方法文章

通过相频生成振动光谱揭示聚合物和生物大分子的界面分子级结构

DOI：

10.3791/59380

⸱

2019年8月13日

 ,  , 
1State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

综合利用,总频率生成(SFG)振动光谱有助于揭示聚合物和生物大分子界面发生的链构体顺序和二次结构变化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作为二阶非线性光学光谱,相和频率生成(SFG)振动光谱已广泛应用于研究各种表面和界面。这种非侵入性光学技术可以提供具有单层或亚单层灵敏度的局部分子级信息。我们在这里提供了如何选择性地检测大分子和生物大分子的埋藏界面的实验方法。并在此基础上讨论了丝纤维素的界面二级结构以及模型短链寡核苷酸双相周围的水结构。前者显示链条重叠或空间约束效应,后者显示保护功能,防止由水的性脊柱上部结构产生的Ca2+离子。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

总频率生成(SFG)振动光谱的发展可以追溯到沈等人30年前1、2年所做的工作。界面选择性和亚单层灵敏度的独特性使SFG振动光谱学受到物理学、化学、生物学和材料科学等领域大量研究人员的赞赏,3,4 , 5.目前,使用SFG正在研究与表面和界面相关的广泛科学问题,特别是与聚合物和生物大分子相关的复杂界面,如链结构和结构松弛。埋藏聚合物界面,蛋白质二级结构,和界面水结构9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23 24,25,26.

对于聚合物表面和界面,通常通过自旋涂层制备薄膜样品,以获得所需的表面或界面。问题产生是由于信号干扰从两个接口的制备薄膜,这导致不便分析收集的SFG光谱27,28,29 。在大多数情况下,振动信号仅来自单个接口,无论是薄膜/基板还是薄膜/另一种介质,都是可取的。实际上,解决这个问题的方法很简单,即实验性地最大化理想界面的光场,并尽量减少另一个界面的光场。因此,菲涅尔系数或局部场系数需要通过薄膜模型计算,并结合实验结果3、9、10、11进行验证。 12,13,14,15,30。

考虑到上述背景,可以研究一些聚合物和生物界面,以便从分子水平上了解基础科学。在以下,以三个界面问题为例:探测聚聚物(2-羟基乙二醇丙烯酸酯)表面和埋藏界面与基板9,在聚苯乙烯(PS)表面形成丝纤维素(SF)二级结构,水结构周围的模型短链寡核苷酸双工16,21,我们将展示SFG振动光谱如何帮助揭示与基础科学相关的界面分子级结构。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SFG实验

  1. 使用商用皮秒 SFG 系统 (材料表),它基于 Nd:YAG 激光提供脉冲宽度为 ±20 ps 和 50 Hz 频率的基本 1064 nm 光束。
  2. 通过使用第二和第三谐波模块,将基本 1064 nm 光束转换为 532 nm 光束和 355 nm 光束。直接引导 532 nm 光束作为输入光束,并通过光学参数生成 (OPG)/光学参数放大 (OPA)生成其他输入中红外 (IR) 光束,覆盖频率范围从 1000 到 4000 厘米-1)差频生成 (DFG) 过程。
  3. 将两个输入光束的入射角度分别设置为 53° (IR) 和 64°(可见),与曲面法线相对应。
  4. 要检测聚合物界面结构(薄膜/基板界面或薄膜/其他介质界面),请使用sp(s极化和频率光束、s极化可见光束和p极化红外光束)和ppp极化组合。
  5. 为了检测DNA周围的界面蛋白二级结构和水结构,除了ssp和ppp外,还使用了手性spp和psp极化组合。
  6. 为确保样品不损坏,将红外和可见脉冲能量分别控制在+70和+30 mJ。图1显示了具有能量水平图的SFG过程原理图。图 2显示了洁净室中的 SFG 系统。

2. 菲涅尔系数

  1. 使用直角棱镜作为基板,用于此处讨论的所有实验。固体基板上有聚合物薄膜的两个接口,即空气中的聚合物表面和聚合物/基板界面。由于两个接口的反转对称性都断开,因此两者都可以生成 SFG 信号。因此,收集的 SFG 频谱是干扰的频谱。然而,两个接口处的局部场系数或菲涅尔系数可以通过一次或同时改变事件角度或薄膜厚度来调节。这为我们提供了从一个接口探测SFG振动信号的机会。在这里,在CaF2棱镜上的PHEMA电影被作为一个例子9。
  2. 如图3所示,使用直角棱镜几何体来检测从底部 PHEMA 薄膜生成的 SFG 信号。反射模式下的 SFG 输出强度表示为
    figure-protocol-1(1)
    表示figure-protocol-2有效的二阶非线性易感张数。
    figure-protocol-3由三个部分组成,即棱镜/聚合物界面、聚合物/底部介质界面(底部介质包括气体、液体或固体)和非谐振背景,如下方程所示。
    figure-protocol-4(2)
    在这里,底部介质可以是空气、水或其他东西。F表示负责局部场校正的相应菲涅尔系数。
  3. 在这种情况下,应用薄膜模型来计算菲涅尔系数。这里只介绍简短的计算过程。
    1. 对于棱镜/聚合物界面,请使用
      figure-protocol-5(3)
      figure-protocol-6(4)
      figure-protocol-7(5)
      下面显示了每个参数的含义。
      1. *i表示光束频率。
      2. t p 和ts表示总体传输系数,可以表示为
        figure-protocol-8(6)
        figure-protocol-9(7)
      3. tp12和ts12表示棱镜/聚合物接口处光束的线性传输系数。
      4. rp23和rs23表示聚合物/介质接口处光束的线性反射系数。
      5. •表示反射光束及其次级反射光束在聚合物薄膜上传播后,然后反射回,可以表示为
        figure-protocol-10(8)
      6. *表示光束的波长,d表示聚合物薄膜厚度。
      7. #1和#2分别表示棱镜/聚合物界面和聚合物/介质界面上的事件角度。
      8. n1和n2分别表示棱镜和聚合物薄膜的折射率。
      9. n12 表示棱镜/聚合物的聚合物界面层的折射率。
    2. 对于聚合物/介质接口,请使用
      figure-protocol-11(9)
      figure-protocol-12(10)
      figure-protocol-13(11)
      1. •表示两个接口处的光电场的相位差。
      2. 由于输入光束的脉冲宽度为 ±20 ps,因此可以忽略与色散效应相关的时间延迟误差。
      3. 输出SFG、输入可见光和输入红外光束的相位差的表达式可以单独写成
        figure-protocol-14(12)
        figure-protocol-15(13)
        figure-protocol-16(14)
         
  4. 从上述讨论中,对于棱镜-聚合物薄膜-介质(1-2-3)系统,将棱镜/聚合物和聚合物/介质接口的总菲涅尔系数表示为以下方程,用于斯sp和ppp极化组合.当然,这两个接口都被认为是等位位。
    1. 对于棱镜/聚合物界面,sp 和ppp极化组合的总菲涅尔系数表达式如下所示。
      1. 对于ssp,方程为
        figure-protocol-17(15)
      2. 对于ppp,方程是
        figure-protocol-18(16)
        figure-protocol-19(17)
        figure-protocol-20(18)
        figure-protocol-21(19)
         
      3. t10和t01分别表示空气/棱镜和棱镜/空气接口处的线性传输系数。
    2. 对于聚合物/介质接口,sp 和ppp极化组合的总菲涅尔系数表达式描述如下。
      1. 对于ssp,方程为
        figure-protocol-22(20)
      2. 对于ppp,方程为
        figure-protocol-23(21)
        figure-protocol-24(22)
        figure-protocol-25(23)
        figure-protocol-26(24)
           
         
  5. 使用夹层模型计算菲涅尔系数后,将它们绘制为薄膜厚度的函数,如图4所示。
    注: 在这种情况下,存在从 CaF2棱镜/PHEMA 接口收集 SFG 信号的厚度范围,而另一个接口(约 150 nm)的可忽略贡献。同样,可以选择合适的厚度来检测PHEMA/底部介质接口,而CaF2棱镜/PHEMA接口的可忽略贡献。

3. C希拉尔 SFG 极化组合

  1. 对于正常的音质界面,通常使用C+v对称在整体平均33,34。通过反转对称操作,可以推断出非零二阶非线性灵敏度张量分量,即 c xxz、c xzx、c zxx、cyyz、cyzy、czyy和 c zzz(c xxz、c zyy 和 c zzz(cxxz、cxzx、czzy、czzz 如果假定各向异性接口,则现有术语可以进一步减少,这意味着 x 和 y 相同)。然而,对于手性界面,情况会有所不同。手性界面具有C+对称性,只允许旋转对称操作。在这种情况下,除了正常的语性术语外,更多的二阶非线性感知性将是非零的,这可以称为手性术语,即,在非电子条件下,czyx、czxy和 cyzx共振。因此,通过使用psp、pps和spp极化组合,手性SFG光谱可以收集33,34。

4. 样品制备

  1. PHEMA 薄膜的制备
    1. 将PHEMA粉末(见材料表)溶解在无水乙醇中,分别用2 wt%和4wt%制备溶液。
    2. 在PHEMA薄膜沉积之前,先将CaF2直角棱镜浸泡在甲苯溶剂中,然后用乙醇和超纯水(18.2 MΩ cm)清洗。
    3. 之后,将基板(CaF2直角棱镜)暴露于氧等离子体中,通过等离子清洗器去除可能的有机污染物(参见材料表)。
      1. 首先打开等离子清洁剂,将基板放入其中。
      2. 然后打开真空泵以吸尘器。输入其中的氧气。
      3. 最后设置4分钟的清洁时间。之后,保持清洁基板,用于顺序PHEMA薄膜制备。
      4. 然后由旋转涂层在 CaF2棱镜上准备 PHEMA 薄膜(参见材料表)。根据溶液浓度和旋转速度调整薄膜厚度。
        1. 将 CaF2棱镜固定在旋转涂层的吸吮盘上。
        2. 将之前制备的 PHEMA 溶液滴到 1,500 rpm 的清洁基板上 1 分钟(薄膜厚度 2 wt% 用于 100 nm,4 wt% 用于 200 nm)。
      5. 在真空烤箱中,在80°C过夜,所有制备的PHEMA薄膜都发火。
  2. 丝纤维化制剂 (SF)
    注:卡普兰等人第35号建议的议定书获得通过。
    1. 将7.5克B.mori的蚕丝放入沸腾的碳酸钠(Na2CO3,0.02 M)水溶液(3L)中30分钟,将纤维SF取出至干净的容器中。
    2. 在搅拌下用去离子水清洗获得纤维SF三次,以去除水塞林分子,只留下纤维样品中的SF分子。
    3. 在真空烤箱中干燥纤维SF样品,在60°C下过夜。
    4. 之后,将脱胶纤维SF样品溶解在溴化锂(LiBr,9.3 M)水溶液中(在+4 mL的LiBr溶液中解决1克SF),并在60°C下在搅拌下孵育2小时。
    5. 将SF溶液对去离子水(3,500 Da透析袋)进行3天透析,以去除溶解的LiBr。每天更换三次新的去离子水。最后,将处理过的SF溶液存储在4°C,以便以后进行SFG实验。
  3. 短链寡核苷酸双相的制备
    1. 从商业公司(见材料表)订购由胆固醇-三乙二醇(Chol-TEG)(5'-GCTCCGAAGGTCGA-3)修改的单链寡核苷酸样品及其3'端。"对于每根单链,将10 nmol样品粉末溶解在0.5ml超纯水中。然后将它们混合在一起,形成双面寡核苷酸溶液(10 nmol/mL)。
    2. 混合2毫克1,2-二甲苯-甘油-3磷脂素(DPPC)和2毫克脱脂DPPC(d-DPPC),并将其溶解在1mL的氯仿中,以制备脂质溶液。
    3. 由朗缪尔-布洛杰特 (LB) 槽制备 DPPC 和 d-DPPC 单层
      1. 将直角 CaF2棱镜连接到自制样品支架上,其中一个棱镜面垂直浸入 LB 槽的水环境。
      2. 之后,将之前制备的混合脂质溶液注射到水面上,直到表面压力达到低于34 mNμm±1的一定值。
      3. 表面压力水平降低后,使用两个铁氟龙屏障以5 mm/min的比例压缩脂质单层,直到达到34 mNμm+1的表面压力。
      4. 以垂直1毫米/分钟的速度将脂质单层从水中提起棱镜。
    4. 其他脂质单层的制备
      1. 为了通过疏水性相互作用(胆固醇和脂质烷基链)促进双面寡核苷酸和脂质分子的组装,将双面寡核苷酸溶液与脂质溶液混合,摩尔比为1:100(寡核苷酸至脂质)。
      2. 将混合脂质和双核苷酸溶液注射到自制的铁氟龙容器中,直到达到34 mNμm+1的表面压力。
    5. 最后,将棱镜底部的脂质单层与水面上插入的双面寡核苷酸的脂质单层接触,形成SFG测量的最终样品。
  4. 洛伦茨方程
    1. 使用洛伦兹方程拟合 SFG 光谱,以提取特定振动模式的振动信息。
      figure-protocol-27(25)
      其中figure-protocol-28表示qth振动模式的强度,figure-protocol-29表示谐振频率,figure-protocol-30表示半最大宽度 (HWHM) 的半宽度,表示figure-protocol-31事件 IR 光束的扫描频率。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在协议部分的菲涅尔系数部分,我们已经表明,从理论上讲,一次只选择性地检测一个接口是可行的。在这里,实验,我们确认这种方法基本上是正确的,如图5和图6所示。

图5显示了水侵入后埋藏的界面PHEMA结构,带有+150 nm PHEMA水凝胶膜,图6显示了水中表面结构与±430 nm PHEMA水凝胶膜。面板 A 和 B 分别对应于这两个数字的 CH 和 CO 范围。在埋藏的界面上,所有观察到的振动峰都是尖锐而清晰的。原因是CaF2基板光滑,不能被PHEMA分子穿透,导致尖锐的CaF 2/PHEMA接口。然而,在表面上,由于水分子可以与PHEMA相互作用并扩散到体积中,PHEMA/水界面不会像埋藏的界面那样锋利。因此,观察到这两个接口的不同光谱轮廓。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了从分子水平上研究结构信息,SFG 具有其固有的优势(即单层或亚单层灵敏度和界面选择性),可用于研究各种接口,如固体/固体、固体/液体、固体/气体、液体/气体、液体/液体接口。尽管设备维护和光学校准仍然耗时,但回报显著,因为可以在表面和接口上获得详细的分子级信息。

探测聚物(2-羟基乙二甲酸酯)溶液中的表面和埋藏界面:如上文所示,可以调整光场系数。我们可以用实验来证实这一点。在与基板的埋藏界面上,由于CaF2基板表面光滑且不能被PHEMA分子穿透,因此该接口非常锐利。然而,在与水的表面,水分子可以与PHEMA分子相互作用,并扩散到体积。因此,这个界面是模糊的,而不是像埋藏的那么锋利。因此,将观察到这两个接口的不同SFG光谱剖面。我们的实验性SFG数据确实证明了这一点,表明能够有选择地探测与基板或溶液表面的埋藏接口。

链间相互作用或约束对丝纤维素二次结构的形成的影响:一个关键因素是关键重叠浓度(C#)。对于 SF,C# 为 ±1.8 mg/mL。在实验中,对于[90 m...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究得到了国家基础研究重点发展计划(2017YFA0700500)和国家自然科学基金(21574020)的支持。中央高校基础研究基金,由江苏省高等学校重点学术项目开发项目和国家实验生物医学工程示范中心资助教育(东南大学)也受到高度赞赏。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 （DPPC） Avanti Polar Lipids， Inc. 公司850355P-1g
无水乙醇药化学试剂有限公司100092680≥99.7%
CaF2棱镜成都亚斯光电有限公司
水氯化钙药化学试剂有限公司10005817≥96.0%
氘代 DPPC （d-DPPC）Avanti Polar Lipids， Inc.860345P-100mg
电磁炉Zhejiang Supor Co.， LtdC21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett （LB） 槽KSV NIMA Co.， Ltd.KN 2003
溴化锂无水药化学试剂有限公司20056926
Milli-Q合成系统 Millipore超纯水
等离子清洗剂成都明恒科技股份有限公司Technology Co.， LtdPDC-MG氧气等离子清洗
聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯） （PHEMA）Sigma-Aldrich Co.， LLC.192066 MSDSMw = 300 000
聚苯乙烯Sigma-Aldrich Co.， LLC。330345 MSDSMw = 48 kDa 和 Mn = 47 kDa
家蚚蚕茧
核苷酸的单互补链南京金斯瑞生物科技有限公司H035965'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
单链寡核苷酸南京金斯瑞生物科技有限公司H04936 胆固醇-三甘醇 （Chol-TEG） 修饰的 3¢ ;末端 （5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢）
碳酸钠无水国药化学试剂有限公司10019260≥99.8%
中国科学院微电子研究所KW-4A涂机塑料薄膜的制备 
台阶轮廓仪VeecoDEKTAK 150用于测量薄膜厚度
和频产生 （SFG） 振动光谱系统EKSPLAA 商用皮秒 SFG 系统
国无国国 来自的寡 旋用于

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