CRISPR/sgRNA 文库已应用于研究蛋白质编码基因。然而，sgRNA 文库在揭示 CTCF 边界在基因调控中功能方面的可行性仍尚未探索。本文中，我们描述了一种针对 HOX 位点的特异性 sgRNA 文库，以阐明 CTCF 边界在 HOX 位点中的功能。
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本文内容
摘要
摘要
CCCTC结合因子（CTCF）介导的稳定拓扑关联结构域（TADs）在限制位于相邻TADs内DNA元件之间相互作用方面发挥关键作用。CTCF在调控控制胚胎发育、体轴模式形成、造血以及白血病发生的HOX基因时空表达中具有重要作用。然而，目前尚不清楚与HOX基因座相关的CTCF边界是否以及如何调控染色质结构和HOX基因的表达。在本实验方案中，构建了一个特异性的sgRNA文库，靶向HOXA/B/C/D基因座中的所有CTCF结合位点，以研究破坏CTCF相关染色质边界对TAD形成和HOX基因表达的影响。通过CRISPR-Cas9遗传筛选，发现位于HOXA7/HOXA9基因之间的CTCF结合位点（CBS7/9）是致癌性染色质结构域的关键调控元件，同时在维持MLL重排的急性髓系白血病（AML）中异常的HOX基因表达模式方面也具有重要作用。因此，该sgRNA文库筛选方法为研究CTCF介导的特定基因座基因组结构组织提供了新的见解，并为在人类基因组计划完成后的时代，对编码和非编码的注释遗传调控元件在正常生物学过程中的功能特征分析奠定了基础。
引言
近期的基因组互作研究表明，人类细胞核基因组会形成稳定的拓扑关联结构域（TADs），这些结构域在不同细胞类型和物种间具有保守性。基因组被组织成独立的结构域，有助于促进并限制调控元件（如增强子和启动子）之间的相互作用。CCCTC结合因子（CTCF）结合于TAD边界，在限制相邻TAD内DNA元件之间相互作用方面发挥关键作用1。然而，全基因组范围的CTCF结合数据表明，尽管CTCF在不同细胞类型中主要结合相同的DNA位点，但它往往仅在某一种细胞类型中的特定位点发挥染色质屏障功能，而在其他细胞类型中则无此功能，提示CTCF在染色质边界形成过程中需与其他因子协同作用2。目前尚不清楚的是，边界元件（即CTCF结合位点）是否直接与CTCF的生物学功能相关，以及这些关联是如何建立的。因此，我们提出假设：基因组中特定的CTCF结合位点可直接调控TAD的形成，并控制这些结构域内部或相邻结构域之间启动子与增强子的相互作用。人类和小鼠基因组测序项目的完成以及后续的表观遗传学分析，揭示了基因组新的分子与遗传特征。然而，这些特定特征或修饰在基因调控和细胞功能中的作用及其分子机制仍有待全面阐明。
多项证据表明，CTCF介导的拓扑关联结构域（TADs）代表了功能性的染色质结构域3,4,
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方案
1. 使用在线工具设计CTCF sgRNA文库
- 使用基因扰动平台（GPP）设计工具（https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design），设计靶向人类HOX基因座中CTCF结合位点的sgRNA。
- 共合成1,070条sgRNA，包括靶向303个随机基因的sgRNA、60条阳性对照、500条非人类靶向对照，以及207条靶向CTCF元件或lncRNA基因的sgRNA（图1，表1）。每个靶向DNA元件由5–10条不同的sgRNA进行靶向。
2. sgRNA 文库克隆
- 将合成的寡核苷酸克隆至CRISPR慢病毒骨架载体（lentiCRISPRv2）中。
- 用BsmBI限制性内切酶在37 °C下消化LentiCRISPRv2载体，持续2小时。
- BsmBI消化后，在琼脂糖凝胶上观察较大条带（约12,873 bp），然后使用凝胶回收试剂盒进行纯化。
注意：消化后凝胶上还会出现一个约2 kb的小片段，应忽略该片段。 - 将合成的寡核苷酸与经消化的Lent....
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结果
CRISPR-Cas9 技术是一种用于功能基因组学研究的强大研究工具，正在迅速取代传统的基因编辑技术，在全基因组范围和单个基因靶向应用中均具有高度实用性。此处介绍的首个 individually cloned loci-specific CRISPR-Cas9-arrayed sgRNA 文库包含 1,070 条 sgRNA，由靶向 303 个随机选择基因的 sgRNA、60 条阳性对照、500 条非人源靶向对照以及 207 条靶向 CTCF 元件或 lncRNA 基因的 sgRNA 组成，共分装于四个 HOX 位点（图1, 表1。该文库靶向所有CTCF核心结合基序， HOX 基因相关的长链非编码RNA、已知的调控元件以及若干 HOX 基因作为阳性对照在 HOX 位点。它还包含靶向随机非HOX 基因、非人类基因及基因间区域作为阴性对照。为提高通过lentiCRISPR转导实现CTCF位点敲除.......
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讨论
与蛋白质编码基因相关的sgRNA文库已应用于功能筛选系统，通过sgRNA富集来鉴定调控特定细胞功能的基因及网络24,25,26,27,28。多个与非编码区相关的sgRNA文库也已用于基因特异性功能筛选，以研究远端和近端调控元件，包括BCL11A、Tdgf1a以及药物抗性调控基因28,29,30。这些sgRNA文库均通过详细的生物信息学设计、寡核苷酸合成，并将寡核苷酸池亚克隆至载体中构建而成。全基因组范围的筛选方法功能强大且用途广泛，但需要具备基因组范围sgRNA设计的计算专业知识，以及持续的资金.......
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披露
我们声明本报告无任何利益冲突。
致谢
作者还感谢 Nicholas Cesari 对手稿的编辑。本工作由美国国立卫生研究院资助（S.H.，项目编号 R01DK110108、R01CA204044）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Lipofectamine 3000 试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 蛋白酶K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 细胞 | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy 载体系统 | Promega | A137A | |
| T4 连接酶 | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒 | QIAGEN | 28706 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green 一步法试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN 质粒大提试剂盒 | QIAGEN | 12163 | |
| DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| 青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺 | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X 浓缩试剂 | Clontech | 631232 | |
| 台盼蓝溶液 | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| 聚凝胺 | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE 缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® 突变检测试剂盒 | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Bio-Rad Universal Hood II 凝胶成像系统 | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R 离心机 | Eppendorf | 5404000138 | |
| 数字干浴器/金属浴加热器 | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX 系列超低温冰箱 | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 培养箱 | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS 二级生物安全柜 | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF 离心机系列 | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ 水浴锅 | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus 架盒系统 | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统 | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ 梯度 PCR 仪 | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 紧凑型电泳电源 | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 微型凝胶电泳系统 | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® 试管旋转混合仪及旋转器 | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® 恒温小型摇床 | VWR International | 12620-942 | |
| 分析天平 MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX 和 DS-11 FX+ 分光光度计 | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
参考文献
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Cuddapah, S., et al. Global an....
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