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由人诱导性多能干细胞体外生成体节衍生物

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DOI：

10.3791/59359

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2019年4月25日

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1Department of Life Science Frontiers, Center for iPS Cells Research and Application, Kyoto University, 2Department of Clinical Application, Center for iPS Cells Research and Application, Kyoto University

本文内容

摘要

本文介绍了一种在化学成分明确的条件下将人诱导性多能干细胞分化为每种体节衍生物（肌节、生骨节、生皮节和生腱节）的实验方案，该方法在未来骨科手术的疾病建模和细胞治疗中具有应用价值。

摘要

在来自周围组织分泌的WNTs、骨形态发生蛋白（BMPs）和 sonic hedgehog（SHH）等信号的诱导下，体节（SMs）可分化为多种细胞类型，包括肌节（MYO）、生骨节（SCL）、生皮节（D）和生腱节（SYN），这些细胞类型分别发育为骨骼肌、轴向骨骼、背部真皮以及轴向肌腱/韧带。因此，从人诱导性多能干细胞（iPSCs）中生成SMs及其衍生物，对于在再生医学中应用以及骨科领域疾病研究中获取多能干细胞（PSCs）至关重要。尽管已有多个研究团队报道了从PSCs诱导生成MYO和SCL的方案，但目前尚无研究成功实现从iPSCs诱导产生SYN和D。因此，高效诱导出功能完整的SMs仍是当前面临的主要挑战。本文通过模拟鸡/小鼠体节发育过程中的信号环境，在体外利用人iPSCs重现了人体体节的模式形成过程，并报道了一种在化学成分明确的条件下，经由前体节中胚层（PSM）和体节（SM）阶段，系统性诱导人iPSCs分化为SM各种衍生物（MYO、SCL、D和SYN）的方法。有关鸡/小鼠 体节发育的知识被成功应用于人iPSCs诱导体节的实验中。该方法有望成为研究人类体节发生与模式形成（无需使用胚胎）以及开展细胞治疗和疾病建模的新工具。

引言

从多能干细胞（PSCs）开发出针对特定细胞类型的定向分化方法，是将PSC来源细胞的研究转化为临床应用的必要步骤。强制表达关键基因是PSC向器官细胞分化的有前景策略，该策略加深了我们对细胞命运决定、器官形态发生以及胚胎发育过程中组织形成的遗传调控机制的理解1。此外，以小鼠和鸡胚胎发育过程为蓝图，重现内源性信号环境，被认为是实现PSC定向分化的关键。然而，考虑到PSC来源细胞在细胞治疗等临床研究中的应用，后一种策略更为合适，因为它无需进行基因操作。

已有若干研究报道了在化学成分明确的条件下，从人和小鼠多能干细胞（PSCs）诱导中胚层的生成。通常，这些方法依赖于激活素/结节蛋白/转化生长因子β（TGFβ）信号通路和骨形态发生蛋白（BMP）信号通路，被认为可促进中内胚层及中胚层分化，但轴旁中胚层的诱导效率较低（约20%）2。换句话说，通过这些信号通路诱导的PSC来源中胚层主要为侧板中胚层，而非轴旁中胚层。近年来，少数研究基于不同策略实现了高效生成PSC来源的轴旁中胚层3,4,5,6,7,8。在这些研究中，PSCs在相对高浓度的糖原合成酶激酶3（GSK3）抑制剂（WNT信号激活剂）条件下培养，从而使轴旁中胚层的诱导效率达到70%–95%6,7。

在体节形成过程中，轴旁中胚层首先在后部形成前体节中胚层（PSM），随后通过间充质-上皮转化在前部形成体节（SMs）9,10。Notch配体Delta样蛋白1（DLL1）在体节形成过程中发挥关键作用，其mRNA和蛋白质水平的振荡表达调控着体节的分节过程。体节最终分为两部分，背侧形成生皮肌节（DM），腹侧形成生骨节（SCL）11。随后，生皮肌节分化为表皮节（D），即真皮的前体细胞，以及肌节（MYO），即骨骼肌的前体细胞；此外，生骨节的腹侧部分形成生腱节（SYN），即肌腱和韧带的前体细胞12（图1）。一些研究人员已报道了由PSC诱导产生体节衍生物，如肌节（MYO）4,13 和生骨节（SCL）14；然而，这些研究仍存在若干局限性。尤其值得注意的是，由于目前对表皮节（D）和生腱节（SYN）的信号微环境了解尚不完整，针对D和SYN的诱导方案尚未系统建立。为了证明由PSC诱导产生的体节具有完全分化潜能，必须展示诱导体节向全部四种衍生物（D、MYO、SCL和SYN）的多向分化能力，而以往的研究仅聚焦于特定的体节衍生物。本文中，我们报道了如何从人诱导性多能干细胞（iPSCs）出发，经前体节中胚层（PSM）和体节（SM）阶段，生成全部四种体节衍生物（包括D和SYN）的方法15。我们认为，建立一种体外逐步模拟体节发育过程的方法，将有助于在不使用胚胎的前提下，深入研究人类体节在胚胎发生过程中的发育机制。

方案

所有涉及人类诱导多能干细胞（iPSCs）的实验方案均经京都大学医学部及研究生院医学系伦理委员会批准。

1. 诱导前人iPSCs的准备

注意：将人iPSCs（201B7-PAX3-GFP）培养在SNL饲养层细胞上16，使用添加了4 ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）和0.5%青霉素-链霉素的灵长类动物ES细胞培养基（下文简称hESC培养基，见表1）。当细胞融合度达到70%–80%时，按先前所述方法进行传代17。

  1. 在SNL饲养细胞上传代人iPSCs17
    1. 传代时，向细胞培养皿中加入PBS，洗涤细胞，然后移除PBS（以下此操作简称为用PBS洗涤）。
    2. 加入1 mL室温（RT）的CTK溶液（见表1），等待SNL饲养细胞开始从培养皿底部脱落。
    3. 移除CTK溶液，然后用PBS洗涤两次。
    4. 向培养皿中加入1 mL hESC培养基（见表1），用细胞刮轻轻刮下细胞，并收集至15 mL锥形管中。
    5. 使用1,000 µL枪头轻柔吹打5次，然后转移至预先加入hESC培养基的新培养皿中。根据传代前的融合度，采用1:4至1:10的传代比例。同时，根据培养皿的规格调整hESC培养基的体积（例如，6 cm培养皿使用3 mL，10 cm培养皿使用8 mL）。
    6. 将人iPSCs在37 °C、5% CO2条件下培养。
    7. 每天更换培养基（传代后当天除外），持续培养至下一次传代操作。
  2. PSM诱导前的人iPSCs无饲养层培养
    注意：    为最大程度减少SNL饲养细胞分泌的生长因子的影响，在PSM诱导前3天，将人iPSCs在包被了细胞外基质（ECM）溶液（见表1）的培养皿中，使用无饲养层细胞培养基（见表1）进行无饲养层条件下的培养。
    1. 第-4天（PSM诱导开始前4天）
      1. 为制备ECM溶液包被的培养皿，于4 °C条件下在10 cm培养皿中加入4 mL ECM溶液，过夜孵育。
        注意：配制过程中应将ECM溶液置于冰上。
    2. 第-3天
      1. 首先，从培养皿中移除ECM溶液，并加入8 mL无饲养层细胞培养基。
      2. 开始无饲养层培养：用PBS洗涤一次，以清洗已培养的细胞。
      3. 在室温下加入1 mL CTK溶液，直至SNL饲养细胞开始从培养皿底部脱落。
        注意：使用显微镜观察，确认所有饲养细胞均已从底部脱落。
      4. 移除CTK溶液，并用PBS洗涤两次，确保完全去除所有SNL饲养细胞。
      5. 向培养皿中加入1 mL无饲养层细胞培养基，用细胞刮刮下细胞，并收集至15 mL锥形管中。
      6. 使用1,000 µL枪头轻柔吹打3次，然后转移至新的ECM溶液包被的10 cm培养皿中（该培养皿已在步骤1.2.1中制备）。根据无饲养层培养前的融合度，传代比例约为1:2至1:4。
      7. 将人iPSCs在37 °C、5% CO2条件下培养3天，并在第-1天更换培养基。

2. 通过荧光激活细胞分选（FACS）进行PSM分化与分离

  1. PSM 分化（第 0 天–第 4 天）
    1. 吸除无饲养层的细胞培养基，加入 8 mL PSM 诱导培养基（CDM 基础培养基添加 10 µM SB431542、10 µM CHIR99021、2 µM DMH1 和 20 ng/mL FGF2，参见表 1）。
      ​注意：PSM 分化起始时的细胞汇合度对诱导效率至关重要。使用显微镜确认细胞汇合度约为 30%。
    2. 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养 4 天，在第 3 天更换培养基。
    3. 在第 4 天收集细胞用于流式细胞分选（FACS，见下文第 2.2 节）。
  2. 通过荧光激活细胞分选（FACS）分离 DLL1 阳性 PSM 细胞
    注意：    以下是 DLL1 阳性细胞 FACS 分选前的细胞准备步骤。请按照仪器制造商的说明书使用流式细胞仪进行 FACS 分选。
    1. 吸除培养基，用 PBS 洗涤一次，随后加入 1 mL 细胞解离试剂，在室温下孵育 3 分钟。
    2. 加入 4 mL CDM 基础培养基，用细胞刮刀刮下细胞，并收集至 15 mL 圆底离心管中。
    3. 使用自动细胞计数仪计数细胞，然后以 280 × g 离心 3 分钟。
    4. 小心吸除上清液，将细胞重悬于 FACS 缓冲液（参见表 1）中，调整浓度至 1.0 × 107 个细胞/mL。对于阴性对照样本（同型对照或不加抗体对照），取 50 µL 细胞悬液转移至 15 mL 圆底离心管中，再加入 450 µL FACS 缓冲液重悬。
    5. 按 1/200 的比例加入 DLL1 抗体（参见材料表），避光并在冰上孵育 30 分钟。
    6. 以 280 × g 离心 3 分钟。
    7. 小心吸除上清液，将细胞重悬于含 1 mg/mL DAPI 的 FACS 缓冲液（1.0 × 107 个细胞/mL）中。
    8. 转移至带 35 µm 尼龙滤网帽的收集管中，置于冰上直至完成分选。对阴性对照样本（步骤 2.2.4）执行相同操作。
    9. 按照仪器制造商的说明书使用流式细胞仪进行分选。
    10. 将分选出的 DLL1 阳性细胞收集至含 4 mL CDM 基础培养基（添加 10 µM Y27632）的 15 mL 圆底离心管中。如需进行总 RNA 提取，则以 280 × g 离心 3 分钟后，重悬于 RNA 裂解缓冲液中，于 -30 °C 保存。更详细的操作请参见 RNA 提取、逆转录及 RT-qPCR 实验步骤（第 5.1 节）。
    11. 使用分选出的细胞，按照下述方案进行 SM 分化（第 3 节）。

3. 体节中胚层向成肌细胞的分化

  1. 从分选的 DLL1 阳性 PSM 细胞诱导骨骼肌分化（第 4 天至第 8 天）
    注意：    在进行 FACS 分选前一天，准备包被了 ECM 溶液的 12 孔板。制备包被 ECM 溶液的 12 孔板时，于 4 °C 条件下每孔加入 1 mL ECM 溶液，过夜孵育。配制过程中，ECM 溶液需始终置于冰上。
    1. 完成步骤 2.2.10 后，以 280 × g 离心 3 分钟。
    2. 小心吸除上清液，并将细胞重悬于 1 mL 骨骼肌诱导培养基中（CDM 基础培养基添加 10 µM SB431542 和 5 µM CHIR99021，参见 表 1）。
    3. 使用自动细胞计数仪对细胞数量进行计数。
    4. 将 1.0 × 105 个细胞接种至含有 1 mL 添加了 10 µM Y27632 的骨骼肌诱导培养基的 ECM 溶液包被的 12 孔板各孔中。
    5. 于 37 °C、5% CO2 条件下培养 4 天，直至第 8 天。在第 5 天（FACS 分选后的第一天）和第 7 天更换不含 Y27632 的培养基。
    6. 根据以下方案，使用诱导所得的骨骼肌细胞进行骨骼肌衍生物的分化。如需从诱导的骨骼肌细胞中提取总 RNA，将细胞收集至 15 mL 圆底离心管中，以 280 × g 离心 3 分钟，随后重悬于 RNA 裂解缓冲液中，并于 -30 °C 保存。

4. 平滑肌衍生物（DM、MYO、D、SCL、SYN）与平滑肌的分化

注意：为证明体节中胚层细胞（SM细胞）的全能性，首先使用诱导多能干细胞（iPSC）来源的SM细胞分别进行皮肌节（DM）和软骨节（SCL）诱导。随后，利用DM细胞进行肌节（MYO）和皮节（D）诱导，并利用SCL细胞进行腱节（SYN）诱导。以下是体外由诱导的SM细胞分化为各谱系细胞（DM、MYO、D、SCL和SYN）的诱导方案。

  1. 从SM细胞诱导DM分化（第8天–第11天）
    1. 吸除培养基，然后每孔加入1 mL DM诱导培养基（CDM基础培养基添加5 µM CHIR99021和10 ng/mL BMP4，见表1）。
    2. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养3天至第11天。在第10天（DM诱导的第2天）更换培养基。
    3. 根据以下方案，使用诱导所得的DM细胞进行MYO和D分化。
  2. 从DM细胞诱导MYO分化（第11天–第41天）
    1. 吸除培养基，然后每孔加入1 mL MYO诱导培养基（CDM基础培养基添加5 µM CHIR99021，见表1）。
    2. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养30天至第41天。每3天更换一次培养基。
  3. 从DM细胞诱导D分化（第11天–第20天）
    1. 吸除培养基，然后每孔加入1 mL D诱导培养基（CDM基础培养基添加5 µM CHIR99021和10 ng/mL BMP4，见表1）。
    2. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养9天至第20天。每3天更换一次培养基。
  4. 从SM细胞诱导SCL分化（第8天–第11天）
    1. 吸除培养基，然后每孔加入1 mL SCL诱导培养基（CDM基础培养基添加100 nM SAG和0.6 µM LDN193189，见表1）14。
    2. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养3天。在第10天（SCL诱导的第2天）更换培养基。
    3. 根据以下方案，使用诱导所得的SCL细胞进行SYN分化。
  5. 从SCL细胞诱导SYN分化（第11天–第32天）
    注意：    在开始SYN诱导前一天，准备ECM溶液包被的24孔板。制备方法：在4 °C条件下，向每个孔中加入0.5 mL ECM溶液，过夜孵育。配制过程中保持ECM溶液置于冰上。
    1. 吸除培养基，用PBS洗涤，然后每孔加入0.2 mL细胞解离试剂，在室温下孵育3分钟。
    2. 每孔加入0.8 mL CDM基础培养基，刮取并收集所有细胞至15 mL锥形管中。
    3. 以280 × g离心3分钟。
    4. 小心吸除上清液，将细胞重悬于1 mL SYN诱导培养基-1（CDM基础培养基添加20 ng/mL FGF8，见表1），然后使用自动细胞计数仪计数细胞数量。
    5. 将5.0 × 104个细胞接种至含有1 mL SYN诱导培养基-1的ECM溶液包被的24孔板各孔中。
    6. 在37 °C、5% CO2条件下培养3天。
    7. 在第14天（SYN诱导的第3天），更换为SYN诱导培养基-2（CDM基础培养基添加10 ng/mL BMP7和10 ng/mL TGFβ3，见表1）。
    8. 在37 °C、5% CO2条件下继续培养18天至第32天。每3天更换一次培养基。

5. 诱导多能干细胞衍生产物的表征

注意：分化后，应根据需要使用定量实时 PCR（RT-qPCR）、免疫细胞化学（ICC）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和机械拉伸刺激实验对人诱导多能干细胞（iPSCs）的衍生物进行表征。

  1. 细胞收获、总RNA提取、逆转录及定量实时PCR（RT-qPCR）分析
    1. 将细胞样品（步骤2.2.10、3.1.6、5.4.3）收集至1.5 mL离心管中，于280 × g 离心3分钟。
    2. 弃去上清液，加入350 µL总RNA提取试剂盒提供的RNA裂解缓冲液重悬细胞。
    3. 按照试剂盒说明书操作，提取总RNA。
    4. 根据制造商说明书，将1 µg提取的总RNA逆转录为cDNA。
    5. 根据制造商说明书，使用合适的酶、试剂和引物进行RT-qPCR。本研究中所用引物序列见表2。
  2. 免疫细胞化学（ICC）
    1. 在使用抗体进行免疫细胞化学染色前，用4 °C的2%多聚甲醛固定细胞10分钟，并用PBS洗涤两次。
    2. 为实现通透化，用0.2%甲醇或0.2%吐温-20/PBS（下文简称PBS-T）在4 °C孵育15分钟。
    3. 去除通透化试剂，加入适当的封闭缓冲液或含1%牛血清白蛋白的PBS，在4 °C孵育60分钟。
    4. 将一抗用含10%封闭剂的PBS-T稀释后加入，置于4 °C摇床上过夜。
    5. 用PBS-T洗涤三次（每次加入PBS-T，在室温下置于摇床上孵育10分钟）。
    6. 加入用含10%封闭剂的PBS-T稀释的二抗，在室温下置于摇床上孵育60分钟。本研究中用于ICC的一抗和二抗列于表3。
      注意：从本步骤开始，需用铝箔包裹培养板/皿以避光。
    7. 用PBS-T洗涤两次。
    8. 进行复染时，将DAPI以1:5000比例用PBS稀释后加入，在室温下置于摇床上孵育5分钟。
    9. 去除DAPI溶液，向每孔中加入PBS。
    10. 使用荧光显微镜观察细胞染色情况。也可将培养板/皿在4 °C保存最多1个月。
  3. 用于iPSC来源D细胞功能分析的酶联免疫吸附测定（ELISA）
    注意：    人真皮成纤维细胞（HDF）可商业获得。将HDF细胞培养于添加10%胎牛血清的DMEM培养基中（见表1）。
    1. 将1.0 × 105个iPSC来源D细胞和HDF细胞分别接种至24孔板中，每孔加入1 mL相应培养基（D细胞：D诱导培养基；HDF细胞：含10%胎牛血清的DMEM）。
    2. 细胞培养3天后，收集每孔100 µL培养基，转移至1.5 mL离心管中，于4 °C保存。
    3. 按照试剂盒说明书进行后续操作，包括加入检测抗体和二抗等步骤，并通过对照分析物样品浓度绘制标准曲线，定量目标分子含量。
  4. 用于iPSC来源SYN细胞功能分析的机械拉伸刺激实验
    注意：    成人人类肌腱细胞可商业获得（见材料表）。将人iPSC来源SYN细胞和成人人类肌腱细胞接种于细胞拉伸装置上，进行如下所述的机械拉伸刺激实验18,19。分别使用SYN诱导培养基-2和肌腱细胞生长培养基（见材料表）作为iPSC来源SYN细胞和成人人类肌腱细胞的培养基。
    1. 在拉伸前24小时，将1.0 × 105个iPSC来源SYN细胞和人肌腱细胞分别接种至经ECM溶液包被的多孔型硅胶培养室中，每个培养室的培养面积为1.5 cm × 1.5 cm（见材料表）。
    2. 将培养室安装至细胞拉伸装置上，施加单轴循环应变（0.5 Hz，5%）持续12小时。
    3. 进行总RNA提取时，加入350 µL RNA裂解缓冲液，刮取细胞并收集至1.5 mL离心管中，用于总RNA提取及后续RT-qPCR分析（见步骤5.1）。

结果

本报告中的所有图像均使用201B7-PAX3-GFP iPSC获得，其中EGFP取代了PAX3编码序列第一外显子中的一个等位基因。201B7-PAX3-GFP iPSC的建立方法将另文报道（H. Sakurai，个人通讯）。统计学显著性通过统计学软件进行评估，P值低于0.05被认为具有显著性。

人iPSC来源的体节中胚层（PSM）和体节细胞（SM）的表征
为评估人诱导多能干细胞（iPSC）经体节中胚层（PSM）阶段向体节（SM）分化的情况（图2A），进行了流式细胞术分析（FACS）、免疫细胞化学分析（ICC）和实时定量PCR分析（RT-qPCR）。如图2B所示，在人iPSC经4天PSM诱导后，超过85%的细胞表达PSM标志物DLL1，但不表达SM标志物PAX3。随后，在进一步进行4天SM诱导后，该细胞群体转变为PAX3阳性的SM细胞。PSM向SM的转变也通过免疫细胞化学（ICC）（图2C）和RT-qPCR（图2D）得到验证。TBX6、MSGN1和WNT3A等PSM标志物在PSM阶段（第4天）表达，而在SM阶段（第8天）不再表达；而PARAXIS、MEOX1和PAX3等SM标志物仅在SM阶段表达，在PSM阶段不表达。此外，在加入SB431542与CHIR99021后，上皮化SM的标志物CDH11仅在细胞间连接处富集（图2E）。

表征由人iPSC来源的SM细胞诱导的SM衍生物
为评估人iPSC来源的SM细胞的分化潜能，通过免疫细胞化学分析（ICC）和PAX3（GFP）荧光检测其向DM、MYO、D、SCL和SYN分化的潜力（图3A）。如图3B所示，DM分化通过ALX4和EN1染色以及PAX3（GFP）荧光确认；MYO分化通过MYOD、MYOG和肌球蛋白重链（MHC）染色确认；D分化通过EN1和PDGFRa染色确认；SCL分化通过PAX1、PAX9和NKX3.2染色确认；SYN分化通过SCX、MKX、COL1A1和COL1A2染色确认。

诱导成纤维细胞和成纤维细胞样细胞的表征
1. 用于分析iPSC来源成纤维细胞功能的酶联免疫吸附测定（ELISA）
在人体中，真皮成纤维细胞的主要功能之一是分泌细胞外基质（ECM）蛋白，例如胶原蛋白和透明质酸，这些蛋白可保持皮肤水合状态并维持皮肤结构。为证明iPSC来源的成纤维细胞（iPSC-derived D）与人真皮成纤维细胞（HDF）在培养基中分泌的I型胶原蛋白和透明质酸的量相当，进行了ELISA检测，结果如图4A所示。

2. 用于iPSC来源SYN功能分析的机械拉伸刺激实验
已有研究表明，机械刺激在出生前后均会影响肌腱发育，并促进前体细胞向腱细胞分化18,19。因此，腱细胞对机械应力具有反应性是公认特征之一。为证明人iPSC来源SYN与成人腱细胞具有相似的机械反应性，进行了如图4B所示的机械拉伸刺激实验。

figure-results-1
图1：轴旁中胚层分化的层次结构示意图。体节前中胚层是在胚胎发育早期短暂出现的一群细胞，经过分节形成体节。体节是一群短暂存在的干细胞群体，可分化为多种细胞类型，如生骨节、生肌节、生腱节、生皮节和肌节细胞，最终进一步分化为肌腱/韧带、骨/软骨、骨骼肌和皮肤细胞。请点击此处查看此图的放大版本。

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图2：人iPSC来源的体节前中胚层（PSM）和体节（SM）的FACS、RT-qPCR及免疫细胞化学（ICC）分析。 （A）通过PSM诱导SM分化的方案示意图。 （B）PSM诱导第4天及SM诱导第4天（即iPSC起始后第8天）DLL1染色与PAX3（GFP）荧光的代表性散点图。 （C）PSM诱导第4天及SM诱导第4天（即iPSC起始后第8天）的代表性免疫细胞化学图像及PAX3（GFP）荧光图像。细胞使用抗TBX6、PARAXIS和MEOX1抗体（红色）染色，并与DAPI（蓝色）共染或检测PAX3（GFP）荧光（绿色）。 （D）在iPSC、PSM和SM阶段对PSM与SM标志物进行的RT-qPCR分析。数据展示为三次独立实验的均值±标准误（S.E.）。 （E）在S10I10（SB431542与WNT信号通路抑制剂IWR1联用）、S10（SB431542）及S10C5（SB431542与CHIR99021联用）条件下培养的SM诱导第4天（即iPSC起始后第8天）的代表性免疫细胞化学图像。细胞使用抗CDH11抗体（红色）染色，并与DAPI（蓝色）共染。iPS：诱导性多能干细胞；PSM：体节前中胚层；SM：体节；S10：SB431542 10 μM；C5：CHIR99021 5 μM；I10：IWR1 10 μM；比例尺 = 50 μm。本图经修改自Nakajima等（2018）15。 请点击此处查看本图的放大版本。

figure-results-3
图3：源自人iPSC的体节（SM）分化的DM、MYO、D、SCL和SYN的免疫细胞化学分析。 （A）体节衍生物分化的方案示意图。（B）DM诱导第3天（自iPSC起第11天）、MYO诱导第30天（自iPSC起第41天）、D诱导第9天（自iPSC起第20天）、SCL诱导第3天（自iPSC起第11天）以及SYN诱导第21天（自iPSC起第32天）的代表性免疫细胞化学图像及PAX3（GFP）荧光图像。DM细胞使用抗ALX4和EN1抗体（红色）染色，并用DAPI（蓝色）共染色或通过PAX3（GFP）荧光（绿色）检测；MYO细胞使用抗MYOD、MYOG（红色）和MHC（青色）抗体染色，并用DAPI（蓝色）共染色；D细胞使用抗EN1（红色）和PDGFRa（青色）抗体染色，并用DAPI（蓝色）共染色；SCL细胞使用抗PAX1、PAX9和NKX3.2（红色）抗体染色，并用DAPI（蓝色）共染色；SYN细胞使用抗SCX、MKX、COL1A1和COL1A2（红色）抗体染色，并用DAPI（蓝色）共染色。DM，皮肌节；MYO，肌节；D，皮节；SCL，生骨节；SYN，生腱节；比例尺 = 50 μm。本图经修改自Nakajima等（2018）15。请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-4
图4：诱导分化的D细胞与SYN细胞的功能分析。 （A）通过ELISA检测培养基中I型胶原蛋白和透明质酸蛋白的含量。（B）通过RT-qPCR评估机械牵张刺激对诱导分化的SYN细胞及成人人类肌腱细胞的影响。数据展示为三组实验的均值±标准误（S.E.）。*p < 0.05；**p < 0.01；*** p < 0.001，与无牵张组（Stretch (-)）相比，采用Dunnett多重比较t检验；n.s，无显著性差异；HDF，人类成人皮肤成纤维细胞。本图改编自Nakajima等（2018）15。 请点击此处查看本图的高清版本。

培养基/溶液试剂浓度
CDM 基础培养基Iscove’s 改良 Dulbecco’s 培养基/Ham’s F121:1
青霉素/链霉素0.5 %
化学成分明确的脂质浓缩液1 %
去铁转铁蛋白15 mg/mL
单硫代甘油450 mM
牛血清白蛋白5 mg/mL
胰岛素7 mg/mL
CTK 溶液水-
胰蛋白酶0.25 %
胶原酶 IV0.1 mg/mL
氯化钙1 mM
Knockout SR20 %
D 诱导培养基CDM 基础培养基-
CHIR990215 µM
BMP410 ng/mL
DM 诱导培养基CDM 基础培养基-
CHIR990215 µM
BMP410 ng/mL
ECM 溶液人工细胞外基质0.3 mg/mL
DMEM/F12-
FACS 缓冲液PBS-
牛血清白蛋白0.1 %
无饲养层细胞培养基mTeSR1-
青霉素/链霉素0.5 %
HDF 培养基DMEM-
胎牛血清10 %
hESC 培养基灵长类 ES 细胞培养基-
青霉素/链霉素0.5 %
FGF24 ng/mL
MYO 诱导培养基CDM 基础培养基-
CHIR990215 µM
PSM 诱导培养基CDM 基础培养基-
SB43154210 µM
CHIR9902110 µM
DMH12 µM
FGF220 ng/mL
SCL 诱导培养基CDM 基础培养基-
SAG100 nM
LDN1931890.6 µM
SM 诱导培养基CDM 基础培养基-
SB43154210 µM
CHIR990215 µM
SYN 诱导培养基-1CDM 基础培养基-
FGF820 ng/mL
SYN 诱导培养基-2CDM 基础培养基-
BMP710 ng/mL
TGFβ310 ng/mL

表1：培养基与溶液配方。

名称正向引物反向引物
ACTBCACCATTGGCAATGAGCGGTTCAGGTCTTTGCGGATGTCCACGT
COL1A1GGACACAGAGGTTTCAGTGGTGCACCATCATTTCCACGAGC
MEOX1GAGATTGCGGTAAACCTGGAGAACTTGGAGAGGCTGTGGA
MSGN1GGAGAAGCTCAGGATGAGGAGTCTGTGAGTTCCCCGATGT
PARAXISTCCTGGAGAGCTGTGAGGATCACACCCTGTCACCAACAGT
PAX3AGGAAGGAGGCAGAGGAAAGCAGCTGTTCTGCTGTGAAGG
SCXCCCAAACAGATCTGCACCTTCGCGAATCGCTGTCTTTCTGTC
TBX6AGCCTGTGTCTTTCCATCGTAGGCTGTCACGGAGATGAAT
TNMDCCCTTCATGCTGAAGCCACTTCTCACTTTCAGCAGAATTGGGG
WNT3ACAAGATTGGCATCCAGGAGTATGAGCGTGTCACTGCAAAG

表2：用于RT-qPCR分析的引物序列。

浓度
第1步
抗体		ALX4_山羊1/50
CDH11_小鼠1/1000
COL1A1_兔1/100
COL2A1_小鼠1-2 μg/mL
EN1_兔1/50
MEOX1_兔1/50
MHC_兔1/200
MKX_兔1/50
MYOD_兔1/500
MYOG_小鼠1/400
NKX3.2_兔1/50
PARAXIS_兔1/50
PAX1_兔1/50
PAX9_兔1/50
PDGFRa_山羊1/100
SCX_兔子1/50
TBX6_山羊1/50
2nd
抗体		驴抗山羊IgG(H+L)二抗5551/500
驴抗山羊IgG(H+L)二抗6471/500
山羊抗小鼠 IgG(H+L) 二抗5551/500
山羊抗兔IgG(H+L)二抗5551/500
山羊抗兔 IgG(H+L) 二抗6471/500

表3：免疫细胞化学中的一抗和二抗。

讨论

通过原始条带（PSM）诱导多能干细胞（PSC）来源的体节中胚层（SM）的一种常用方法是在PSC向PSM诱导阶段使用CHIR99021与A83-01（TGFβ抑制剂）联合处理，但在PSM成熟过程中不再使用6。在本研究中，我们使用C59抑制WNT/β-catenin信号通路以从PSM诱导SM。然而，在SM分化阶段，我们引入CHIR99021以激活WNT通路。这一决策基于以下发现：多种WNT分子在SM周围组织中表达，且已有证据表明WNT报告基因在SM中具有活性20。结果表明，仅在添加CHIR99021的条件下，细胞间连接处出现CDH11的积累，表现出体内SM典型的上皮化特征（图2E）。该结果提示WNT信号通路在PSM分化及SM上皮化过程中具有关键作用，因此我们的方案可能更真实地模拟了内源性信号环境。但这也暗示在分化过程中进一步精细调控WNT/β-catenin信号通路的可能性，因为分化效果的稳健性和效率可能因细胞类型、细胞系以及不同研究人员所使用的WNT诱导剂种类而存在显著差异。

该方法还可使我们从人iPSCs诱导生成所有四种体节中胚层（SM）衍生物，即MYO、D、SCL和SYN。我们采用化学成分明确培养基（CDM）的分步实验方案可用于确定人类体节形成/体节模式建立过程中的信号需求，并为人类体节中胚层发育提供重要见解。例如，我们的方法可能有助于研究节段时钟机制——一种调控体节中胚层形成的分子振荡系统。该机制已在小鼠、鸡和斑马鱼中得到深入研究，但由于缺乏合适的实验工具，在人类中的研究仍属空白。

此外，我们的方法可适用于未来的临床细胞治疗。例如，可将人iPSC来源的成纤维细胞（D）或肌腱细胞（SYN）移植到严重损伤的皮肤或断裂的肌腱中，以实现再生和治疗。然而，在该方法得以实际应用之前，仍需解决若干局限性。尽管在本研究中，我们使用SNL饲养层细胞维持iPSC，并在诱导过程中使用从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的细胞外基质（ECM）溶液作为培养皿表面的包被材料，但这些来源于非人类动物的试剂应被去除，以提高临床应用的质量。此外，还需提高细胞的数量和质量，包括目标细胞的纯度和成熟度。 Furthermore，不仅细胞数量，细胞的力学强度也是肌腱/韧带再生的重要特性。此外，为了推动我们的方案向临床细胞治疗发展，开发用于细胞纯化的表面标志物以及新型的三维重构方法是必不可少的。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢东口淳也博士（CiRA）在项目管理和经费申请方面的帮助，感谢柴田光昭先生（CiRA）和寺岛芽衣女士（CiRA）提供的技术协助，感谢豊冈弥生博士（CiRA）和神谷大辅博士（CiRA）对稿件的校对，以及感谢户谷正哉先生（CiRA）提供插图（图1）。我们还感谢池谷真一和东口淳也实验室（CiRA）全体成员在本研究期间给予的支持。本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（26670661）、日本科学技术振兴机构（JST）与日本医疗研究开发机构（AMED）难治性疾病iPS细胞研究项目、再生医学实现研究基地网络iPS细胞研究核心中心（JST/AMED）以及iPS细胞研究基金（部分资助池谷真一和东口淳也）的资助。池谷真一还获得了日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（16H05447）以及利用疾病特异性iPS细胞加速难治性疾病研究项目（AMED）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ALX4_山羊抗体Santacruzsc-22066
无转铁蛋白SigmaT1147
BMP4R&D314-BP-010
BMP7R&D354-BP-010
牛血清白蛋白SigmaA8806
氯化钙Nacalai tesque067730-15
CDH11_小鼠抗体Cell signaling13577
细胞拉伸装置StrexSTB-140
化学成分明确的脂质浓缩液Gibco11905-031
CHIR99021Axon1386
COL1A1_兔抗体Abcamab34710
COL2A1_小鼠抗体Thermo scientificMS-235
胶原酶IVThermofisher17104019
DLL1 APC标记_小鼠抗体R&DFAB1818A用于FACS
DMEMSigmaD6046
DMEM/F12Gibco11320-082
DMH1Tocris4126
EN1_兔抗体Abcamab70993
胎牛血清Nichirei171012
FGF2Wako060-04543
FGF8Peprotech100-25
人皮肤成纤维细胞Cell applications160-05a
人肌腱细胞Angio proteomiecAP-0041
胰岛素Wako090-06474
Iscove’s修饰的Dulbecco’s培养基/Ham’s F12Gibco21056023
Knockout SRGibco10828028
LDN193189Axon1509
MatrigelBD bioscience354230人工细胞外基质
MEOX1_兔抗体Abcamab75895
MHC_兔抗体Santacruzsc-20641
MKX_兔抗体Atlas antibodiesA83377
巯基甘油SigmaM6145
mTeSR1Stemcell tech85850
多孔型硅橡胶培养室StrexSTB-CH-4W
MYOD_兔抗体Abcamab133627
MYOG_小鼠抗体Santacruzsc-12732
NKX3.2_兔抗体SigmaHPA027564
Novex 驴抗山羊IgG(H+L)二抗555InvitrogenA21432
Novex 驴抗山羊IgG(H+L)二抗647InvitrogenA21447
Novex 山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗555InvitrogenA21422
Novex 山羊抗兔IgG(H+L)二抗555InvitrogenA21428
Novex 山羊抗兔IgG(H+L)二抗647InvitrogenA21245
PARAXIS_兔抗体Santacruzsc-98796
PAX1_兔抗体Abcamab95227
PAX9_兔抗体Gene texGTX104454
PBS--
PDGFRa_山羊R&DAF307
青霉素/链霉素Invitrogen15140-122
灵长类动物胚胎干细胞培养基ReprocellRCHEMD001
SAGCalbiochem566661
SB431542SelleckchemSEL-S1067-10
SCX_兔抗体Abcamab58655
TBX6_山羊抗体R&DAF4744
肌腱细胞生长培养基Angio-proteomiecAP-40肌腱细胞生长培养基
TGFβ3R&D243-B3-200
胰蛋白酶Gibco15090046

参考文献

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