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方法文章

通过和频产生振动光谱揭示聚合物与生物大分子的界面分子级结构

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⸱

DOI：

10.3791/59380

⸱

2019年8月13日

 ,  , 
1State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University

本文内容

摘要

和频产生（SFG）振动光谱被广泛应用，有助于揭示聚合物和生物大分子界面处发生的链构象有序性及二级结构变化。

摘要

作为一种二阶非线性光学光谱技术，和频生成（SFG）振动光谱已广泛应用于各类表面和界面的研究。这种非侵入性光学技术能够以单分子层甚至亚单分子层的灵敏度提供局部分子水平的信息。本文介绍了如何选择性地检测大分子及生物大分子中埋藏界面的实验方法。基于此，讨论了丝素蛋白的界面二级结构以及围绕模型短链寡核苷酸双螺旋的水结构。前者表现出链间重叠或空间限域效应，后者则因水的手性脊状超结构而对Ca2+离子具有保护作用。

引言

和频生成（SFG）振动光谱技术的发展可追溯到三十年前沈等人的工作1,2。其独特的界面选择性和亚单分子层灵敏度，使SFG振动光谱受到物理学、化学、生物学和材料科学等领域众多研究人员的青睐3,4,5。目前，SFG被广泛用于研究与表面和界面相关的多种科学问题，特别是涉及聚合物和生物大分子的复杂界面，例如埋藏聚合物界面处的链结构与结构弛豫、蛋白质二级结构以及界面水结构9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26。

对于聚合物表面和界面，通常通过旋涂法制备薄膜样品，以获得所需的表面或界面。然而，由于所制备薄膜的两个界面会产生信号干扰，这给收集到的SFG光谱分析带来了不便27,28,29。大多数情况下，人们希望仅获得单一界面（即薄膜/基底界面或薄膜/其他介质界面）的振动信号。实际上，解决这一问题的方法非常简单，即在实验上使目标界面处的光场强度最大化，同时使另一界面处的光场强度最小化。因此，需要通过薄膜模型计算菲涅耳系数或局域场系数，并结合实验结果进行验证3,9,10,11,12,13,14,15,30。

基于上述背景，可以研究一些聚合物与生物界面，以从分子层面理解其基本科学问题。以下以三个界面问题为例：探测聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）（PHEMA）表面及其与基底的埋藏界面9、丝素蛋白（SF）在聚苯乙烯（PS）表面形成二级结构的过程，以及水分子围绕模型短链寡核苷酸双螺旋的结构16,21，说明和频振动光谱（SFG）如何帮助揭示与基础科学相关的界面分子级结构。

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方案

1. SFG 实验

  1. 使用商用皮秒和频生成（SFG）系统（材料表），该系统基于 Nd:YAG 激光器，提供脉宽约为 20 ps、频率为 50 Hz 的 1064 nm 基频光束。
  2. 利用二次和三次谐波模块将 1064 nm 基频光束分别转换为 532 nm 光束和 355 nm 光束。将 532 nm 光束直接引导作为可见光输入光束，并通过光参量产生（OPG）/光参量放大（OPA）/差频产生（DFG）过程生成另一束覆盖 1000 至 4000 cm-1 频率范围的中红外（IR）输入光束。
  3. 将两束输入光的入射角分别设置为 53°（红外光）和 64°（可见光），相对于表面法线方向。
  4. 为检测聚合物界面结构（包括薄膜/基底界面或薄膜/其他介质界面），采用 ssp（和频信号为 s 偏振，可见光为 s 偏振，红外光为 p 偏振）和 ppp 偏振组合。
  5. 为检测界面蛋白质二级结构及 DNA 周围的水结构，除 ssp 和 ppp 外，还需采用手性敏感的 spp 和 psp 偏振组合。
  6. 为确保样品不受损伤，将红外光和可见光的脉冲能量分别控制在约 70 和约 30 μJ。带有能级图的 SFG 过程示意图见图 1。图 2展示了我们在洁净室中的 SFG 系统。

2. 菲涅耳系数

  1. 使用直角棱镜作为本研究中所有实验的基底。聚合物薄膜在固体基底上存在两个界面，即聚合物与空气接触的表面以及聚合物与基底之间的界面。由于这两个界面均破坏了反演对称性，因此均可产生和频振动（SFG）信号。因此，所采集的SFG谱图是一种干涉谱。然而，通过逐个或同时调节入射角或薄膜厚度，可以调节这两个界面处的局域电场系数或菲涅耳系数。31,32这使我们能够仅从单一界面探测SFG振动信号。此处，CaF₂基底上的PHEMA薄膜2 以 Prism 为例9.
  2. 如图所示 图3，采用直角棱镜构型检测从底部PHEMA薄膜产生的SFG信号。反射模式下的SFG输出强度表示为
    figure-protocol-1 (1)
    其中  figure-protocol-2 表示有效二阶非线性电极化率张量。
    figure-protocol-3 由三部分组成，即棱镜/聚合物界面、聚合物/底层介质界面（底层介质包括气体、液体或固体）以及非共振背景，如以下方程所示。
    figure-protocol-4 (2)
    ​此处的下层介质可以是空气、水或其他物质。 F 表示负责局域场校正的相应菲涅耳系数。
  3. 在此情况下，应用薄膜模型计算菲涅耳系数。此处仅给出简要的计算步骤。
    1. 对于棱镜/聚合物界面，使用
      figure-protocol-5  (3)
      figure-protocol-6  (4)
      figure-protocol-7  (5)
      各参数的含义如下所示。
      1. ωi 表示光束频率。
      2. tp 和 ts 表示总透射系数，可表示为
        figure-protocol-8  (6)
        figure-protocol-9  (7)
      3. tp12 和 ts12 表示光束在棱镜/聚合物界面的线性透射系数。
      4. rp23 和 rs23 表示光束在聚合物/介质界面处的线性反射系数。
      5. α 表示反射光束与其二次反射光束之间的相位差 反射的 光束在穿过聚合物薄膜后反射回来的光束，可表示为
        figure-protocol-10  (8)
      6. λ 表示光束的波长 d 是聚合物薄膜的厚度。
      7. Φ1 和 Φ2 分别表示棱镜/聚合物界面和聚合物/介质界面的入射角。
      8. n1 和 n2 分别表示棱镜和聚合物薄膜的折射率。
      9. n12 表示 棱镜/聚合物界面聚合物层的折射率
    2. 对于聚合物/介质界面，使用
      figure-protocol-11  (9)
      figure-protocol-12  (10)
      figure-protocol-13  (11)
      1. Δ 表示两个界面处光电信号的相位差。
      2. 由于输入光束的脉冲宽度约为 20 ps，由色散效应引起的时间延迟误差可以忽略不计。
      3. 输出SFG、输入可见光和输入红外光束的这种相位差表达式可分别写为
        figure-protocol-14  (12)
        figure-protocol-15  (13)
        figure-protocol-16  (14)
         
  4. 由上述讨论可知，对于棱镜-聚合物薄膜-介质（1-2-3）系统，棱镜/聚合物和聚合物/介质界面的总菲涅耳系数可表示为以下公式： ssp 和 ppp 偏振组合。当然，两个界面均被视为方位角各向同性。
    1. 对于棱镜/聚合物界面，两种情况的总菲涅耳系数表达式为 ssp 和 ppp 偏振组合的表示方式如下。
      1.  对于 ssp，该方程为
        figure-protocol-17(15)
      2. 而对于 ppp，该方程为 
        figure-protocol-18 (16)
        figure-protocol-19  (17) 
        figure-protocol-20 (18)
        figure-protocol-21  (19)
         
      3. t10 和 t01 分别表示空气/棱镜和棱镜/空气界面的线性透射系数。
    2. 对于聚合物/介质界面，总菲涅耳系数的表达式适用于两者 ssp 和 ppp 偏振组合描述如下。
      1. 对于 ssp，该方程为
        figure-protocol-22  (20)
      2. 对于 ppp，方程为 
        figure-protocol-23 (21) 
        figure-protocol-24 (22) 
        figure-protocol-25 (23) 
        figure-protocol-26 (24)
           
         
  5. 利用夹层模型计算菲涅耳系数后，将其绘制为薄膜厚度的函数，如图所示 图4.
    注意：在此情况下，存在一个用于采集 CaF 表面和频产生（SFG）信号的厚度范围。2 棱镜/PHEMA 界面的贡献可忽略不计，该界面距离约为 150 nm。类似地，可选择合适的厚度以检测 PHEMA/底层介质界面，此时 CaF₂ 的贡献可忽略不计2 prism/PHEMA 界面

3. 手性和频生成偏振组合

  1. 对于普通的非手性界面，通常使用 C∞v 系综平均意义上的对称性33,34. 通过操作 由于缺乏反演对称性，可推导出非零的二阶非线性电极化率张量分量，这些分量为 cxxz，cxzx，czxx，cyyz，cyzy，czyy 和 czzz （如果假设界面是各向同性的，即x和y方向相同，则现有项可进一步简化）。然而，对于手性界面，情况将有所不同。手性界面具有C∞ 对称性，仅允许旋转对称操作。在这种情况下，除了正常的非手性项外，还将出现更多非零的二阶非线性 susceptibilities，这些可称为手性项，即 czyx，czxy 和 cyzx 在不考虑电子共振的情况下。因此，通过使用 psp, pps 和 种（spp） 偏振组合，可采集手性SFG光谱33,34.

4. 样品制备

  1. PHEMA薄膜的制备
    1. 溶解PHEMA粉末（参见 材料清单) 分别溶于无水乙醇中，配制质量分数为 2 wt% 和 4 wt% 的溶液。
    2. 在沉积 PHEMA 薄膜之前，将 CaF₂ 晶片浸泡于去离子水中 5 分钟，以确保表面充分润湿。2 先将直角棱镜置于甲苯溶剂中，随后用乙醇和超纯水（18.2 MΩ）冲洗Ω·cm
    3. 随后，将基底（CaF₂）暴露于2 直角棱镜）置于氧等离子体中，通过等离子清洗机去除可能的有机污染物（参见 材料表).
      1. 首先打开等离子清洗仪，将基底放入其中。
      2. 然后打开真空泵对清洁器进行抽真空处理，再向其中通入氧气。
      3. 最后设定 4 分钟进行清洗。之后，将清洁后的基底保存，用于后续的 PHEMA 薄膜制备。
      4. 然后在CaF上制备PHEMA薄膜2 通过旋涂仪涂覆棱镜（参见 材料清单通过调节溶液浓度和旋涂速度来调整薄膜厚度。
        1. 固定 CaF2 旋涂机吸盘上的棱镜
        2. 将之前制备的PHEMA溶液在洁净基底上滴加一滴，以1,500 rpm转速旋涂1分钟（薄膜厚度：2 wt%对应100 nm，4 wt%对应200 nm）。
      5. 将所有制备好的PHEMA薄膜置于真空烘箱中退火 80 °C 过夜。
  2. 丝素蛋白（SF）的制备
    ​注意：Kaplan 等人建议的实验方案35 被采用。
    1. 将7.5 g蚕茧置于 B. mori 在煮沸的碳酸钠（Na2CO3，0.02 M）水溶液（3 L）中处理 30 分钟。将纤维状丝素蛋白转移至洁净容器中。
    2. 在搅拌条件下，用去离子水洗涤所得的丝素纤维三次，以去除丝胶蛋白分子，仅保留纤维样品中的丝素蛋白分子。
    3. 在真空烘箱中干燥纤维状 SF 样品 60 °C 过夜。
    4. 随后，将脱胶后的丝素蛋白纤维样品溶解于溴化锂（LiBr，9.3 M）水溶液中（1 g样品溶于  SF 溶于约 4 mL 的 LiBr 溶液中，并在 60 °C 搅拌条件下反应2 h。
    5. 将丝素蛋白（SF）溶液置于去离子水中透析（使用3,500 Da透析袋），持续3天以去除溶解的LiBr。每天更换新鲜去离子水三次。最后将处理后的SF溶液保存于 4 °C 用于后续的SFG实验。
  3. 短链寡核苷酸双链的制备
    1. 向商业公司订购3’端经胆固醇-三乙二醇（Chol-TEG）修饰的单链寡核苷酸样品（5’-GCTTCCGAAGGTCGA-3’）（参见 材料列表）以及其互补链。将每条单链的10 nmol样品粉末分别溶于0.5 mL超纯水中，然后将两者混合，得到双链寡核苷酸溶液（10 nmol/mL）。
    2. 将2 mg的1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPPC）与2 mg的氘代DPPC（d-DPPC）混合，溶于1 mL氯仿中，制备脂质溶液。
    3. DPPC的制备 & 二棕榈酰磷脂酰胆碱（d-DPPC）单分子层通过朗缪尔-布洛杰特（Langmuir−Blodgett, LB）槽制备
      1. 将直角氟化钙（CaF₂）2 将棱镜固定到自制样品台上，使棱镜的一个面垂直浸入LB槽的水相环境中。
      2. 随后，将之前配制的混合脂质溶液注入水面上，直至表面压力达到低于34 mN的某一特定值·m−1.
      3. 当表面压力趋于稳定后，使用两片聚四氟乙烯屏障以5 mm/min的速率压缩脂质单层，直至表面压力达到34 mN·m−1 达到。
      4. 以1 mm/min的垂直速率将带有脂单层的棱镜从水中提起。
    4. 其他脂质单层的制备
      1. 为促进双链寡核苷酸与脂质分子通过疏水相互作用（胆固醇与脂质烷基链）组装，将双链寡核苷酸溶液与脂质溶液按1:100（寡核苷酸:脂质）的摩尔比混合。
      2. 将混合脂质与双链寡核苷酸溶液注入自制聚四氟乙烯容器的水面上，直至表面压力达到34 mN·m−1 达到。
    5. 最后，将位于棱镜底部的脂单层与水面上含有插入双链寡核苷酸的脂单层接触，形成用于和频光谱测量的最终样品。
  4. 洛伦兹方程
    1. 使用洛伦兹方程拟合SFG光谱，以提取分子的振动信息 特异的 振动模式
      figure-protocol-27  (25)
      其中 figure-protocol-28 表示强度的 qth 振动模式， figure-protocol-29 表示共振频率， figure-protocol-30 表示半高全宽的一半（HWHM）以及 figure-protocol-31 表示入射红外光束的扫描频率。

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结果

在协议部分的菲涅耳系数内容中，我们已经表明，从理论上讲，可以实现仅在某一时刻选择性地检测单一界面。在此，通过实验我们证实了该方法基本正确，如图5和图6所示。 

图5展示了水侵入后埋藏界面处约150 nm厚PHEMA水凝胶薄膜的结构，图6展示了水中表面处约430 nm厚PHEMA水凝胶薄膜的结构。两个图中的图A和图B分别对应CH和CO谱段。在埋藏界面处，所有观察到的振动峰均尖锐且清晰。其原因是CaF2基底表面光滑，且PHEMA分子无法渗入，从而形成了清晰的CaF2/PHEMA界面。然而，在表面处，由于水分子可与PHEMA相互作用并扩散至其本体内部，PHEMA/水界面不如埋藏界面清晰。因此，这两个界面呈现出不同的光谱特征。

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讨论

为了从分子层面研究结构信息，和频光谱（SFG）具有其固有的优势（即对单层或亚单层的高灵敏度以及对界面的选择性），可用于研究多种界面，如固/固、固/液、固/气、液/气和液/液界面。尽管设备维护和光学对准仍较为耗时，但其所带来的回报是显著的，因为可以获得表面和界面处详细的分子水平信息。

溶液中聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）表面与埋藏界面的研究：如上所述，光场系数可以进行调节。我们可以通过实验验证这一点。在与基底的埋藏界面处，由于氟化钙（CaF2）基底表面光滑且无法被PHEMA分子渗透，该界面非常清晰。然而，在与水接触的表面界面处，水分子能够与PHEMA分子相互作用并扩散至其本体内部，因此该界面较为模糊，不如埋藏界面清晰。因此，这两个界面会呈现出不同的和频振动光谱（SFG）谱图特征。我们的实验SFG数据确实证实了这一点，表明该技术具备选择性探测埋藏界面（与基底之间）或溶液中表面界面的能力。

链间相互作用或限域效应对丝素蛋白二级结构形成的影响：一个关键因素是临界重叠浓度（C*）。...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

本研究得到国家重点基础研究发展计划（2017YFA0700500）和国家自然科学基金（21574020）的支持。同时感谢中央高校基本科研业务费专项资金、江苏省高校优势学科建设工程（PAPD）项目以及国家级生物医学工程实验教学示范中心（东南大学）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPPC） Avanti Polar Lipids, Inc.850355P-1g
无水乙醇国药集团化学试剂有限公司100092680≥99.7%
CaF2 棱镜成都雅诗光电有限公司
无水氯化钙国药集团化学试剂有限公司10005817≥96.0%
氘代DPPC（d-DPPC）Avanti Polar Lipids, Inc.860345P-100mg
电磁炉浙江苏泊尔有限公司C21-SDHCB37
朗缪尔-布洛杰特槽（Langmuir-Blodgett, LB）KSV NIMA Co., Ltd.KN 2003
无水溴化锂国药集团化学试剂有限公司20056926
Milli-Q 综合系统默克密理博超纯水
等离子清洗机成都明恒科技&有限公司PDC-MG氧气等离子清洗
聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）（PHEMA）Sigma-Aldrich 公司192066 安全数据表Mw = 300 000
聚苯乙烯Sigma-Aldrich 公司330345 MSDSMw = 48 kDa，Mn = 47 kDa
蚕茧来自家蚕（Bombyx mori）
单条寡核苷酸互补链南京金斯瑞生物科技有限公司H035965'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
单链寡核苷酸南京金斯瑞生物科技有限公司H04936 3¢-末端由胆固醇-三乙二醇（Chol-TEG）（5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
无水碳酸钠国药集团化学试剂有限公司10019260≥99.8%
旋涂仪中国科学院微电子研究所KW-4A用于聚合物薄膜的制备 
台阶轮廓仪VeecoDEKTAK 150用于薄膜厚度的测量
和频产生（SFG）振动光谱系统EKSPLA商用飞秒SFG系统

参考文献

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通过和频产生振动光谱揭示聚合物与生物大分子的界面分子级结构
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