本文介绍一种利用I型胶原制备两种不同形态培养基质的实验方案。根据胶原处理方式的不同，胶原分子可保持二维非纤维形态，或重组成三维纤维形态。I型胶原上细胞的增殖情况受纤维形成的影响极为显著。
本文内容
摘要
摘要
I型胶原蛋白可作为细胞培养的基质，存在两种形式：二维的非纤维形式和三维的纤维（纤丝）形式。这两种形式均可由同一种I型胶原蛋白制备而成。通常情况下，非纤维形式可促进细胞黏附和增殖。而纤维形式（凝胶）则为多种细胞提供更接近生理状态的环境；因此，凝胶培养适用于研究细胞的生理行为，例如药物疗效。
研究人员可根据使用目的选择合适的形式。例如，在角质形成细胞的研究中，凝胶表面培养已被用作伤口愈合模型。在I型胶原非纤维形式上培养的角质形成细胞系FEPE1L-8可促进细胞黏附。值得注意的是，角质形成细胞在纤维形式上的增殖速度较非纤维形式更慢。根据实验需求，用于细胞培养的I型胶原制备方案简单且具有广泛的应用前景。
引言
间质结缔组织由成分异质的三维蛋白质网状结构组成，主要成分为I型胶原原纤维1。胶原原纤维在细胞支架构建中发挥关键作用1,2,3，并与其他细胞外基质（ECM）蛋白相互作用3。在体外，根据处理方法的不同，可使用多种形式的I型胶原作为细胞培养的基质1,2,3,4。在酸性条件下，I型胶原保持非纤维形态5。使用非纤维形态的I型胶原包被培养皿表面可促进细胞黏附与增殖6,7。在生理pH值和温度条件下，I型胶原分子会重新组装成原纤维，形成具有三维结构的凝胶1,2,3,4,5,6,7,8。I型胶原的纤维形态与非纤维形态之间存在若干重要差异，包括基质刚度以及细胞在培养过程中对细胞外基质组分的重建效率1。基质刚度是细胞培养中研究最为广泛的调控因素之一1, 9。然而，基质与细胞之间的复杂相互作用仍有待阐明。为了研究细胞与环境因素之间的复杂相互作用，建立一个简单的系统十分有益。比较细胞在两种不同形态胶原上的行为可能有助于简化环境因素的影响分析。根据具体应用目的，可选择性地使用不同形态的I型胶原。正常情况下，角质形成细胞与基底膜接触，而不与I型胶原接触。但在伤口愈合过程中，角质形成细胞会迁移至真皮结缔组织，增殖并修复伤口10。
最近，我们通过使用模拟真皮结缔组织的I型胶原纤维形式培养系统，证明了细胞外钙浓度对角质形成细胞系增殖具有重要作用11。当角质形成细胞系FEPE1L-8在I型胶原的纤维形式上培养时，在细胞外钙浓度为30 μM的条件下，细胞呈圆形，且其增殖停止11。当钙浓度升高至1.8 mM时，细胞生长得以恢复11。在非纤维形式上培养时，细胞在两种钙浓度（30 μM和1.8 mM）下均可生长11，而在纤维形式上培养时，细胞对外源性钙浓度更为敏感。FEPE1L-8是通过将人宫颈癌来源的16型乳头瘤病毒转化基因E6和E7转染而获得，该细胞系无致瘤性，具有类似正常角质形成细胞的有限分化潜能和无限增殖能力12,13。FEPE1L-8细胞可使用多种角质形成细胞专用培养基进行维持培养，包括添加补充剂K-1的K110 Type-II培养基（K110）6。本文中，我们描述了人角质形成细胞系在I型胶原的非纤维形式和纤维形式上的培养方案。
方案
1. 角质形成细胞培养基的制备
注意：所有操作均须在无菌条件下进行。
- 使用移液管向500 mL K110 II型培养基（K110）中加入5 mL青霉素-链霉素溶液和10 mL添加剂补充剂K-1。
2. I型胶原纤维形态的制备
注意：在无菌条件下进行步骤2.6之前的所有操作。
- 将10倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS (-)）、去离子水、胶原蛋白、96孔培养板和一个空的2 mL离心管置于冰上。
注意：请勿使用同一块培养板同时制备纤维状和非纤维状胶原。 - 使用移液器将1.12 mL去离子水加入一个空的2 mL离心管中。再用移液器向该2 mL离心管中的去离子水中加入200 µL的10x PBS (-)。轻轻振荡混合数次。
- 使用移液器向上述2 mL离心管中加入0.66 mL胶原蛋白。轻轻且迅速地振荡混合数次。
注意：应尽可能避免溶液中产生气泡。胶原溶液应在使用前立即配制。 - 用移液器将步骤2.3中制备的胶原溶液各100 µL加入96孔培养板的每个孔中。轻轻左右摇晃培养板以使液体均匀铺展。
注意：确保胶原溶液完全覆盖各孔表面。若溶液未能覆盖整个孔底，可用移液器吸头轻轻推动液体使其铺展。应尽可能避免产生气泡。 - 将培养板放入CO2培养箱中，在37 °C条件下孵育1小时。检查胶原凝胶化情况后，将培养板转移至洁净工作台。
注意：可通过倾斜 培养板来确认是否已完成凝胶化。 - 使用移液器沿孔壁缓慢加入150 µL K110至凝胶表面，随后将培养板放回CO2培养箱中，在37 °C条件下孵育1小时。孵育结束后将培养板转移至洁净工作台。在进行细胞培养前，用移液器小心吸除K110。
注意：为保护凝胶结构，移液器吸头应接触孔壁进行操作。
3. I型胶原非纤维形式的制备
注意：所有操作均需在无菌条件下进行。
- 在1.5 mL离心管中，将4 µL胶原蛋白加入1.2 mL的1 mM盐酸（HCl）中，使用移液器轻轻混匀。
注意：胶原蛋白需在使用前立即配制。在使用前始终保持胶原蛋白和HCl处于冷藏状态。 - 用移液器将100 µL胶原蛋白溶液加入96孔细胞培养板的每个孔中。轻轻左右摇动培养板，于室温孵育1 h。
注意：确保各孔的整个表面均被溶液覆盖。 - 孵育结束后，弃去胶原蛋白溶液，并用PBS（-）洗板两次，每次使用移液器操作。
- 向96孔细胞培养板的每个孔中加入150 µL 1%牛血清白蛋白/PBS（-）（1% BSA），于室温孵育1 h。细胞培养前，弃去1% BSA溶液。
注意：确保各孔的整个表面均被溶液覆盖。
4. FEPE1L-8 细胞的培养
注意：所有操作均需在无菌条件下进行。
- 在CO2培养箱中，于37 °C、5% CO2条件下，将FEPE1L-8细胞培养于100 mm培养皿的K110培养基中，直至达到半融合状态。
- 将K110培养基、胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂置于37 °C水浴中预热。
- 小心吸去培养皿中的培养基，加入3 mL 0.05%胰蛋白酶溶液，将培养皿放入CO2培养箱中，37 °C孵育5分钟。孵育后，在10倍相位差显微镜下观察细胞是否从培养皿表面脱落。
注意：脱落的细胞形态变为圆形。若细胞仍贴壁伸展，需继续孵育5分钟。 - 加入3 mL胰蛋白酶抑制剂，用移液器将脱落的细胞收集至15 mL离心管中，在15 mL离心管中以200 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，用移液器将沉淀重悬于10 mL K110培养基中。在10倍相位差显微镜下计数细胞，并用K110培养基适当稀释，调整细胞浓度至5.0 × 104 个/mL。
- 用移液器沿培养板孔壁缓慢加入含细胞的K110培养基0.1 mL至各孔中。将培养板放入CO2培养箱中，在37 °C下孵育指定时间（2小时、1天、3天）。
注意：为保护凝胶，移液器枪头应接触孔壁。
5. 活细胞数量的估算
- 将K110置于37 °C水浴中孵育。使用移液器在2 mL离心管中混合130 µL四唑盐2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H 四唑单钠盐（WST-8）与1.3 mL K110。
- 将培养板转移至洁净台，用移液器轻轻弃去K110。使用移液器以K110轻柔冲洗，去除未贴壁细胞。
- 使用移液器向每孔中加入110 µL含WST-8的K110混合液，将培养板放入CO2培养箱，在37 °C孵育2小时。
- 将培养板转移至洁净台，从每孔收集100 µL培养上清液，转移至另一块96孔培养板的对应孔中。使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（OD450），并据此估算活细胞数量。
结果
使用I型胶原处理培养皿表面的示意图见图1。非纤维状和纤维状胶原上观察到的细胞形态分别显示在图2的左侧和右侧图中。FEPE1L-8细胞分别培养了2小时（上组图）和3天（下组图）。在培养最初的2小时内，细胞在两种形式的胶原上均发生黏附并伸展（图2，上组图）。接种3天后，非纤维状胶原上的细胞继续伸展，细胞数量增加（图2，左下图）；相比之下，纤维状胶原上的细胞伸展有限（图2，右下图）。FEPE1L-8细胞在I型胶原的非纤维状形式上持续增殖（图3，实心黑线，实心黑圆圈），在未经处理的培养皿表面也持续增殖（图3，虚线灰线，实心灰圆圈）；相比之下，细胞在纤维状胶原上未发生增殖（图3，虚线，空心圆圈）。图2和图3经Fujisaki等11修改而来。
图1：经I型胶原处理的培养皿表面的示意图。在酸性条件下，I型胶原分子以非纤维形式吸附于培养皿表面（左图）。在37 °C的中性条件下，I型胶原分子重组成纤维，并以凝胶形式吸附于培养皿表面（右图）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：FEPE1L-8 细胞的形态学特征。 将 FEPE1L-8 细胞在 K110 培养基中培养，分别使用非纤维形式（10 µg/mL；左侧面板）或纤维形式（1 mg/mL；右侧面板）的 I 型胶原，培养时间为 2 小时（上层面板）或 3 天（下层面板）。白色标尺表示 100 µm。图 2 经 Fujisaki 等人11 的图 1E–H 修改而来。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：FEPE1L-8细胞的增殖情况。在I型胶原的非纤维形式（黑色实线，黑色实心圆）、纤维形式（虚线，空心圆）或未经处理的培养皿表面（灰色虚线，灰色实心圆）上，分别于2小时、1天和3天检测活细胞数量。实验重复三次，数据以均值±标准差表示。本图改编自Fujisaki等人的研究，见图1J11。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
一些细胞外基质成分（包括I型胶原）在体内形成三维结构1在三维凝胶基质上培养可提供更接近生理条件的体外环境o 比在二维的塑料表面1,2,3,4已有关于凝胶培养方法的多种方案报道，例如使用I型胶原蛋白1,2,3,4,6,7,11IV型胶原蛋白14,15，以及 Matrigel16I型胶原蛋白由于其来源丰富且易于操作，是一种定义明确且广泛应用的材料。纯化后的I型胶原蛋白特性取决于动物种类、年龄以及纯化方法。5,17I型胶原蛋白可通过乙酸和/或蛋白酶（如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶）进行纯化5,17酸溶性胶原蛋白保留了氨基端肽，而蛋白酶可溶性胶原蛋白的氨基端肽已被切除5,17氨基端肽的保留长度取决于蛋白酶的类型，端肽的存在会影响纤维形态和凝胶强度5,17酸溶性胶原原纤维的黏度高于经蛋白酶处理的胶原17本研究中，我们使用了酸溶性牛I型胶原蛋白。该凝胶培养方案也可使用胃蛋白酶消化的胶原蛋白；然而，其凝胶强度较弱17这些材料的差异可能导致细胞行为的不同，但目前尚未被充分理解。
本研究中描述的凝胶培养方案非常简单。该方法已有多种改良报道。其中一种可能的改良是模拟基底膜结构，用于角质形成细胞的培养。Ⅳ型胶原凝胶可能更有利于在体外维持类似基底膜的基质结构15,18。然而，制备Ⅳ型胶原凝胶需要较长的孵育时间14,15,18。相比之下，将Ⅳ型胶原与Ⅰ型胶原凝胶混合可形成新型的培养基质（Ⅰ型/Ⅳ型胶原杂合凝胶）19。这种杂合凝胶易于操作，凝胶化所需时间短，并能为角质形成细胞提供更接近基底膜的培养环境。在Ⅰ型/Ⅳ型胶原杂合凝胶上，角质形成细胞能够存活、形成克隆并诱导终末分化19。该杂合方法具有广泛的应用前景。
使用 I 型胶原蛋白进行凝胶上培养会影响癌细胞。在 I 型胶原蛋白的纤维形式上，Caco-2 细胞（一种结肠癌细胞系）的 Akt 激活和生长受到抑制7。此外，人黑色素瘤细胞（M24met）在纤维形式上的生长停滞于 G1/S 检查点20。另外，在纤维形式上培养的鼠源 3T3-L1 前脂肪细胞中，活性氧物种水平显著升高。此外，I 型胶原蛋白的非纤维形式和纤维形式可分别以相反方向刺激细胞增殖和迁移21。
披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
我们感谢大阪大学蛋白质研究所的K. Sekiguchi博士、大阪大学蛋白质研究所的M. Yamada博士、中国药科大学创新学院中日医药与药学研究所的T. Ikejima博士以及中国药科大学创新学院中日医药与药学研究所的T. Hayashi博士提供的有益意见。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白（BSA） | Merck KGaA | A4503 | |
| 1 % BSA | Merck KGaA | A4503 | 将1 g BSA粉末溶于100 mL PBS (-) 中，过滤 |
| 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 347-07621 | 四唑盐，2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H 四唑单钠盐（WST-8） |
| I型胶原（酸溶性胶原） | Nippi Inc. | ASC-1-100-20 | 来源于牛（也可使用其他物种），浓度为3.0 mg/mL |
| 一次性膜过滤器 DISMIC 醋酸纤维素 | ADVANTEC Co., LTD. | 25CS020AS | 0.2 µm 孔径 |
| 人角质形成细胞系细胞 FEPE1L-8 | 由W.G. Carter博士（Fred Hutchinson癌症研究中心，美国华盛顿州西雅图）提供 | ||
| K-1 | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | 添加剂补充剂，含500 mg BSA、500 mg 牛垂体提取物、2.5 mg 胰岛素、0.05 µg 人表皮生长因子（h-EGF）和5 mg 肝素 |
| K110 II型培养基 | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | 角质形成细胞基础培养基 |
| 含K-1和青霉素-链霉素的K110 II型培养基（K110） | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | 在500 mL K110 II型角质形成细胞基础培养基中加入5 mL 青霉素-链霉素和10 mL 添加剂补充剂（K-1） |
| PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | 将1袋PBS (-) 粉末溶于1000 mL去离子水中，过滤 |
| 10x PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | 将1袋PBS (-) 粉末溶于100 mL去离子水中，过滤 |
| 青霉素-链霉素 | MP Biomedicals, LLC | 1670049 | 生理盐水中含青霉素G 10000 单位/mL 和硫酸链霉素 10,000μg/mL |
| 磷酸盐缓冲液 BioPerformance 认证，pH 7.4 | Merck KGaA | P-5368-10 pack | |
| 猪胰蛋白酶 | Merck KGaA | T4799 | |
| 0.05 % 胰蛋白酶 | Merck KGaA | T4799 | 将0.25 g 胰蛋白酶和 0.186 g EDTA.2Na 溶于500 mL PBS (-) 中，过滤 |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | |
| 胰蛋白酶抑制剂 | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | 将50 mg 胰蛋白酶抑制剂和500 mg BSA溶于500 mL PBS (-) 中，过滤 |
参考文献
- Kanta, J. Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior. Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).
- Kleinman, H. K. Fibroblast adhesion to collagen substrates. Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).
- Kleinman, H. K., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. Haralsonand, M. A., Hassell, J. R. , IRL Press. Oxford. 289-301 (1995).
- Yamato, M., Hayashi, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. Extracellular Matrix-Cell Interaction. Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. , 123-140 (1998).
- Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen. Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).
- Fujisaki, H., Hattori, S. Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling. Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).
- Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils. Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).
- Wang, Z., Li, R., Zhong, R. Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).
- Shih, Y. -R., Tseng, K. F., Lai, H. -Y., Lin, C. -H., Lee, O. K. Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).
- Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan. BioMed Resesrch International. , 179784(2013).
- Fujisaki, H., et al. Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8. Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).
- Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames. Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).
- Kaur, P., Carter, W. G. Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts. Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).
- Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen. Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).
- Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels. Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).
- Yonemura, S. Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment. Plos One. 9, 112922(2014).
- Sato, K., et al. Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).
- Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH. Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).
- Japan Institute of leather Research and Osaka University. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. , 2489375 (11F019-EP) (2015).
- Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).
- Liu, X., et al. Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration. Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).
重印与许可
