一种由致癌性肝细胞诱导的原位小鼠肝细胞癌模型，发生于肝脏炎症与纤维化背景下

摘要

本文描述了一种具有临床相关性的肝癌小鼠模型的建立，该模型可重现肝细胞癌（HCC）典型的免疫学特征。

摘要

目前尚缺乏能够反映肝细胞癌（HCC）典型免疫特征的临床相关动物模型，这严重阻碍了对其潜在机制的阐明以及创新性免疫治疗策略的开发。为了建立一种能够模拟人类HCC的理想动物模型，首先向免疫功能健全的雄性C57BL/6J小鼠注射四氯化碳（CCl₄）以诱导肝纤维化，随后通过脾内（ISPL）接种的方式，将来自年轻雄性SV40 T抗原（TAg）转基因小鼠（MTD2）的组织学正常的致癌性肝细胞移植至上述小鼠体内。受体雄性小鼠在青春期产生的雄激素可激活由肝特异性启动子控制的TAg表达。结果，移植的肝细胞在肝纤维化/肝硬化背景下转化为癌细胞并形成肿瘤团块。该新型模型模拟了在肝纤维化/肝硬化背景下人类HCC的发生与进展过程，并再现了人类HCC最典型的特征，包括免疫功能障碍。

引言

肝细胞癌（HCC）是美国（US）发病率增长最快的癌症类型^1,2,3。每年约有85万例新发病例被确诊^4,5，约70万名患者死于这种致命疾病^6,7,8,9,10，使其成为全球癌症相关死亡的第二大原因。HCC的治疗方式包括手术切除、移植、消融、化疗栓塞或系统性治疗，例如索拉非尼¹¹。早期诊断并采用手术切除或移植治疗可获得最高的总体生存获益⁴。然而，大多数患者在疾病晚期才被发现，需采用消融、化疗栓塞或索拉非尼进行治疗¹²。索拉非尼是一种受体酪氨酸激酶抑制剂（RTKI），于2008年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，是当时唯一可用于治疗不可切除HCC的系统性药物疗法。尽....

方案

注意：所有涉及动物实验的操作均已获得密苏里大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。所有小鼠的饲养与实验均按照《"实验动物护理与使用指南"》中规定的原则进行人道照护。细胞分离与接种的以下操作均应在生物安全柜中进行。所有操作人员应穿戴标准的个人防护装备，以处理小鼠及组织样本。

1. 通过腹腔注射四氯化碳（CCl₄）诱导肝纤维化和肝硬化

注意：参见 图1. (CCl₄ 是一种高度危险的试剂，应小心操作，并佩戴耐化学腐蚀手套

1. 取6至8周龄的雄性C57BL/6J小鼠（参见材料表）。
2. 在离心管中用玉米油配制10% CCl₄ （v/v）溶液。根据待注射小鼠数量确定总体积（见步骤1.6）。
3. 采用适当的小鼠操作技术，选择一只小鼠进行注射。
4. 手动固定小鼠，使其背部朝下（腹部朝上）。
5. 用70%酒精擦拭小鼠腹壁注射部位进行消毒。
6. 使用25号一次性注射针头，通过腹腔（IP）注射方式，向雄性C57BL/6J小鼠注射160 µL的10% CCl₄ 溶液。
7. 确保针头仅穿透腹壁（约4-5 mm），针尖斜面朝上，并以15-20度角轻微倾斜。....

结果

从TAg转基因小鼠中分离的癌性肝细胞（图2）通过脾内注射接种至野生型小鼠肝脏中（图3）。移植的肝细胞在肝脏炎症和纤维化的背景下，成功且稳定地生长出表达肿瘤特异性抗原SV40 TAg的原位肝细胞癌（HCC）肿瘤（图1、图4、图5）。

图 1：制备肝细胞癌小鼠模型的示意图。建立一种创新性小鼠肝细胞癌（HCC）模型的实验设计。首先对 C57BL/6J 小鼠每周腹腔注射 CCl

讨论

通过本方案，我们建立了一种可靠且可重复的小鼠肝细胞癌（HCC）模型，该模型能够模拟人类HCC的发生与进展过程。临床上，多种风险因素依次引发肝损伤、肝纤维化、肝硬化，最终发展为HCC。在本方案中，首先通过腹腔注射四氯化碳（CCl₄）在野生型小鼠中诱导肝纤维化，从而为后续致癌性肝细胞在肝纤维化背景下形成肿瘤创造条件。我们发现，与在其他时间点接种肝细胞的小鼠相比，在CCl₄处理两周后接种肝细胞的小鼠肿瘤形成最为成功。此外，我们发现肝纤维化可在CCl₄注射后持续存在长达四个月。与未接受CCl₄处理的小鼠相比，采用该方法可使超过90%的小鼠发展出HCC肿瘤。在本模型中，来自MTD2品系小鼠的肝细胞被转移至C57BL/6J小鼠体内后，会归巢至肝脏，并整合为表达TAg作为组织抗原的肝细胞。从MTD2小鼠中分离肝细胞是本方案中的关键步骤。需使用溶液1和溶液2对MTD2小鼠肝脏进行充分灌注，以彻底清除肝脏内的循环红细胞。采用指定浓度和流速的胶原酶溶液对肝脏进行灌注，以实现适度的肝脏消化并释放肝细胞。我们发现，若胶原酶浓度过低，则消化不充分，导致肝细胞成团；而浓度过高则.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉机	VETEQUIP	IMPAC6	用于手术的麻醉机
蝶形针	BD	8122963	用于肝脏灌注的针头
C57BL/6 小鼠	Jackson Lab	000664	实验方案中使用的小鼠
卡洛芬	CRESCENT CHEMICAL	20402	用于缓解疼痛的卡洛芬
细胞筛	CORNING	REF 431751	70µm 细胞筛，用于肝细胞分离
离心机	Beckman Coulter	Allegra X-30R	用于细胞分离的离心机
夹子	Teleflex Medical	REF 523700	用于脾脏的钛夹
显微镜	Zeiss	Primovert	用于细胞观察的显微镜
Mtd2 小鼠	N/A		2002年由罗斯韦尔·帕克癌症研究所 William A Held 博士惠赠，在本实验室保种
针头	BD	REF 305109	BD PrecisionGlide 针头，27G × 1/2 (0.4mm × 13mm)
缝合线	ETHICON	J303H	涂层薇乔缝合线
SV40 T 抗原抗体	Abcam	ab16879	用于免疫组化检测的抗 SV40 T 抗原抗体
注射器	BD	REF 309626	1 mL TB 注射器，用于细胞注射
台盼蓝	SIGMA	T 8154	用于细胞活力检测的台盼蓝溶液
伤口夹	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	不锈钢伤口夹，用于伤口闭合