使用硫唑橙替代溴化乙锭或其他染料进行DNA电泳

摘要

本文介绍了一种利用噻唑橙在凝胶电泳实验中检测DNA的方案。使用噻唑橙可替代溴化乙锭，且可通过紫外光或蓝光实现荧光检测。

摘要

使用琼脂糖进行DNA凝胶电泳是分子生物学实验室中常用的工具，可用于按大小分离DNA片段。分离后，通过染色对DNA进行可视化。本文演示如何使用噻唑橙对DNA进行染色。与常用的染色方法相比，噻唑橙具有灵敏度高、成本低、可被紫外光或蓝光激发（以避免样品损伤）以及比溴化乙锭更安全等优势。已配备使用溴化乙锭进行DNA电泳实验条件的实验室，通常可在无需对现有方案进行额外修改的情况下直接更换染料，并使用紫外光进行检测。若需采用蓝光检测以避免样品损伤，也可通过蓝光源和发射滤光片实现。已具备蓝光检测设备的实验室可直接更换染料，无需对现有方案进行任何额外调整。

引言

本方法旨在利用硫唑橙（TO）通过荧光检测技术在琼脂糖凝胶中鉴定DNA。由于硫唑橙成本较低且安全性良好，因此在本科生教学实验室以及从事分子生物学研究的实验室中具有特别优势，尤其适用于连接反应和克隆实验。

溴化乙锭仍是琼脂糖凝胶中DNA检测最常用的染料，主要原因是其价格非常低廉，且检测时仅需紫外光激发即可。溴化乙锭和硫唑橙均价格低廉，检测限均较低（1–2 ng/泳道）¹。然而，与溴化乙锭相比，硫唑橙在两个主要缺点上有所改进。 

首先，溴化乙锭是一种具有特殊操作、运输和处置要求的诱变剂²，而硫唑橙的诱变性较低（在Ames试验中诱变性低3–4倍）^3,4，通常可随普通化学废弃物一同处置。

其次，溴化乙锭的检测需要使用紫外光。硫唑橙在需要时同样可以使用紫外光，但也可用蓝光进行检测。紫外光虽然被广泛使用，但存在几个明显的缺点。第一，它对人体皮肤和眼睛具有损伤性。尽管经过培训的专业人员可以安全地使用紫外光，但实验室中的紫外光意外照射导致皮肤或眼睛损伤（功能上类似于晒伤）的情况并不少见，尤其在经验不足的科研人员中更为常见。第二，紫外光对DNA样本具有极强的破坏作用⁵，这会降低后续实验（如连接和转化实验）的成功率^1,6,7。TO可在蓝光下检测（λ_ex,max = 510 nm（488 nm 和 470 nm 也有较强的激发效果）），蓝光不会造成皮肤损伤或DNA损伤（尽管任何高强度光源仍可能对眼睛有害），从而显著降低了对科研人员和样本的双重风险。 

TO 并不是溴化乙锭唯一的荧光染料替代品；其优势在于成本。TO 于 20 世纪 80 年代被发现可作为网织红细胞染色剂⁸，并已广泛应用于多种基于 DNA 的荧光实验中^{9,10,11,12,13}。目前，多家供应商均有销售 TO。TO 是其他一些更昂贵的、可在蓝光下检测的商用染料的母体化合物，在电泳过程中行为相似，可使用紫外光或蓝光进行检测¹。此外，尽管某些染料对极低浓度 DNA 的灵敏度高于 EtBr 或 TO，但在常规电泳实验中，这些染料在许多情况下价格过高，难以普及使用。 

方案

1. 凝胶制备

注意：有关常规凝胶电泳实验方案，请参见 P.Y. Lee，et al.¹⁴. 

1. 将琼脂糖（约 1% w/v，可根据特定大小分离需求调整百分比）溶于缓冲液中（迷你凝胶（8 x 7 cm）约需 70 mL）。常用缓冲液为 TAE（Tris-乙酸-EDTA，40 mM Tris，20 mM 乙酸，1 mM EDTA，pH 约 8.6）或 TBE（Tris-硼酸-EDTA，90 mM Tris，90 mM 硼酸，2 mM EDTA，pH 约 8.3）。
2. 加入硫唑橙（thiazole orange），使其终浓度为 1.3 μg/mL。
   1. 将硫唑橙溶于 DMSO 中，配制成 10,000 倍浓缩液（13 mg/mL）。硫唑橙对光不特别敏感，但不使用时应避光保存。该溶液在室温下可稳定保存数月；如需长期保存，可将溶液分装后冷冻（DMSO 在普通冰箱中会冻结）。使用前务必完全融化并充分混匀冷冻保存的溶液。 
      注意：凝胶也可在电泳后用硫唑橙染色（见步骤 2.6）。尽管硫唑橙相比溴化乙锭具有更高的安全性，但仍应遵循标准分子生物学实验室安全操作规范。 
3. 将琼脂糖、缓冲液和硫唑橙的混合物放入微波炉中加热，以溶解琼脂糖（约 60 秒）。此步骤通常称为“熔化”。如需要，可轻轻旋转混匀（5 秒）以促进溶解。 
   注意：如更方便，也可在微波加热后加入硫唑橙。
4. 将琼脂糖溶液稍冷却后，倒入含有合适梳子的凝胶制备装置中。
5. 让琼脂糖溶液凝固成胶。 

2. 上样并运行凝胶电泳

1. 如果尚未将凝胶放入电泳装置中，请将其放置到位。
2. 加入电泳缓冲液（TAE 或 TBE，同上），直至完全覆盖凝胶表面。
3. 使用上样染料加载 DNA 样品（通常为 10 μL），并同时加入 DNA 分子量标记物作为参照。
4. 盖上盖子并连接电极（凝胶应朝向红色阳极（正极）方向进行电泳）。
5. 施加电压（对于小型凝胶通常约为 100 V，但根据凝胶尺寸可能需要调整电压，以防止损坏凝胶），直至上样染料迁移至适当距离（小型凝胶约为 4–7 cm，具体距离可根据实际应用情况有所变化）。
   注意：与溴化乙锭及其他许多 DNA 结合染料类似，硫唑橙（thiazole orange）带正电荷。因此，这类染料在电场中的迁移方向与 DNA 相反。对于需要较长电泳时间以实现更好分离的样品，染料最终会与较小的 DNA 片段分离，导致染色信号减弱。在此情况下，应按照步骤 2.6 对凝胶进行染色。该现象并非硫唑橙特有，任何可逆结合 DNA 的带正电荷染料均会表现出类似行为（包括溴化乙锭、硫唑橙及其他类似染料）。
6. 若未在制胶前加入硫唑橙（步骤 1.2），则需将凝胶浸入含硫唑橙的缓冲液中进行染色。
   1. 配制足够量的含 1.3 μg/mL 硫唑橙的缓冲液（TAE 或 TBE），完全覆盖凝胶，并在轻微振荡条件下浸泡，直至条带清晰可见（约 20 分钟）。

3. 噻唑橙琼脂糖凝胶的可视化（紫外透射仪）

1. 从电泳装置中取出凝胶，并放置在紫外透射仪上。
   注意：紫外线对皮肤和眼睛有害。务必佩戴适当的眼部防护（护目镜）和面部防护（面罩）。手部应戴手套，并穿戴长袖衣物。
2. 如需要，可从凝胶中切下目标DNA条带（例如用于后续的酶切或连接反应）。在切割过程中，应尽可能缩短凝胶暴露于紫外光下的时间。紫外线（无论是否使用DNA染料）均会损伤DNA。 
3. 使用 readily available 的试剂盒或方案从凝胶切片中提取DNA¹⁵。

4. 噻唑橙琼脂糖凝胶的可视化（蓝光透射仪或手电筒）

1. 从电泳装置中取出凝胶，并置于蓝光透射仪（最大发射波长约 470 nm）上。或者，也可使用蓝光 LED（约 470 nm）手电筒从上方或下方照射凝胶。
   注意：尽管使用蓝光透射仪与溴化乙锭结合时灵敏度较低，但可通过此蓝光方案检测溴化乙锭染色的 DNA。
2. 使用琥珀色发射滤光片（约 560 nm 长通，可为护目镜或方形滤光片）过滤蓝光，以便观察 DNA 与硫唑橙复合物的荧光。 
   注意：若不使用琥珀色发射滤光片，由于蓝光激发光源强度较高，将极难观察到 DNA 条带。 
   警告：尽管蓝光不具备急性组织损伤能力（与紫外光不同），但长时间暴露于高强度蓝光可能损伤眼睛，因此应使用琥珀色发射护目镜或滤光片。
3. 如需进一步应用，可从凝胶中切下目标 DNA 条带。
   注意：由于蓝光不会损伤 DNA，因此无需像步骤 3.2 中使用紫外光激发时那样迅速切下条带。
4. 使用现成的试剂盒或方案从凝胶切片中提取 DNA¹⁵。

5. 图像采集

1. 在凝胶成像装置中选择合适的激发和发射参数。硫唑橙的激发与发射波长（λ_ex,max = 510 nm（488 nm 和 470 nm 也有较强激发，此外在紫外波长下也有强激发）；λ_em = 527 nm）与常见的可被蓝光检测的商用染料几乎相同，因此仪器可能已预设了可直接使用的滤光片参数。 
   注意：某些用于蓝光检测商用染料的滤光设置实际上使用有害的紫外光进行激发，因此在成像后需切割条带时应格外小心。若可能，在成像后需切取DNA条带时应使用蓝光激发光源。
2. 若缺乏配备合适滤光片的成像系统，可在相机与凝胶/蓝光激发光源之间放置一个琥珀色滤光片。

结果

硫唑橙能够在不使用溴化乙锭且无需DNA损伤性紫外光的情况下实现DNA检测。众所周知，溴化乙锭具有致突变性，因此将其从实验室中去除可能更具优势。紫外光会损伤DNA并显著降低转化效率，而蓝光则不会对DNA造成损伤。在检测灵敏度方面，溴化乙锭、硫唑橙以及一种常见的可被蓝光检测的商用DNA染料之间相似（图1，参见材料表），三者在微型凝胶中的检测限均约为每泳道1-2 ng¹。

对于常见的应用，如切下经限制性内切酶消化的DNA条带，硫唑橙特别适用。使用蓝光激发检测DNA具有良好的稳定性和简便性，且研究人员无需像使用紫外光检测时那样迅速切下DNA条带。本实验中，质粒经限制性内切酶切割以分离插入片段（图2，同一凝胶以三种不同方式成像）。该插入片段在蓝光以及紫外光激发下均可被硫唑橙清晰检测，从而确保后续实验可在避免DNA遭受紫外损伤的前提下顺利进行。

讨论

尽管溴化乙锭具有已知的毒性，但它长期以来一直是分子生物学实验室中的常用工具。此外，溴化乙锭检测需要使用紫外光，而紫外光在检测过程中会损伤DNA。硫唑橙提供了一种廉价的替代方案，可取代溴化乙锭以及一些有用但昂贵的商业染料。 

噻唑橙的优势因此是双重的。首先，噻唑橙可直接替代溴化乙锭使用。凝胶的制备方法与溴化乙锭完全相同，只需将噻唑橙作为染料替代（步骤1.2）。其检测灵敏度相似（约1–2 ng/泳道）¹。更换染料无需额外设备，因为噻唑橙与溴化乙锭一样，可通过紫外光检测（步骤3）。然而，紫外光会迅速损伤DNA，可能导致后续实验（如连接和转化）失败¹。此外，紫外光对皮肤和眼睛也有伤害，需采取严格的安全防护措施。 

TO 的第二个优点是能够摆脱紫外光激发。使用蓝光检测（将步骤 3 替换为步骤 4）可消除对 DNA 的损伤，并降低对科研人员的潜在风险。TO 的蓝光激发与检测可通过蓝光透射仪或廉价的蓝光 LED 手电筒实现（两...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-对数DNA阶梯标记物	New England Biolabs	N0469S
琼脂糖（基因分析级）	Fisher	BP1356-100
蓝光手电筒	WAYLLSHINE (Amazon)	WAYLLSHINE Scalable Blue LED
ChemiDoc MP	Biorad	1708280
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
溴化乙锭	Fisher	BP1302-10	用于比较，非本实验方案必需
凝胶电泳装置（Owl Easy Cast）	Thermo Scientific	B1A
Qiagen Qiaquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
Safe Imager 观察眼镜	Invitrogen	S37103	使用蓝光手电筒时必需。*
SafeImager 2.0（蓝光透射仪）	Invitrogen	G6600	可使用蓝光手电筒作为替代
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	用于比较，非本实验方案必需
TAE（Tris-乙酸-EDTA）	Corning	46-010-CM
噻唑橙	Sigma-Aldrich	390062
*眼镜也随 Invitrogen G6600 一同提供