微生物生物膜在界面处形成复杂的结构，并发展为具有高度尺度依赖性的空间模式。本文介绍了一种用于自动获取三维光学相干断层扫描（OCT）数据集的实验系统（硬件和软件）。该工具集可实现对生物膜形态发生过程在空间和时间上的无创、多尺度表征。
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摘要
摘要
生物膜是一种极为成功的微生物生存方式，在多种自然环境和人工系统中普遍存在。理解生物膜的形态发生过程——即在群落组装过程中生物膜结构的多样化——是一项跨越空间和时间尺度的重大挑战。本文介绍一种基于光学相干断层扫描（OCT）的自动化生物膜成像系统。OCT 是生物膜研究中一种新兴的成像技术。然而，目前可获取和处理的数据量限制了对生物膜形态大尺度模式的统计推断。该自动化 OCT 成像系统能够覆盖生物膜生长的大范围空间尺度和长时间时间尺度。该系统结合了商用 OCT 设备、机器人定位平台以及一系列软件解决方案，用于控制 OCT 扫描探头的定位，以及三维生物膜成像数据集的采集与处理。该装置可实现对生物膜发育过程的原位、无创自动化 监测，并有望进一步发展为将 OCT 成像与宏成像和微传感器剖面分析相结合的综合系统。
引言
生物膜是一种极为成功的微生物生活方式适应形式，这些与界面相关且被基质包裹的微生物群落，在自然环境和工业环境中主导着微生物的生命活动1,2。在这些环境中，生物膜会形成复杂的结构，例如细长的丝状物3、波纹状结构4或蘑菇状帽体5，这些结构对生物膜的生长、结构稳定性以及抗应激能力具有重要意义6。尽管关于生物膜结构分化的许多认识来源于在微型流动腔中培养的单一种类微生物的研究，但大多数生物膜实际上是高度复杂的群落，通常包含生命三大域的多种成员6。因此，将这些复杂的生物膜视为微生物景观7，并理解在复杂群落中生物膜结构与功能之间的相互作用，已成为当前生物膜研究的前沿课题。
要理解复杂生物膜在环境信号刺激下的形态发生机制，需要精心设计的实验，并结合在相关尺度上对生物膜物理结构进行空间和时间分辨的观测8。然而，在实验系统中对生物膜生长进行无损观察，长期以来受到操作限制的严重制约，例如需要移动样品（如移至显微镜下）往往会破坏脆弱的生物膜结构。
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方案
1. 定位装置的设置
- 根据 https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl 中的说明，将定位装置连接至微控制器板。
- 将微控制器通过 USB 线缆连接至具有互联网连接的单板计算机，并按照 https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git 中的说明安装 GRBL 服务器。此时，应可通过托管于 http://IP:5020/ 的网页访问并控制定位装置。或者，也可使用 Python 脚本控制该定位装置。, 如示例的第一部分所示 ImagesAcquisition.ipynb (补充文件 2).
2. OCT 设置
- 使用兼容的燕尾槽支架将OCT探头安装到定位装置上。如有需要，在物镜上安装浸没式适配器。
- 将计算机和OCT主机放置在实验装置（例如微流控装置、流动腔、水槽、过滤系统）旁边的实验台上。确保光缆（最大长度约1.8 m）可自由移动，长度足以到达所有目标位置，且不会干扰实验装置。
- 按照制造商说明安装OCT系统及配套软件。
- 按照 https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git 中的说....
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结果
我们通过一个设计用于研究光合自养溪流生物膜时空形态发生的水槽实验，展示了自动化OCT成像系统的功能。水槽逐渐变窄的几何结构在水槽中心诱导出流速梯度（见参考文献17）。在18天内对生物膜的时间发展和结构分化进行监测，旨在更深入理解水动力条件对生物膜形态发生的影响。图4展示了在一个为期18天的生长过程中追踪的生物膜微菌落的生长情况。使用上述工具集对生物膜的表面形态进行了量化分析（图4A）。对于沿流速梯度的每个位置（图4C），采用边长为3.6 mm的方形移动窗口计算了生物体积（参见示例文件 ImageProcessing.ipynb，补充文件1）（图4B）。随着流速增加（以距水槽最宽处的距离表示），生物膜的积累显著减少（图4）。重要的是，该实验装置能够沿.......
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讨论
光学相干断层扫描（OCT）成像非常适合解析微米尺度的结构，其视场（FOV）可达数平方毫米，因此是生物膜研究的有力工具10,18。然而，目前OCT的最大扫描面积仅限于100–256 mm2，而生物膜的结构模式通常超过这一空间尺度19，尤其是在大尺度环境梯度驱动形态分化的情况下20。本实验方案中描述的自动化OCT成像系统将OCT表征的表面区域扩展至数平方厘米，从而能够有效监测生物膜在相关空间尺度范围（从数毫米到数厘米）内的形态分化过程。高精度定位（误差在16 µm以内；图5） 使得能够长时间精确监测生物膜结构的发育过程（图4），显著 提升了深入理解生物膜形态分化驱动机制的可能性。同时，这种原位生物膜表征技术具有非侵入性，对生物膜生长的干扰极小。本文介绍的图像处理方法基于先.......
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披露
Sebastian Schäfer 任职于 Thorlabs 公司。
致谢
感谢Mauricio Aguirre Morales对本系统开发所做出的贡献。 本研究由瑞士国家科学基金会向T.J.B.提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| OCT探头 | Thorlabs | GAN210C1 | OCT成像设备 |
| OCT扫描镜头 | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| 浸入式适配器 | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | 定位装置 |
| 微控制器 | Arduino Uno R3 | NA | |
| 单板计算机 | Raspberry PI | NA | |
| 相机 | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| 相机镜头 | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
参考文献
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563(2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott....
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