 在4 °C条件下以12,000 × g离心10分钟，弃去上清液。
    5. 用1 mL 75%乙醇通过涡旋洗涤RNA沉淀一次，随后在4 °C条件下以7,500 × g离心5分钟。
    6. 重复步骤1.2.5。
    7. 将沉淀在空气中干燥5–10分钟，然后用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水通过吹打重悬RNA，随后使用微量分光光度计测定总RNA浓度（见材料表）。

2. 合成互补DNA（cDNA）28

  1. 使用试剂盒合成 cDNA 第一链（参见材料表）。按照表 1建立 20 μL 反应体系，在 PCR 仪中于 42 °C 孵育 50 分钟，随后在 85 °C 终止反应 5 分钟。将反应产物于 -20 °C 保存，用于后续基因扩增。
试剂体积
dNTP Mix, 2.5mM each4.0 μL
引物混合液2.0 μL
RNA 模板1.0 μg
逆转录酶缓冲液, 5×4.0 μL
逆转录酶, 200 U/μL1.0 μL
无RNase水 H2O加至 20.0 μL

表1：将总RNA逆转录为cDNA

3. 构建重组质粒29

  1. 设计PCR引物。
    1. 使用软件（参见材料表）根据从GenBank数据库获得的关键酶基因序列设计PCR引物，并由公司（参见材料表）合成引物。在引物的5’端添加限制性酶切位点（例如，本方案中使用BamHI或EcoRI）。
      注意：本研究中使用的引物见表2。
序列，5' → 3'目的
AAGGATCCATGGCTCCAGGAACTTTGACT用于PCR扩增的上游引物 Atf3h 基因来自 拟南芥 BamHI位点以斜体标出，并附上用于克隆至pET32a(+)中。
AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTGGTCGA用于PCR扩增的反向引物 Atf3h 基因来自 A. thaliana 大肠杆菌RI位点以斜体标出，并附上用于克隆至pET32a(+)中。
AAGGATCCATGGAGGTCGAAAGAGTCCA用于PCR扩增的上游引物 Atfls1 基因来自 A. thaliana BamHI位点以斜体标出，并附上用于克隆至pET32a(+)中。
AAGAATTCTCAATCCAGAGGAAGTTTAT用于PCR扩增的反向引物 Atfls1 基因来自 A. thaliana 生态RI位点以斜体标出，并附上用于克隆至pET32a(+)中。

表2：本研究中使用的寡核苷酸引物

  1. 将基因克隆至原核表达载体中。
    1. 使用高保真DNA聚合酶（参见材料表），从合成的cDNA第一条链中扩增目标基因。按照表3所示配置100 μL PCR反应体系，并运行以下PCR循环程序：94 °C预变性2 min；随后进行35个循环，每个循环包括94 °C变性30 s、55 °C退火2 min、72 °C延伸1 min；最后在72 °C下终延伸10 min。将反应体系冷却至12 °C。
      注：延伸时间可变，通常由基因长度决定，大多数DNA聚合酶的聚合速度约为每分钟1000个碱基。
    2. 取PCR产物（通常为5 μL）在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，并使用DNA纯化试剂盒（参见材料表）从剩余产物中纯化目标DNA片段。
    3. 使用限制性内切酶（本实验方案中例如BamHI或EcoRI）对纯化的DNA片段和载体（如pET-32a(+)）进行双酶切。按照表4所示在0.2 mL PCR管中配置50 μL反应体系，37 °C孵育3 h。将酶切后的DNA在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。
    4. 使用凝胶回收试剂盒回收目标DNA条带（参见材料表）。进一步使用DNA纯化试剂盒进行纯化（参见材料表），随后使用微量分光光度计测定DNA浓度（参见材料表）。
    5. 使用T4 DNA连接酶（参见材料表）将基因片段连接至线性化载体DNA中。按照表5所示在1.5 mL离心管中配置连接反应体系，室温孵育2–3 h。
      注：插入片段与载体的摩尔比可变，通常在3:1至10:1之间。
    6. 取2.5 μL连接反应产物加入50 μL化学感受态Escherichia coli细胞（如TOP10或DH5α）中，轻轻混匀，冰上静置30 min。42 °C热激90 s后立即置于冰上冷却2 min。
    7. 向管中加入200 μL不含抗生素的液体LB培养基，37 °C、220 rpm振荡培养1 h。取50–100 μL菌液涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37 °C过夜培养。
试剂体积
Pfu Master Mix, 2×50.0 μL
正向引物, 10 μM4.0 μL
反向引物, 10 μM4.0 μL
cDNA2.0 μL
H2O40.0 μL

表3：PCR反应体系的建立

试剂体积
DNA 片段/载体3.0 μg
BamHI1.0 μL
EcoRI1.0 μL
Cutsmart Buffer, 10×5.0 μL
H2O加至 50.0 μL

表4：DNA片段/载体的双酶切

试剂体积
插入片段X μL (0.09 pmol)
载体Y μL (0.03 pmol)
连接缓冲液，10×1.0 μL
T4 DNA 连接酶，400 U/μL1.0 μL
H2O加至 10.0 μL

表5：将基因片段连接至线性化载体

  1. 筛选阳性克隆。
    1. 从LB平板上挑取单个菌落，接种于200 μL含有100 μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37 °C、250 rpm振荡培养2 - 3小时。
      注：通常挑选4 - 8个菌落进行阳性克隆的筛选。
    2. 设置10 μL的菌落PCR反应，反应体系与步骤3.2.1类似。
      注：使用1 μL LB培养物代替1 μL cDNA模板。
    3. 在1%琼脂糖凝胶上检测PCR产物。将PCR结果为阳性的剩余菌液接种于3 mL含有100 μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37 °C、250 rpm振荡培养14 - 16小时。
    4. 使用质粒小提试剂盒（见材料表）从重组E. coli培养物中提取质粒DNA。
    5. 通过双酶切分析（例如本实验方案中的BamHI和EcoRI）鉴定纯化的重组质粒。设置10 μL反应体系，方法同步骤3.2.3，随后在37 °C孵育3小时。在1%琼脂糖凝胶上观察从重组质粒中释放出的特异性条带。
  2. 验证阳性重组质粒的序列。
    1. 将质粒送至测序公司进行测序。使用DNA序列分析软件（见材料表）分析测序结果，将测序公司提供的序列与GenBank数据库中的参考序列进行比对。

4. 表达重组酶蛋白30

  1. 将正确的重组质粒转化至感受态E. coli BL21(DE3)中。
    1. 在1.5 mL离心管中，将0.1 μL质粒加入10 μL置于冰上的感受态E. coli BL21(DE3)中，冰浴5分钟。
    2. 在42 °C水浴中热激90秒，然后再次置于冰上2分钟。
    3. 加入200 μL不含抗生素的LB液体培养基，于37 °C、220 rpm摇床中培养5分钟。
    4. 取50 μL转化产物涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，37 °C培养箱中过夜培养。
  2. 诱导基因表达。
    1. 从平板上挑取3 - 5个单菌落，接种至含3 mL、100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基的离心管中，于37 °C、250 rpm摇床中过夜培养。
    2. 将全部过夜培养物转移至含300 mL、100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37 °C、250 rpm摇床中培养，直至菌液在600 nm处的光密度值达到0.4 - 0.6。
    3. 向培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为0.2 mM，在20 - 22 °C、250 rpm条件下诱导表达3小时。

5. 纯化重组酶蛋白31

  1. 在 4 °C、12,000 × g 条件下离心培养物 10 分钟，收集细菌。
  2. 将菌体沉淀重悬于 15 mL 细菌裂解缓冲液中，缓冲液含有 0.1% Triton X-100、1 mM EDTA、10% 甘油、150 mM NaCl、0.5 mM DTT、0.1 mM PMSF、1 μg/mL 抑肽酶（aprotinin）、1 μg/mL 亮抑蛋白酶肽（leupeptin）和 1 μg/mL 胃蛋白酶抑制剂（pepstatin），溶于 50 mM Tris-Cl（pH 8.0）。
  3. 超声处理细菌悬液以释放重组酶蛋白，随后在 4 °C、13,000 × g 条件下离心 10 分钟。
  4. 收集上清液，分装至 1.5 mL 离心管中，每管 1 mL，并于 -70 °C 保存以备后续使用。
  5. 将 500 μL His-tag 纯化树脂（见材料表）装入可重复使用的空亲和层析柱中。用 5 个柱体积的去离子水洗涤树脂，以去除储存液中的乙醇。再用 10 个柱体积的结合缓冲液（含 Tris-Cl（20 mM，pH 7.9）、咪唑（10 mM）和 NaCl（0.5 M））平衡树脂。
  6. 将第 5.4 步所得 4 mL 上清液加入上述树脂的悬液中，并用塞子封闭层析柱两端。
  7. 将混合物在 4 °C 下低速旋转孵育 2 小时。
  8. 在洗脱前，以 1 mL/min 的流速，用 15 个柱体积的结合缓冲液在 4 °C 下洗涤与融合蛋白结合的树脂。
  9. 向层析柱中加入 500 μL 洗脱缓冲液（含 20 mM Tris-Cl（pH 7.9）、500 mM 咪唑、0.5 M NaCl），并在 4 °C 下低速旋转孵育 10 分钟。收集洗脱液作为纯化的蛋白样品。
  10. 重复步骤 5.5 共四次。
  11. 依次用 10 个柱体积的去离子水和 3 个柱体积的 20% 乙醇洗涤树脂。将树脂浸泡在 20% 乙醇中，用塞子封闭层析柱，并于 4 °C 保存。
  12. 采用 Bradford 蛋白定量法测定纯化蛋白的浓度。通过 10% SDS-PAGE 凝胶电泳分析蛋白纯度，并用考马斯亮蓝染色法显色观察蛋白条带。
  13. 向纯化的蛋白溶液中加入甘油，使其终浓度为 10%，以稳定酶活性。分装后于 -80 °C 保存。

6. 从黄烷酮制备黄酮醇 在一个 体外 双酶合成系统16

  1. 准备缓冲液。
    1. 配制不含硫酸亚铁的2×合成缓冲液，其成分为200 mM Tris-HCl（pH 7.2）、16.4 mM α-酮戊二酸、0.8% 抗坏血酸钠和20% 甘油。将1.938 g Tris碱、0.640 g 抗坏血酸钠、0.250 g α-酮戊二酸和16 mL 甘油溶解于64 mL 去离子水中。用盐酸（HCl）调节pH至7.2，再加去离子水定容至80 mL。将缓冲液于4 °C保存以备后续使用。
    2. 配制100×硫酸亚铁储备液（2 mM）。将55.6 mg 七水合硫酸亚铁溶解于50 mL 去离子水中，搅拌后加水定容至100 mL。
    3. 配制25 mM 黄酮类化合物储备液。将黄酮类化合物充分溶解于甲醇中，并于-20 °C保存。
  2. 建立由黄烷酮合成黄酮醇的反应体系。
    1. 按照表6所示准备合成反应体系。
    2. 在40 °C、600 rpm条件下（使用振荡加热金属块），于敞口的2.0 mL离心管中孵育反应40分钟。
    3. 加入10 μL乙酸和100 μL乙酸乙酯终止反应。
    4. 两小时后，将有机相转移至1.5 mL离心管中，在室温下通风橱内进行空气干燥。
试剂体积
不含硫酸亚铁的2×合成缓冲液50.0 μL
25 mM 黄酮醇2.0 μL
2 mM 硫酸亚铁0.5 μL
1 mg/mL AtF3H2.5 μL
1 mg/mL AtFLS12.5 μL
25 mM 黄烷酮2.0 μL
H2O加至 100.0 μL

表6：本方案中使用的合成系统。

7. 分析反应产物

  1. 薄层色谱（TLC）分析。
    1. 合并步骤 6.2.4 中得到的 5 管黄酮类样品，取出 300 μL 进行风干。将黄酮粉末重新溶解于 160 μL 甲醇中。用甲醇配制浓度分别为 12.5、25、50、100 和 200 ng/μL 的标准黄酮类化合物样品。取 1 μL 反应样品和标准黄酮类样品点样至聚酰胺 6 薄层板上。
    2. 使用氯仿/甲醇/乙酸乙酯/甲酸按 5.0:1.5:1.0:0.5 比例组成的展开剂系统展开点样后的薄层板。
    3. 在室温下将薄层板风干，喷洒 1% 的三氯化铝（AlCl3）乙醇溶液，随后再次于室温下风干。
    4. 30 分钟后，在 254 nm 紫外光下观察并成像薄层板上的斑点。
    5. 使用图像处理软件（例如本方案中的 ImageJ v1.51j8）分析图像中各斑点的灰度值。
      1. 打开 ImageJ 软件。点击 文件 > 打开，以打开待分析的图像。
      2. 点击 ImageJ 用户界面中最左侧的矩形选择工具。用鼠标圈定图像中的感兴趣区域（ROI），然后按下 静力平衡图示；ΣFx=0 方程；力平衡；物理系统分析。 键标记第一个 ROI。
      3. 用鼠标将矩形选择框向右移动至下一个 ROI，然后按下 光学透镜公式，1/f = 1/v - 1/u，用于测定透镜系统焦距的图示。 键标记第二个 ROI。
      4. 重复上一步操作，标记所有其他 ROI。
      5. 按下 静力平衡，ΣFx=0 方程，图示使用力矢量和力矩进行平衡分析。 键，在弹出窗口中生成所有 ROI 的轮廓图。
        注意：此时 ImageJ 用户界面中的直线选择工具将自动激活。
      6. 使用直线选择工具绘制基线，为每个感兴趣的峰定义封闭区域。
      7. 点击 ImageJ 用户界面中对应的图标以激活魔棒工具。点击峰内部区域，结果将在弹出窗口中显示所有峰的数据。
    6. 以步骤 7.1.5.7 得到的灰度值对步骤 7.1.1 中对应的标准黄酮浓度作图，绘制基于 TLC 的标准曲线。然后根据所得公式计算本方案中目标黄酮的产量。
  2. 高效液相色谱（HPLC）和液相色谱/质谱（LC/MS）分析
    1. 将步骤 7.1.1 得到的样品依次通过 0.45 μm 和 0.22 μm 滤膜处理。
    2. 将样品注入 HPLC/LC/MS 系统（参见材料表），使用 C18 色谱柱（4.6 × 150 mm；内径 5 μm）在 30 °C 下进行分离。以乙腈（ACN）-水体系进行梯度洗脱，流速为 1.0 mL/min（0 - 10 min，10 - 25% ACN；10 - 35 min，25 - 50% ACN；35 - 45 min，50 - 85% ACN；45 - 50 min，85 - 10% ACN；50 - 60 min，10% ACN），同时监测 200 至 800 nm 范围内的洗脱液吸光度。在负离子模式下进行 LC/MS 分析，干燥氮气流速为 10 L/min，温度 300 °C，鞘气流速为 7 L/min，温度 250 °C，并使用内置软件采集数据（参见材料表）。
    3. 使用软件提取单波长色谱图，计算反应样品和标准黄酮化合物的峰面积（参见材料表）。
      1. 打开定性分析程序，点击 文件 > 打开数据文件。在打开数据文件窗口中选择待分析的文件，点击打开以加载文件。
      2. 在色谱图结果窗口中右击鼠标，从弹出菜单中选择提取色谱图。
      3. 打开提取色谱图对话框。在类型列表中点击其他色谱图，在检测器下拉框中选择 DAD1，然后点击确定，在色谱图结果窗口中显示 HPLC 结果。
      4. 点击位于色谱图结果窗口顶部的手动积分图标。使用鼠标为需要手动积分分析的峰绘制基线。
      5. 点击 查看 > 积分峰列表 以显示结果。
    4. 以步骤 7.2.3.5 得到的峰面积对步骤 7.2.1 中对应的标准黄酮浓度作图，绘制基于 HPLC 的标准曲线。然后根据所得公式计算本方案中目标黄酮的产量。
    5. 使用软件分析黄酮类化合物的质谱数据以确定其精确分子量（参见材料表）。
      1. 重复步骤 7.2.3.1 - 7.2.3.3。
      2. 点击色谱图结果工具栏上的范围选择图标。
      3. 选择目标峰，在选定范围内右击鼠标，从弹出菜单中点击提取质谱图，结果将在质谱图结果窗口中显示。

结果

F3H 和 FLS1 是植物中将黄烷酮转化为黄酮醇的两个关键酶，如图1所示。为了建立一个体外生物合成系统以从黄烷酮生产黄酮醇，从4周龄的A. thaliana幼苗中克隆了Atf3h（GenBank登录号NM_114983.3）和Atfls1（GenBank登录号NM_120951.3）基因，并将其插入原核表达载体pET-32a(+)中。将重组质粒转化至E. coli BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达融合蛋白，随后使用Ni-IDA琼脂糖树脂进行纯化。如图2所示，纯化后的融合蛋白在10% SDS-PAGE凝胶上的纯度超过95%，足以用于建立体外双酶级联反应系统。

Flavonoid biosynthesis process diagram with chemical structures, enzyme reactions for plant metabolites.
图1：黄酮醇由黄酮酮生物合成的示意图体外.F3H，黄烷酮3-羟化酶；FLS1，黄酮醇合酶1。 请点击此处以查看此图的放大版本。

显示蛋白质条带及以千道尔顿为单位的分子量标记的SDS-PAGE凝胶电泳图。
图2：重组AtF3H和AtFLS1蛋白的纯化。 从4周龄的拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗中克隆Atf3h和Atfls1基因，插入原核表达载体pET-32a(+)中，并在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)中进行表达。重组蛋白通过填充有Ni-IDA琼脂糖树脂的亲和层析柱进行纯化。纯度通过10% SDS-PAGE凝胶电泳检测。M，蛋白分子量标记；1，重组AtF3H蛋白；2，重组AtFLS1蛋白。 请点击此处查看该图的放大版本。

为了建立一个使用纯化重组蛋白的双酶级联反应体系，制备了如表6所示的合成系统。为确定该系统是否可用于将黄烷酮转化为黄酮醇，向体系中加入了NRN，并通过薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC/LC/MS）分析检测了KMF的生物合成。如图3A所示，在聚酰胺TLC板上出现了两个新斑点。其中一个斑点的迁移距离与二氢槲皮素（DHK）相似，另一个与KMF相似。进一步通过HPLC和LC/MS分析表明，这两种新化合物的保留时间分别为11.91 min和20.16 min（图3B），准分子离子峰[M−H]−分别为m/z 287.0500和285.0500（图3C），与DHK和KMF的数据完全一致。这些结果表明，该系统能够由NRN生成KMF，产量高达34.94 mg/L。

NRN、DHK、KMF 标准品的色谱结果；保留时间图谱及质谱分析。
图 3：通过双酶级联反应由 NRN 合成 KMF。 （A）采用聚酰胺薄层色谱（TLC）分析一锅法反应产物。1，NRN 标准品；2，DHK 标准品；3，KMF 标准品；4，反应混合物。（B）反应产物的高效液相色谱（HPLC）分析图谱。NRN、DHK 和 KMF 的保留时间分别为 18.74 min、11.91 min 和 20.16 min。（C）反应混合物中黄酮类化合物的质谱（MS）分析图谱。请点击此处查看该图的高清版本。

为了进一步确定该体外系统是否可用于将其他黄烷酮转化为相应的黄酮醇，将柚皮素（ERD）加入该系统，以检测ERD能否转化为槲皮素（QRC）。如图4A所示，在聚酰胺薄层色谱板上出现两个新斑点，其迁移距离分别与二氢槲皮素（DHQ）和QRC相似。高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC/MS）分析表明，这两种新化合物的保留时间分别为10.03 min和16.23 min（图4B），准分子离子峰[M−H]−分别为m/z 303.1000和301.1000（图4C），恰好与DHQ和QRC的数据一致。上述结果表明，该系统可将ERD转化为QRC，产量为25.55 mg/L。

色谱图：用于ERD、DHQ、QRC分析的薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）色谱图及质谱图。
图4：在双酶合成系统中由ERD生成QRC。（A）通过聚酰胺薄层色谱（TLC）对反应产物进行分析。1，ERD标准品；2，DHQ标准品；3，QRC标准品；4，反应混合物。（B）反应产物的高效液相色谱（HPLC）分析图谱。ERD、DHQ和QRC的保留时间分别为15.45 min、10.03 min和16.23 min。（C）反应混合物中各化合物的质谱（MS）分析图谱。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

许多研究致力于黄酮醇的制备，因其在医疗保健和食品工业中具有潜在应用价值。然而，传统的植物提取方法使用有机溶剂，以及化学合成方法，均存在固有缺陷，限制了黄酮醇的生产应用。本文报道了一种通过构建体外双酶级联反应，在单一体系中由黄烷酮一步生成黄酮醇的详细方法。该方案的关键步骤包括：1）获得高活性的纯化重组酶；2）建立单一体系中的双酶反应级联。通常情况下，植物来源的基因在细菌中表达时倾向于形成包涵体，导致酶活性丧失。众所周知，某些肽段（如TrxA和SUMO）有助于提高在细菌中表达的重组蛋白的表达量和可溶性16。因此，将目标基因克隆至含有此类表达标签的质粒（如pET-32a(+)和pET SUMO）中将有助于蛋白表达（步骤3.2.3）。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导温度是影响原核表达蛋白可溶性的另外两个关键参数16。为进一步减少包涵体的形成，需对IPTG浓度和诱导温度进行优化。最佳IPTG浓度和诱导温度主要取决于质粒类型和菌株种类。在本方案中，IPTG浓度和诱导温度分别优化为0.2 mM和20–22 °C（步骤4.2.3）。此外，温度和甘油是纯化和保存重组酶过程中维持其稳定性和活性的两个重要参数。在本方案中，必须在4 °C条件下进行重组蛋白的纯化（步骤5.5–5.12），向纯化后的酶溶液中添加10%甘油（步骤5.13），并立即分装后于-80 °C保存（步骤5.13）。在构建单一体系反应级联时，pH值和温度是两个至关重要的参数。显然，过高的pH值不利于反应转化，因为在该条件下，亚铁离子（Fe2+）——重组F3H和FLS1酶活性所必需的组分——会形成氢氧化亚铁絮状沉淀而失活16,32,33。尽管相对较高的温度有助于酶催化反应的进行，但温度过高会导致酶失活。因此，稳定反应体系的pH值和温度对转化反应至关重要。我们先前的研究已确定最佳pH值和反应温度分别为7.2和40 °C（步骤6）16。

本方案可方便地通过使用不同底物，从多种黄烷酮生物合成一系列黄酮醇。本方案中提供了两个示例。如图3所示，当将NRN作为底物加入该系统时，生成了新的化合物。薄层色谱（TLC）和高效液相色谱/液相色谱-质谱（HPLC/LC/MS）分析表明，新生成的化合物为二氢堪非醇（DHK）和堪非醇甲醚（KMF），且NRN在该系统中被转化为KMF。为进一步确证结果的可靠性，可能需要通过1H NMR（氢-1核磁共振）、13C NMR（碳-13核磁共振）、NOESY（核奥弗豪泽效应谱）、XRD（X射线粉末衍射）、元素分析（CHN分析仪）等光谱表征手段，以确认新化合物的存在。类似地，在该双酶级联反应中，ERD也可成功转化为QRC（图4）。 

该方法存在一个重要局限性。根据已知的黄酮类化合物生物合成途径，该系统可利用芳香族氨基酸或其下游衍生物生成黄酮醇。例如，KMF 可通过一系列关键酶从 p-香豆酸生成，这些酶包括4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）、查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、F3H 和 FLS23。类似地，QRC 可利用相同的这组关键酶从咖啡酸生成（未发表数据）。然而，为了将 p-香豆酸转化为 KMF，系统中需要添加辅酶A（CoA）、ATP 和丙二酰辅酶A（manonyl-CoA），这将显著增加生产成本。因此，该系统通常仅限于将黄烷酮转化为二氢黄酮醇或黄酮醇。此外，起始原料的完全转化是另一项挑战。为进一步提高该系统的效率，未来的研究应聚焦于从其他植物中筛选具有高活性的关键酶、对编码关键酶的基因进行突变、将高活性酶固定于惰性载体上，以及开发更优的缓冲体系。

这种单反应体系的双酶合成系统相较于其他黄酮醇制备方法（如化学合成、微生物细胞工厂以及使用有机溶剂的植物提取法）具有明显的内在优势16。首先，反应时间极短，仅需40分钟，因此该生产系统节省人力和时间。其次，该系统不存在微生物细胞工厂中存在的复杂生理调控机制，且所有组分明确，因而易于精确控制反应过程，便于今后进一步优化。第三，由于该反应体系仅包含简单化学品和纯化的重组酶，并且只生成一种主要中间产物（如图3和图4所示），因此预期该体系中生成的目标分子比来自细胞工厂或植物的更易于纯化。第四，该系统的主要组分为常见且廉价的化学品以及原核表达的重组酶，因此该方法在获取目标黄酮类化合物方面具有很高的成本效益。第五，由于该系统组分简单，易于实现目标黄酮类化合物的大规模生产，显示出巨大的产业化潜力。此外，该系统也为其他次生代谢产物的经济化生产提供了参考。

披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

本工作得到了扬州大学特聘教授启动基金、江苏省特聘教授启动基金、江苏省“六大人才高峰”项目（项目编号：2014-SWYY-016）以及江苏省高校优势学科建设工程（兽医学）项目的资助。感谢扬州大学测试中心在黄酮类化合物的高效液相色谱和质谱分析方面提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2× Pfu MasterMix北京科为博生物科技有限公司CW0717A高保真基因的PCR扩增
Agilent 1200 系列 RRLC 系统配备 Agilent 6460 三重四极杆 LC/MS 系统Agilent Technologies, IncN/A用于黄酮类化合物HPLC/MS分析的设备
Agilent MassHunter 工作站（版本 B.03.01）安捷伦科技有限公司N/A用于从配备安捷伦6460三重四极杆LC/MS系统的安捷伦1200系列RRLC系统采集数据的软件
二氢槲皮素Sigma-Aldrich 公司有限责任公司91216从柚皮素生产山奈酚的中间产物
二氢槲皮素中国四川中药标准物质中心PCS0371从柚皮芹菜素合成槲皮素的中间产物
DNA 纯化试剂盒北京科为博生物科技有限公司CW2301PCR扩增或凝胶纯化DNA的纯化
柚皮素上海源野生物科技有限公司B21160生产槲皮素的底物
Escherichia coli BL21(DE3)北京科为博生物科技有限公司CW0809用于表达目的基因的细菌菌株
Escherichia coli DH5α北京科为博生物科技有限公司CW0808用于质粒扩增的细菌菌株
FreeZone 1 升台式冷冻干燥系统Labconco Corporation7740020用于冻干溶解于有机溶剂中黄酮类化合物的设备
凝胶回收试剂盒北京科为博生物科技有限公司CW2302从琼脂糖凝胶中纯化DNA条带
凝胶成像系统上海塔能科学 & Technology Co. Ltd.中国台湾<黄酮醇是一类具有多种生物和药理活性的黄酮类化合物主要亚类。本文提供一种体外酶法合成黄酮醇的方法。该方法将黄酮醇生物合成途径中的两个关键基因 Atf3h 和 Atfls1 克隆并在大肠杆菌中过表达。通过亲和层析纯化重组酶后，在特定合成缓冲液中构建双酶级联反应体系。以两种黄酮醇的合成为例，通过薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC/LC/MS）进行分析鉴定。该方法在黄酮醇衍生物制备方面较其他方法具有显著优势，省时省力且成本效益高。反应过程易于精确控制，便于放大进行大规模生产。由于反应体系组分简单，目标产物易于纯化。然而，该体系通常仅限于由黄烷酮合成黄酮醇。> 2500用于在琼脂糖凝胶上可视化DNA条带或在聚酰胺TLC板上可视化黄酮类斑点的设备
GenElute 质粒小提试剂盒Sigma-Aldrich 公司有限责任公司PLN350-1KT质粒的小量制备
山奈酚Sigma-Aldrich 公司有限责任公司60010最终反应产物与标准物质
MassHunter 定性分析（版本 B.01.04）安捷伦科技有限公司N/A一种用于分析HPLC/LC/MS数据的软件
NanoDrop 微量紫外-可见分光光度计Thermo Fisher ScientificND-8000-GL用于测定 DNA/RNA 浓度的设备
柚皮素Sigma-Aldrich 公司有限责任公司N5893产生山奈酚的底物
Ni-IDA 琼脂糖树脂北京科为博生物科技有限公司CW0010His标签融合蛋白的纯化
pET-32a(+)Novagen69015-3用于克隆和表达目的基因的质粒
质粒测序GENEWIZ 苏州N/A重组质粒测序
引物合成GENEWIZ 苏州N/APCR引物的合成
槲皮素上海阿拉丁生化科技股份有限公司Q111273终反应产物与标准物质
SuperRT cDNA合成试剂盒北京科为博生物科技有限公司CW0741从总RNA合成第一链cDNA
T4 DNA连接酶赛默飞世尔科技EL0016将插入片段连接至线性化载体DNA
Trizol赛默飞世尔科技15596018总RNA的提取
Vector NTI Advance赛默飞世尔科技12605099一款用于PCR引物设计和DNA序列分析的软件
Xcalibur v2.0.7Thermo Fisher ScientificN/A一种用于分析HPLC数据的软件

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