一种由致癌性肝细胞诱导的原位小鼠肝细胞癌模型，发生于肝脏炎症与纤维化背景下

摘要

本文描述了一种具有临床相关性的肝癌小鼠模型的建立，该模型可重现肝细胞癌（HCC）典型的免疫学特征。

摘要

目前尚缺乏能够反映肝细胞癌（HCC）典型免疫特征的临床相关动物模型，这严重阻碍了对其潜在机制的阐明以及创新性免疫治疗策略的开发。为了建立一种能够模拟人类HCC的理想动物模型，首先向免疫功能健全的雄性C57BL/6J小鼠注射四氯化碳（CCl₄）以诱导肝纤维化，随后通过脾内（ISPL）接种的方式，将来自年轻雄性SV40 T抗原（TAg）转基因小鼠（MTD2）的组织学正常的致癌性肝细胞移植至上述小鼠体内。受体雄性小鼠在青春期产生的雄激素可激活由肝特异性启动子控制的TAg表达。结果，移植的肝细胞在肝纤维化/肝硬化背景下转化为癌细胞并形成肿瘤团块。该新型模型模拟了在肝纤维化/肝硬化背景下人类HCC的发生与进展过程，并再现了人类HCC最典型的特征，包括免疫功能障碍。

引言

肝细胞癌（HCC）是美国（US）发病率增长最快的癌症类型^1,2,3。每年约有85万例新发病例被确诊^4,5，约70万名患者死于这种致命疾病^6,7,8,9,10，使其成为全球癌症相关死亡的第二大原因。HCC的治疗方式包括手术切除、移植、消融、化疗栓塞或系统性治疗，例如索拉非尼¹¹。早期诊断并采用手术切除或移植治疗可获得最高的总体生存获益⁴。然而，大多数患者在疾病晚期才被发现，需采用消融、化疗栓塞或索拉非尼进行治疗¹²。索拉非尼是一种受体酪氨酸激酶抑制剂（RTKI），于2008年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，是当时唯一可用于治疗不可切除HCC的系统性药物疗法。尽管该药物仅使总体生存期从7.9个月延长至10.7个月¹³，但它提供了一种可用于管理HCC的全新治疗策略。

通过调控免疫系统来清除已形成的癌症是癌症研究中迅速发展的领域¹⁴免疫检查点研究极大地推动了癌症治疗中免疫治疗药物的开发^15,16美国食品药品监督管理局（FDA）已批准使用针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）、程序性死亡蛋白1（PD-1）及其配体PD-L1的抗体（Abs），用于治疗黑色素瘤、肺癌、头颈部癌和膀胱癌^17,18,19,20针对晚期肝细胞癌（HCC）的治疗，目前正在进行多项临床试验，评估单独使用或联合使用一种或多种抗PD-1、PD-L1或CTLA-4抗体的单药疗法或联合疗法^21,22,23，一些试验已显示出良好的结果。2017年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准抗PD-1抗体用于治疗对索拉非尼耐药的肝细胞癌（HCC）患者，但该疗法的总体缓解率仅为14.3%。目前，其他策略尚未转化为临床实践^24,25克服肿瘤诱导的深度免疫耐受以改善免疫检查点治疗²⁶；预测免疫检查点治疗的疗效；预防免疫相关不良事件；优化给药途径、剂量和频率；以及寻找有效的联合治疗方案^27,28,29 仍然是极具挑战性的任务。

目前有多种传统方法可用于在小鼠模型中诱导肝细胞癌（HCC），具体选择取决于研究者的特定研究问题³⁰。使用基因毒性化合物诱导的HCC小鼠模型可模拟损伤诱导的恶性肿瘤。通过异位或原位移植HCC细胞系建立的异种移植模型适用于药物筛选。已有多种基因修饰小鼠被构建用于研究HCC的病理生理机制。表达病毒基因、癌基因和/或生长因子的转基因小鼠有助于识别参与肝癌发生的信号通路。然而，由于这些模型存在固有的局限性，无法重现人类HCC中典型的免疫特征，这在很大程度上阻碍了对潜在机制的阐明以及创新性免疫治疗策略的开发^14,15。我们近期建立了一种具有临床相关性的新型小鼠模型。该模型不仅能够模拟人类HCC的发生与进展过程，还能反映人类疾病中最典型的特征，包括免疫功能障碍。我们已系统表征了该模型的生物学和免疫学特性。利用这一新型模型，我们探索了多种针对HCC的免疫治疗策略^{31,32,33,34,35,36,37}。这一独特平台使我们能够研究肿瘤诱导的免疫耐受机制，并开发出可用于HCC治疗的概念验证性治疗策略，最终推动其向临床转化。

方案

注意：所有涉及动物实验的操作均已获得密苏里大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。所有小鼠的饲养与实验均按照《"实验动物护理与使用指南"》中规定的原则进行人道照护。细胞分离与接种的以下操作均应在生物安全柜中进行。所有操作人员应穿戴标准的个人防护装备，以处理小鼠及组织样本。

1. 通过腹腔注射四氯化碳（CCl₄）诱导肝纤维化和肝硬化

注意：参见 图1. (CCl₄ 是一种高度危险的试剂，应小心操作，并佩戴耐化学腐蚀手套

1. 取6至8周龄的雄性C57BL/6J小鼠（参见材料表）。
2. 在离心管中用玉米油配制10% CCl₄ （v/v）溶液。根据待注射小鼠数量确定总体积（见步骤1.6）。
3. 采用适当的小鼠操作技术，选择一只小鼠进行注射。
4. 手动固定小鼠，使其背部朝下（腹部朝上）。
5. 用70%酒精擦拭小鼠腹壁注射部位进行消毒。
6. 使用25号一次性注射针头，通过腹腔（IP）注射方式，向雄性C57BL/6J小鼠注射160 µL的10% CCl₄ 溶液。
7. 确保针头仅穿透腹壁（约4-5 mm），针尖斜面朝上，并以15-20度角轻微倾斜。
8. 每周注射两次，持续四周，每只小鼠共接受八次注射。
   注意：末次注射两周后，处理过的小鼠即可用于接种来自MTD2小鼠的致癌性肝细胞（ISPL接种）。

2. 从 MTD2 品系小鼠中分离标记转基因肝细胞

注意：溶液配方见表1。

不含 Ca 或 Mg 的 10 倍浓度 Earle's 平衡盐溶液（EBSS 不含 Ca 或 Mg）	4 g KCl 68 g NaCl 1.4 g NaH2PO4·H2O 10 g 葡萄糖 加水至 1 升，调 pH 至 4.32 经滤器过滤
溶液 1	20 mL 不含 Ca 或 Mg 的 10 倍浓度 EBSS 44 g NaHCO3 1.33 mL 1.5 M Hepes 10 mL 10 mM EGTA 加水至 200 mL
溶液 2	100 mL 10 倍浓度 EBSS 2.2 g NaHCO3 6.67 mL 1.5 M Hepes 加水至 1 升
0.75% 胶原酶溶液	15 mg I 型胶原酶 20 mL 溶液 2
完全培养基	2 倍浓度 RPMI 50 mL 胎牛血清（FBS） 5 mL 100 倍浓度青霉素-链霉素

表1：溶液配方。

1. 获取 MTD2 小鼠品系³⁸，作为致癌性肝细胞的来源。
2. 使用 2.5% 异氟烷对 5 周龄的 MTD2 小鼠进行麻醉。
   注意：应通过脚趾夹捏法检查麻醉是否充分。简而言之，用两根手指用力挤压小鼠的脚趾或足部。若无回缩反应，则判断动物已进入足够深的麻醉状态，可开始手术。
3. 当小鼠充分镇静后，将其置于仰卧位，并用胶带固定四肢，以充分暴露腹部表面。
4. 使用剪刀沿腹白线中线做腹腔正中切口，切口长度应足够大，以充分暴露肝脏。
5. 将肠道向左侧移位，以更好地暴露肝脏和门管三联结构。
6. 在肝脏上方进行解剖，暴露下腔静脉（IVC）。
7. 使用动脉夹在肝脏上方结扎下腔静脉。
8. 回到肝脏下缘，使用蝶形针（见材料部分）经门静脉建立静脉通路。用手固定导管。
9. 通过导管，使用注射器以 8.9 mL/min 的流速依次灌注 15 mL 溶液 1、15 mL 0.75% 胶原酶溶液 2 和 15 mL 溶液 2，对小鼠肝脏进行连续灌注。
10. 剪下灌注后的肝脏，从 MTD2 小鼠中取出肿瘤组织，放入含 10–15 mL PBS 的 50 mL 锥形管中。
11. 移除 PBS，并再用 PBS 洗涤一次；此步骤中不要离心。
12. 使用剪刀将肝脏切成更小的组织块，然后用 PBS 再次洗涤 2 次 ，以去除残留血液。
13. 向锥形管中加入 5 mL 完全 RPMI 培养基，持续用剪刀将肝脏组织剪切成小块（<3 mm），组织应能顺利通过 5 mL 移液管。
14. 加入完全 RPMI 培养基至终体积为 30 mL，并用 5 mL 移液管重悬肝脏组织。
15. 使用 70 µm 细胞筛将混合液过滤至 50 mL 锥形管中。
16. 用完全 RPMI 培养基多次冲洗细胞筛，并通过添加额外的 RPMI 培养基将最终体积调至 50 mL。
17. 将悬液快速离心，转速最高不超过 500 rpm；一旦加速至 50 × g，即应停止离心。
18. 倾去上清液，将沉淀物重悬于 20 mL PBS 中。
19. 使用台盼蓝染色排斥法和血细胞计数板进行细胞计数，然后将细胞浓度调整为 2.5 × 10⁶/mL，用于后续细胞接种。
    注意：预期每 5 克肿瘤组织可获得约 8000 万个肝细胞，细胞活力>95%。

3. 通过ISPL注射将MTD2小鼠的肝细胞接种至野生型C57BL/6J小鼠的肝脏

1. 所有操作均应采用无菌技术
2. 麻醉 CCl₄用2.5%异氟烷处理雄性C57BL/6J小鼠时，应使用眼用润滑剂处理小鼠眼睛，以防止眼睛干涩。
3. 准备含有200 µL肝细胞的注射器用于注射。
4. 当小鼠充分镇静后，将其置于左侧卧位。
5. 剃除小鼠左侧 flank 的全部毛发，然后用 70% 酒精和碘伏交替擦拭该区域，共三次。
6. 术前皮下注射5 mg/kg卡洛芬。
7. 在左侧 flank 处做一长度为 1 cm 的切口，与第13肋平行^th 从背侧末端开始，紧邻脊柱肌下方切取肋骨。
8. 识别脾脏，然后使用钝头镊子将其牵出体外。
9. 用两个中号钛夹夹闭脾脏。将两个钛夹置于脾动脉与脾静脉之间，夹子之间留出空隙，以便接种后剪切。
   注意：目的是分离脾脏下极，以降低播散风险。
10. 使用27 G针头将200 µL（50万个）制备好的肝细胞注入脾脏下极。
11. 用一个中号夹子夹闭蒂部的下支（脾下极血管）。
12. 在最初放置的两个夹子之间剪断脾脏。
13. 切除被肿瘤细胞直接注射的脾脏下极。
14. 使用3-0聚乳酸羟基乙酸缝线间断缝合关闭内层肌肉。
15. 使用无菌钢制伤口夹闭合外层皮肤。
    注意：与缝线相比，更推荐使用钢夹，以避免动物咬断缝线导致伤口裂开。
16. 缝合后皮下注射5 mg/kg卡洛芬。
17. 将所有恢复中的动物置于温控加热垫上，并密切监测直至完全从麻醉中恢复。
18. 术后给予小鼠自由饮水。若小鼠在手术过程中出现脱水，应皮下注射液体（<1 mL。
19. 术后7至10天拆除皮肤夹。

结果

从TAg转基因小鼠中分离的癌性肝细胞（图2）通过脾内注射接种至野生型小鼠肝脏中（图3）。移植的肝细胞在肝脏炎症和纤维化的背景下，成功且稳定地生长出表达肿瘤特异性抗原SV40 TAg的原位肝细胞癌（HCC）肿瘤（图1、图4、图5）。

图 1：制备肝细胞癌小鼠模型的示意图。建立一种创新性小鼠肝细胞癌（HCC）模型的实验设计。首先对 C57BL/6J 小鼠每周腹腔注射 CCl

讨论

通过本方案，我们建立了一种可靠且可重复的小鼠肝细胞癌（HCC）模型，该模型能够模拟人类HCC的发生与进展过程。临床上，多种风险因素依次引发肝损伤、肝纤维化、肝硬化，最终发展为HCC。在本方案中，首先通过腹腔注射四氯化碳（CCl₄）在野生型小鼠中诱导肝纤维化，从而为后续致癌性肝细胞在肝纤维化背景下形成肿瘤创造条件。我们发现，与在其他时间点接种肝细胞的小鼠相比，在CCl₄处理两周后接种肝细胞的小鼠肿瘤形成最为成功。此外，我们发现肝纤维化可在CCl₄注射后持续存在长达四个月。与未接受CCl₄处理的小鼠相比，采用该方法可使超过90%的小鼠发展出HCC肿瘤。在本模型中，来自MTD2品系小鼠的肝细胞被转移至C57BL/6J小鼠体内后，会归巢至肝脏，并整合为表达TAg作为组织抗原的肝细胞。从MTD2小鼠中分离肝细胞是本方案中的关键步骤。需使用溶液1和溶液2对MTD2小鼠肝脏进行充分灌注，以彻底清除肝脏内的循环红细胞。采用指定浓度和流速的胶原酶溶液对肝脏进行灌注，以实现适度的肝脏消化并释放肝细胞。我们发现，若胶原酶浓度过低，则消化不充分，导致肝细胞成团；而浓度过高则...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉机	VETEQUIP	IMPAC6	用于手术的麻醉机
蝶形针	BD	8122963	用于肝脏灌注的针头
C57BL/6 小鼠	Jackson Lab	000664	实验方案中使用的小鼠
卡洛芬	CRESCENT CHEMICAL	20402	用于缓解疼痛的卡洛芬
细胞筛	CORNING	REF 431751	70µm 细胞筛，用于肝细胞分离
离心机	Beckman Coulter	Allegra X-30R	用于细胞分离的离心机
夹子	Teleflex Medical	REF 523700	用于脾脏的钛夹
显微镜	Zeiss	Primovert	用于细胞观察的显微镜
Mtd2 小鼠	N/A		2002年由罗斯韦尔·帕克癌症研究所 William A Held 博士惠赠，在本实验室保种
针头	BD	REF 305109	BD PrecisionGlide 针头，27G × 1/2 (0.4mm × 13mm)
缝合线	ETHICON	J303H	涂层薇乔缝合线
SV40 T 抗原抗体	Abcam	ab16879	用于免疫组化检测的抗 SV40 T 抗原抗体
注射器	BD	REF 309626	1 mL TB 注射器，用于细胞注射
台盼蓝	SIGMA	T 8154	用于细胞活力检测的台盼蓝溶液
伤口夹	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	不锈钢伤口夹，用于伤口闭合