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利用培养皿中的血-脑肿瘤屏障预测体内载荷递送效果

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DOI：

10.3791/59384

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2019年4月16日

 ,  , 
1Research Programs Unit, Translational Cancer Medicine Research Program, University of Helsinki, 2Wihuri Research Institute, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, 3Laboratory Animal Center, Helsinki Institute of Life Science (HiLIFE), University of Helsinki

本文内容

摘要

药物靶向中枢神经系统肿瘤是一项重大挑战。本文介绍了一种利用小鼠和/或人类细胞构建体外血脑肿瘤屏障模型的实验方案，并探讨了该模型在预测体内中枢神经系统肿瘤靶向性方面的相关性。

摘要

血脑屏障（BBB）具有高度选择性，在生理条件下对维持大脑稳态至关重要。然而，在脑肿瘤情况下，BBB的分子选择性也会阻碍外周给药的化疗药物递送，从而保护肿瘤细胞。开发靶向恶性脑肿瘤的新药（包括纳米颗粒）时，理想情况下需借助临床前动物模型来研究药物的跨细胞转运能力及其抗肿瘤效果。为了遵循“3R原则”（优化、减少和替代），减少实验中实验动物的使用数量，并实现大规模抗肿瘤药物库的高通量筛选，我们建立了一种可重复的体外人源和鼠源血脑肿瘤屏障（BBTB）模型，该模型采用内皮细胞、星形胶质细胞与患者来源的胶质母细胞瘤球体三层共培养系统。为了提高可扩展性和可重复性，本模型在特定条件下使用商业细胞系或永生化细胞，以形成类似于真实BBB的屏障结构。本文描述了一种通过在插入式培养小室上以特定细胞密度共培养内皮细胞与星形胶质细胞来构建BBTB模拟模型的实验方案。该BBTB模拟模型可用于定量分析和共聚焦成像纳米颗粒穿越内皮和星形胶质细胞屏障的过程，同时在同一实验体系中评估药物对肿瘤细胞的靶向性。此外，我们证明所获得的数据可用于预测纳米颗粒在临床前动物模型中的行为表现。从更广泛的角度来看，该体外模型还可适用于其他神经退行性疾病，用于评估新型治疗分子穿越血脑屏障的能力，或结合脑类器官以直接评价药物疗效。

引言

神经血管单元由神经元、星形胶质细胞以及血脑屏障（BBB）组成，后者由周细胞、星形胶质细胞、内皮细胞及其相关的基底膜之间复杂的连接共同构成脑微血管系统1。这种由连续性、无窗孔的血管形成的紧密细胞屏障，可精细调控离子和分子（包括激素、营养物质或药物）以及循环细胞的通过1。高分子量物质（如治疗性抗体、药物偶联物或纳米化合物）在血脑肿瘤屏障（BBTB）中的跨细胞转运显著受限，这极大地阻碍了包括恶性胶质瘤在内的神经系统疾病药物研发的进展2。事实上，口服或静脉给予的化疗药物往往只能以不足以产生抗肿瘤效应的低浓度到达脑实质，或者根本无法穿过BBTB到达肿瘤细胞3。一些临床前和临床研究并未解决BBTB穿透问题，而是尝试暂时性破坏BBTB，例如采用聚焦超声技术4,5，或通过药物原位直接递送以绕过该屏障6。然而，这些方法均未能有效遏制肿瘤不可避免的扩展或复发。因此，在开发新型抗胶质瘤疗法时，应将药物通过BBTB的扩散能力视为治疗剂成功递送的关键因素之一7。

由于血脑肿瘤屏障（BBTB）内细胞相互作用极为复杂，研究分子从血液进入大脑的过程时，对实验动物进行体内研究似乎是显而易见的选择。然而，大规模的体内方法建立起来相对复杂，因此难以在合理的时间和成本范围内实现对分子的高通量筛选。更为重要的是，动物实验必须遵循“3R”伦理准则，即：i）优化（refine），ii）减少（reduce），以及在当前背景下尤为相关的 iii）以替代性方案（如体外或计算机模拟方法）进行替代（replace）。因此，体外重建BBTB成为一个有趣且具有吸引力的选项，但这同时也是一项面临多种限制的复杂任务。已有大量研究尝试利用犬源、猪源、鼠源甚至人源的原代细胞或细胞系在体外重建这一复杂结构（如Rahman等8和Helms等9所综述）。这些模型包括三维微流控系统10、芯片上的血脑屏障（BBB-on-a-chip）11,12，以及基于经典Transwell共培养系统的多种变体。然而，目前的微流控和芯片系统要么不适合快速、高通量的药物验证研究13,14，要么目前尚无法兼容针对脑肿瘤药物递送的研究。此外，对155种已发表模型的回顾显示，这些模型使用原代细胞、诱导性多能干细胞（iPSC）或商业细胞系，并均在Transwell系统中进行共培养，但其测量结果和/或结论存在显著的实验室间差异趋势8。这种实验室间重复性差的现象可能与以下因素相关：i）培养条件未标准化，例如是否选择性地在细胞培养容器中包被基底膜基质蛋白；ii）过度传代以及使用含血清培养基，这两者均为细胞系遗传和表型改变的主要驱动因素15；或iii）在培养皿中难以可重复地重建星形胶质细胞与内皮细胞组分之间的恰当平衡。尽管使用永生化细胞或商业细胞系建立的体外BBB模型在某些特性上不如仅使用原代细胞的模型，但在本研究所述方法中，我们证明了特定的细胞组合在功能表现上与已发表的其他参考模型具有高度可比性16,17。最终，由于目前缺乏一种稳定且可重复的模型用于研究治疗性化合物通过BBTB向脑肿瘤递送的过程，促使我们开发了本文所述的方法。

由于该模型的目标是用于预测纳米颗粒在临床前动物模型中的体内递送效果，我们首先利用含有与小鼠星形胶质细胞接触的小鼠内皮细胞的插入式培养装置对BBTB模型进行了验证。此外，我们还优化了该模型以使用某些人源细胞系。待细胞屏障稳定后，将其转移至含有患者来源的胶质母细胞瘤球体或商品化胶质瘤细胞系的培养体系中。随后，可通过共聚焦显微镜观察纳米颗粒的跨细胞转运及对肿瘤细胞的靶向作用，并通过随时间收集样本进行定量分析。重要的是，使用BBTB模拟模型获得的结果能够可靠地预测纳米颗粒在体内的行为，支持在临床前验证之前应用BBTB模拟模型。

方案

动物实验已获得芬兰南部地区动物实验委员会（ESAVI/6285/04.10.07/2014）的批准。

1. 建立血脑肿瘤屏障模型

注意：细胞培养基及添加剂详见材料表。

  1. 星形胶质细胞的制备
    注意： 以下体积适用于10 cm的培养皿或T75细胞培养瓶。
    1. 在无菌细胞培养罩内，用 5 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）小心清洗培养的星形胶质细胞。使用真空泵轻轻弃去 PBS，加入 2 mL 细胞解离试剂，作用 5 分钟（37℃）。 °C，参见 材料表) 以分离细胞。在显微镜下观察细胞脱落情况。孵育时间不得超过5 min，以减少对细胞的应激影响。
    2. 向容器中加入 10 mL 无菌完全星形胶质细胞培养基（ABM+），以抑制细胞解离试剂的活性。使用无菌血清移液管将解离的细胞从容器转移至无菌 15 mL 离心管中。在室温（RT）下，以 250 rcf 离心 3 分钟（加速度：9 rcf/s，减速度：5 rcf/s）离心细胞悬液。
    3. 同时，准备插入物（参见 材料清单：使用无菌镊子，将插入物连同 脑 朝上图1A)置于无菌6孔板的盖子上（图1B). 在操作前需确认，将培养板倒置时不会触碰或移动插入物。
      注意： 插入物的正确放置可使星形胶质细胞悬液被困在膜与孔板底部之间。
    4. 离心后，小心弃去细胞悬液中的上清液；用1 mL ABM+培养基轻轻重悬管中的星形胶质细胞沉淀’s壁至最多5倍。避免过度吹打细胞，以减少对细胞造成的应激。计数细胞，并将细胞悬液密度调整至1.5 × 105 细胞中 400 µL ABM+/插入物
    5. 将细胞悬液置于插入物脑侧的中央’膜图1B）并使用无菌移液器吸头通过毛细作用小心地将其铺展。避免直接接触，因为膜特别脆弱。
    6. 将插入物的脑组织面朝上，把6孔板重新放回到插入物上。这样可确保细胞悬液被限制在膜与孔板实际底部之间（图1C）。避免细胞悬液中产生气泡，否则将影响星形胶质细胞在膜上的均匀分布。
    7. 将培养板和插入式培养皿（脑组织面向上）放入培养箱中（37℃） °C，含5% CO₂­2）以使细胞贴壁，贴壁时间至少为2 h（小鼠永生化星形胶质细胞）至最多6 h（人原代星形胶质细胞）。
      注意： 由于培养插件需倒置放置，无法在显微镜下观察细胞贴壁情况。因此，建议另设一个独立的常规细胞培养容器，并随时间推移在该容器中监测细胞贴壁状态。操作膜时必须格外小心，因为膜一旦受损，实验结果将不可靠。
    8. 孵育结束后，检查细胞悬液是否从接种区域泄漏到外部，若插入物存在泄漏，则将其丢弃。将6孔板恢复至常规放置位置，此时插入物的血液侧朝上（图1A）。每孔加入 2.6 mL ABM+。向每个插入物中加入 2.5 mL 完全星形胶质细胞培养基，并将培养板放入培养箱中（37 ℃） °C，含5% CO₂­2).
  2. 内皮细胞的制备
    注意： 对于小鼠脑微血管内皮细胞（bEND3），细胞必须达到100%汇合度，以确保在实验当天细胞间接触最大化，从而诱导紧密连接蛋白的最优表达。该要求不适用于人脐静脉内皮细胞（HuAR2T），因为这些细胞的紧密连接蛋白表达需要星形胶质细胞的存在。
    1. 按照星形胶质细胞的相同步骤（步骤 1.1.1 和 1.1.2）操作。离心后，小心弃去上清液；用 1 mL 完全内皮细胞培养基（EBM+）缓慢吹打重悬内皮细胞沉淀，使细胞悬浮于离心管中。’s 壁至原体积的5倍。避免过度吹打细胞，以减少对细胞的机械损伤。计数细胞，并将细胞悬液密度调整至 2 x 105 细胞置于不含血清（EBM-）和血管内皮生长因子A（VEGF-A）的内皮细胞培养基中，每插入孔使用2.5 mL。
    2. 取出含有插入式培养小室的培养板，小心弃去血液侧的培养基，加入2.5 mL内皮细胞悬液。将培养板放回培养箱（37℃） °5% CO₂ 条件下培养­2）并过夜孵育，使内皮细胞贴附于膜上。
    3. 次日，将3 mL预热的无血清星形胶质细胞培养基（ABM-）转移至每个孔中，以制备无菌6孔板。使用无菌镊子操作小室，在血管侧小心弃去内皮完全培养基，将小室转移至含有ABM-的新培养板中，并加入2.5 mL EBM-。
      注意： 使用EBM对于内皮屏障的建立至关重要（请参见讨论部分）。
    4. 将 inserts 留在培养箱中（37 ℃） °5% CO₂ 条件下培养­2) 置于最小物理干扰和温度变化条件下培养5天，以促进内皮基底膜的形成、星形胶质细胞与内皮细胞的接触，并最终形成血-脑肿瘤屏障（BBTB）模拟结构。在胶质瘤细胞培养物转移当天更换培养基（详见第1.4节）。
  3. BBTB模拟物通透性的测定（可选）
    figure-protocol-1
    1. 小分子量荧光染料荧光素钠（Na-Fl）随时间从血液侧向脑侧插入膜被动扩散，可根据以下公式计算通透性值：
      ​此处， dF良好 为在某一时间点测得的孔内荧光值减去细胞培养基的自发荧光值， dT 是时间，单位为秒， A 是屏障表面的面积，单位为平方厘米，以及 dF插入 即在相同时间点测得的插入膜中的荧光值减去培养基的自发荧光值。
    2. 收集 100 µL 从BBTB模型的血液侧和脑侧分别收集培养基，并将每份样品转移至单独的平底黑色96孔板中，用于后续荧光检测。使用空白培养基作为空白对照，以校正自发荧光。
    3. 每孔准备 2.5 mL 的 Na-Fl（50 µM) 在 EBM- 中。将 Na-Fl 溶液预热至 37 °C更换插入物血液侧的培养基，加入含Na-Fl的培养基。培养基更换完成后立即启动计时器。
    4. 仔细收集 100 µL 在5、30、60和120分钟时，从插件的血液侧和脑侧分别收集培养基，将每个样品转移至黑色96孔板的不同孔中。
    5. 因此，更换小室中收集的培养基，以维持两侧的体积平衡。每次取样后，将小室放回培养箱中，以尽量减少温度波动。
    6. 使用酶标仪，设置滤光片为480/560 nm（分别为激发波长和发射波长），对收集的样品进行荧光定量。
      注意： 荧光来自 脑 在5分钟时间点，侧向几乎无法检测到。与空白对照相比，数值较高表明插入物存在泄漏或损伤’s 膜或屏障；因此，应将这些区域从后续分析中排除。BBTB 的预期 Na-Fl 通透性值应在 10-5 至 10-6 厘米/秒 范围（表1).
  4. 胶质瘤细胞的制备
    注意： 尽管此处使用的是患者来源的胶质母细胞瘤球状体，但以下方案可轻松适用于贴壁生长的商业化胶质母细胞瘤细胞，例如 U-87MG。
    1. 可选步骤：如需进行免疫荧光成像，可将最多四片圆形无菌硼硅质玻璃盖玻片（ø 在6孔板中每孔加入0.9 cm，含2 mL聚-D-赖氨酸（0.01%）。室温孵育30分钟。
    2. 同时，使用无菌刻度移液管将肿瘤球从细胞培养容器小心转移至15 mL无菌离心管中。以250 rcf离心肿瘤球3分钟。
    3. 弃去上清液，用1 mL不含bFGF/EGF（GBM-）的胶质瘤细胞培养基轻轻重悬细胞球，并计数细胞。将细胞密度调整至约104 个/毫升（105 细胞/毫升）在GBM-
    4. 弃去多聚-D-赖氨酸溶液，用无菌 PBS 洗涤 3 次。每孔加入 3 mL 肿瘤类球体悬浮液接种，将含血脑屏障模拟物的插入式培养小室转移至肿瘤细胞悬浮液中。
    5. 37℃过夜孵育 °5% CO₂ 条件下培养­2）以使血液侧与脑肿瘤侧达到平衡。第二天，将血液侧的培养基更换为添加了目标分子/药物/纳米颗粒的EBM培养基。随后按前述部分所述方法在不同时间点收集样品进行直接定量。在特定时间点对细胞进行固定，用于荧光成像（详见  第2.1和2.2节

2. 胎盘屏障高分辨率共聚焦成像

注意：4% 多聚甲醛（PFA，pH 7.4，每份 BBTB 重复使用 6 mL）需始终用 PBS 新鲜配制，并置于冰上保存。

注意：多聚甲醛（PFA）具有致癌性。操作PFA时应佩戴腈类手套，并在化学通风橱中配制溶液。

  1. BBTB 内皮细胞中紧密连接蛋白的表达
    1. 用预冷的 PBS 清洗膜的两侧（每侧 3 次，每次 5 分钟，插入室加 2.5 mL，孔板加 3 mL）。弃去 PBS，分别向孔板和插入室中加入 3 mL 和 2.5 mL 预冷的 4% PFA。冰上孵育 10 分钟。弃去 PFA（按照所在机构’s 危险化学品处理）并在室温下用 PBS 洗涤 3 次（每小室 2.5 mL，每孔 3 mL）。
      注意： 固定后，样本可置于4℃保存于PBS中（插入式培养皿每片2.5 mL，每孔3 mL） °C，持续一周。
    2. 使用棉签擦拭小室插件的脑组织一侧以去除星形胶质细胞。用锋利的手术刀仔细地进行两次相互垂直的切割，将膜切成四个相等的部分，形成十字形。接着，将手术刀插入膜与小室壁连接处，同时用另一只手旋转小室，以分离出四个样本。使用精细镊子，小心地将每个样本转移至含有 200 µL 每孔加入 PBS，血面朝上放置于各孔中。
    3. 用含10%胎牛血清的PBS溶液封闭膜（室温下30分钟， 200 µL/well）。准备 1° 用于紧密连接蛋白免疫染色的抗体溶液（图1D)（闭锁连接蛋白-1、claudin-5；请参见 材料表) 在 200 µL 每孔加入封闭液。可选步骤：通过加入抗血小板内皮细胞黏附分子（PECAM1 或 CD31；详见下文）抗体来验证内皮细胞身份 材料列表) 加入每种紧密连接抗体溶液中。弃去封闭液，加入一抗孵育’ 4 ℃过夜 °C.
    4. 第二天，弃去一抗，并用缓冲液冲洗 200 µL PBS 洗涤（每次 5 分钟，共 3 次，室温）。加入相应物种特异的荧光标记二抗（1:500 稀释），孵育 200 µL/well，用封闭液稀释；请参阅 材料表室温下孵育 2 小时。
    5. 弃去二抗，用缓冲液冲洗 200 µL PBS（室温下每次5分钟，共3次）。移除PBS，使用终浓度为1的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液对细胞核进行复染 µg/mL，纯蒸馏 H2O (dH2O; 200 µL/well；请参见 材料表）。在室温下孵育 7 分钟。移除 DAPI，用 dH₂O 洗涤膜 3 次2O (200 µL/well).
    6. 放置一滴封片剂（参见 材料列表)置于玻璃显微镜载玻片上。使用精细镊子小心地将膜从孔中取出，并保持其方向性，去除多余的dH₂O2O，并将其置于封片剂液滴上。在膜上再加一滴封片剂，然后小心地用硼硅酸盐盖玻片覆盖，确保无气泡残留。将样品于4℃保存 °避光保存直至共聚焦显微镜观察。
      注意： 可将膜片置于24孔板中，脑组织面朝上，使用特异性星形胶质细胞抗体（如针对胶质纤维酸性蛋白[GFAP]的抗体）进行星形胶质细胞染色图1E).
  2. BBTB 荧光染色检测纳米颗粒转胞吞作用
    1. 进行活细胞溶酶体标记（例如，使用荧光探针[参见 材料表]). 分别用预热的EBM-将溶酶体荧光染料稀释至工作浓度50 nM（每insert 2.5 mL），或用预热的ABM-稀释至75 mM（每孔3 mL），用于内皮细胞和星形胶质细胞的溶酶体标记。将细胞在37℃孵育45 min °5% CO₂ 条件下培养­2）；然后用预冷的 PBS 洗涤 3 次（每插件 2.5 mL，每孔 3 mL）。
    2. 弃去 PBS，分别向孔板和插入式培养小室中加入 3 mL 和 2.5 mL 冰冷的 4% PFA。冰上孵育 10 分钟。弃去 PFA，用 PBS 在室温下清洗细胞 3 次（每次 2.5 mL/小室，3 mL/孔）。
      注意： 固定后，样品可置于 PBS 中保存（每插件 2.5 mL，每孔 3 mL），于 4 °C 一周。
    3. 移除 PBS，并使用终浓度为 1 µg/mL 在 dH₂O 中2O（1 mL/insert，1 mL/孔）。室温孵育 7 分钟。移除 DAPI，用 dH₂O 将膜洗涤 3 次2O（2.5 mL/insert，3 mL/孔）。
    4. 小心地切割膜，去除多余的 dH₂O2O，并将其置于一滴封片剂上（参见 材料表) 置于玻璃显微镜载玻片上。在膜的另一侧再滴加一滴封片剂，并小心地用硼硅酸盐盖玻片覆盖，避免产生气泡。将样品在 4℃ 条件下保存 °C，并避光保存直至进行共聚焦显微镜成像。
  3. 肿瘤细胞的荧光染色
    1. 使用精细镊子，将含有肿瘤球体的圆形盖玻片小心转移至盛有冰冻 PBS 的 24 孔板中。随后在预热的 GBM- 中，使用 75 nM 荧光溶酶体探针进行活细胞溶酶体标记200 µL/well）。将样品孵育 45 分钟，然后用预冷的 PBS 冲洗 3 次（200 µL/well).
    2. 弃去 PBS，加入 200 µL 每孔加入冰冻的PFA，冰上孵育10分钟。弃去PFA，用PBS在室温下清洗样本3次。
      注意： 固定后，样品可保存在 PBS 中（200 µL) 在 4 °C 一周。
    3. 移除 PBS，然后使用终浓度为 1 µg/mL 在 dH₂O 中2O (200 µL/well）。在室温下孵育7分钟。移除DAPI，用dH₂O将盖玻片洗涤3次2O (200 µL/well).
    4. 使用精细镊子取出盖玻片，除去多余的 dH₂O2O，并将其置于一滴封片剂上（参见 材料清单)置于玻璃显微镜载玻片上，避免混入气泡。将样品在4℃下保存 °C，并在共聚焦显微镜观察前避光保存。

3. 体内 比较研究

  1. 原位记录荧光素钠通过血脑屏障的扩散
    1. 准备 150 µL 50 nM Na-Fl 溶液在生理溶液中的配制。将溶液保持在 37 °C 通过静脉给药。
    2. 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合物麻醉小鼠（300 µL PBS 中含 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪）。待动物达到深麻醉状态后，将其置于加热垫上以维持体温。
      注意： 使用10周龄雌性Naval Medical Research Institute（NMRI）裸鼠免疫缺陷小鼠获得本研究中展示的数据 图2然而，本方案适用于免疫健全和免疫缺陷小鼠。麻醉/镇痛方法由科研人员’s discretion。然而，不建议使用吸入式麻醉（如异氟烷），因为它会显著增加血脑屏障（BBB）通透性18.
    3. 将小鼠置于立体定位仪上（参见 材料表）用精细剪刀对头皮进行纵向切口，随后使用精细镊子轻轻撕裂结缔组织，以暴露颅骨。使用精细微型钻头做环形运动，去除一部分颅骨 ø 从左侧或右侧顶骨钻取一块直径0.3 mm的圆形颅骨片。钻孔及移除颅骨片时须极度小心，避免损伤下方的脑膜组织和血管。
    4. 在暴露的组织上滴加一滴生理溶液。使用两把精细镊子，小心地去除脑膜组织以暴露大脑皮层。脑组织应始终避免直接接触空气。
      注意： 脑膜损伤引起的少量出血可使用止血海绵进行处理（详见 材料清单).
    5. 一旦去除脑膜组织并完全暴露大脑皮层，将一滴生理溶液截留在大脑皮层与 ø 0.5 mm 硼硅酸盐盖玻片。用一滴氰基丙烯酸酯胶水固定观察区域（详见 材料清单用针将胶水均匀涂布在盖玻片周围，静置干燥1分钟。
    6. 准备用于尾静脉注射的可植入导管（图 2A）。使用 Rochester-Ochsner 止血钳折断 25 G 针头的尖端，并将针尖插入一段 10 cm 长的 PE20 聚氨酯管中（请参见 材料表) (图2A).
    7. 将导管插入小鼠的侧尾静脉，使用鳄鱼钳夹持导管以进行操作和插入（请参见 材料清单) (图2B）。用一滴氰基丙烯酸酯胶固定插入的针头，待胶水干燥20秒后，移除血管夹。小心地将导管另一端连接至连接有含Na-Fl溶液注射器的25 G针头（图2B).
    8. 注意： 不要用止血钳夹住尾巴；止血钳仅用于精确操控导管。可通过观察透明导管内是否有血液回流来确认导管是否插入到位。
    9. 将动物置于体视显微镜下（参见 材料清单）。利用绿色通道（480 nm）中的低水平自发荧光，聚焦于包含较粗血管（由于血红蛋白在此波长下吸收光线而呈现较暗）和较细毛细血管的区域（图 2C开始延时成像前，先短暂采集一段时间的图像，以获取荧光染料注射前的背景荧光值。
      注意： 或者，可用T0时间点及任何其他预定时间点的静态图像替代延时录像。
    10. 以缓慢且持续的速度注射溶液，或 alternatively 使用自动输注系统。血液中检测到的 Na-Fl 荧光应保持稳定（血液半衰期：286 min），从而允许通过颅窗对血脑屏障扩散进行数分钟的记录。采集完成后，小心移除导管，并通过颈椎脱位处死动物。
  2. 体内血脑屏障通透性的测定
    注意： 数值可通过任意图像处理软件（如 ImageJ）获得，该软件可测量自定义感兴趣区域（ROI）内的荧光信号强度。
    1. 使用注释工具，在脑组织中血管外绘制一个矩形区域作为感兴趣区域（ROI），位置大约在 5 µm 记录与任何可见的Na-Fl填充血管的距离。记录该ROI的尺寸以及T0时在该ROI内测得的荧光强度，该值将用作组织的空白对照。’s 自发荧光。在不移动 ROI 的情况下，快进至注射后的某个时间点（例如，当全部溶液已注入动物体内时的最后一个记录帧），记录 ROI 内测得的精确时间和荧光值图 2C).
    2. 将 ROI 移动到可见的血管上（图2C）并记录血液中T0时的自发荧光值。保持ROI位置不变，快进至步骤3.2.1中定义的相同时间点，记录在ROI内测得的荧光值（图2C).
      figure-protocol-2
    3. 使用以下公式（改编自第1.3节）计算血脑屏障通透性：
    4. 此处， dF脑 是脑组织中荧光强度值减去 T0 空白值的结果， dT 是采集时间点（单位：秒），A 是近似的血管表面积，取为感兴趣区域（ROI）的面积（单位：平方厘米），以及 dF血液 为血液中荧光强度值减去 T0 空白值。
      注意：血脑屏障（BBB）的预期通透性值应在10-6 厘米/秒范围（表1).
  3. 小鼠脑组织中荧光纳米颗粒检测的组织处理方法
    1. 移植患者来源的胶质母细胞瘤球体（5 × 104 细胞中 5 µL 在麻醉的6周龄雌性NMRI裸鼠的胼胝体中注射2 μL细胞悬液（每微升含10万个细胞，溶于无菌PBS）。从颅骨前囟（Bregma）开始，通过以下立体定位坐标确定该脑区位置：前后方向+0.5 mm，左右方向+2.5 mm，背腹方向+3 mm。让脑肿瘤生长2周。
    2. 静脉注射纳米颗粒（100 µg 在 100 µL 无菌生理溶液）并使其循环8小时。通过静脉注射向对照小鼠注射 100 µL 无菌生理溶液
    3. 通过颈椎脱位处死小鼠，并迅速取出脑组织，置于干冰冷却的异戊烷中快速冷冻（-50℃下1分钟） °C). 将脑组织于 -80 保存 °C，直至进行组织处理。
    4. 使用冷冻切片机切割脑组织冠状切片。根据植入物在皮层上形成的瘢痕定位颅内植入部位，并进行切割 9 µm- 将该区域的厚切片置于相应的显微镜载玻片上（参见 材料表).
    5. 将固定在载玻片上的脑切片浸入预冷的 PBS 中（冰上，2 次，每次 5 分钟），随后在预冷的 4% 多聚甲醛（PFA）中固定（5 分钟）。在室温下用 PBS 洗涤载玻片（3 次，每次 5 分钟）。将载玻片水平放置，用移液器将含 10% 胎牛血清（FBS）的 PBS 封闭液滴加至组织切片上，完全覆盖组织表面（室温孵育 1 小时）。 500 µL/slide). 准备CD31抗体（请参考 材料清单) 在 250 µL 封闭液/载玻片。弃去封闭液，加入一抗，4℃孵育过夜 °在湿润的孵育盒中，37°C孵育。
    6. 第二天，将切片浸入PBS中（室温下每次5分钟，共3次），然后与相应的荧光素标记的二抗（1:500稀释于 250 µL PBS 中孵育 2 小时（室温）。在 PBS 中漂洗 3 次（室温），然后使用终浓度为 1 µg/mL 在 dH₂O 中2O (250 µL/slide). 将样品在室温下孵育 7 分钟。移除 DAPI 溶液，并用 dH₂O 洗涤载玻片 3 次。2O.
    7. 在每张组织切片上，加入一滴封片剂（请参见 材料清单) 并用盖玻片封片。避免产生气泡。将样品在 4 ℃ 下保存。 °C，并避光保存直至进行共聚焦显微镜观察。

结果

小鼠BBTB模型的共聚焦成像显示了bEND3细胞中紧密连接蛋白ZO-1（zonula occludens-1）和claudin-5的表达及细胞定位。与bEND3单层培养相比，内皮细胞与星形胶质细胞之间的接触明显诱导ZO-1和claudin-5向内皮细胞间连接处的重新分布图1D）。通过免疫荧光染色标记膜脑侧表达GFAP的星形胶质细胞，可观察并研究星形胶质细胞突起及其终足穿过膜与内皮细胞接触的情况（图1E）。已知星形胶质细胞与内皮细胞之间的接触可促进并稳定细胞屏障的紧密化，并与血脑屏障较低的通透性值相关。19. 与此一致，我们观察到小鼠血-脑肿瘤屏障模型对 Na-Fl 的通透性显著下降，从 27.63 降至± 3.45) × 10-6 cm/s，在单培养情况下为6.74（± 3.01) × 10-6 cm/s，当与低氧诱导因子敲除（HIFko）星形胶质细胞共培养时（表1）。永生化的HuAR2T细胞可形成高通透性的细胞屏障（104.92 ± 27.1 x 10-6 cm/s 表1）。与小鼠模型类似，我们测得BBTB对Na-Fl的通透性显著降低，即47.4（± 14.32) × 10-6 cm/s，当HuAR2T细胞与人原代星形胶质细胞共培养时（表1).

在小鼠和人类的BBTB模型中，与仅含内皮细胞-星形胶质细胞共培养体系相比，患者来源的胶质母细胞瘤球体的存在导致通透性数值略有升高（表1）。该现象在多个但并非全部患者来源胶质瘤球体模型中均可观察到，可能与部分患者来源细胞分泌的VEGF-A有关。

为比较体外BBTB模型与体内BBB的通透性值，我们通过植入裸鼠颅窗实时成像观察了Na-Fl的扩散情况。使用荧光体视显微镜，在系统注射探针前后及过程中，记录了源自主要软脑膜血管的毛细血管中Na-Fl从血管内的扩散过程。图2C随时间测量循环血液与脑皮层实质中差异性荧光值的变化，使我们能够计算裸鼠血脑屏障的近似通透性数值’s BBB 对于 Na-Fl（5.57 ± 2.19 × 10-6 cm/s, 表1).

为了说明该血脑肿瘤屏障（BBTB）模型如何用于可视化化合物从血液侧向脑侧的转运过程，我们比较了跨细胞转运的差异 ø 110 nm（NP110）和 ø 靶向患者来源的胶质母细胞瘤球体的350 nm（NP350）纳米颗粒。体外实验结果随后与体内转胞吞作用进行了比较。在本示例中，纳米颗粒表面包被了肿瘤靶向肽CooP20 并用荧光染料（FITC）标记以利于观察。我们在BBTB模型的血液侧加入FITC纳米颗粒后24小时，使用溶酶体染料对细胞进行标记，并用DAPI复染，随后在不同层面（如血液侧、膜层、脑侧以及患者来源的胶质母细胞瘤球体）采集共聚焦显微图像（图 3A）。NP110 相关的荧光信号在内皮细胞、星形胶质细胞和肿瘤细胞中与溶酶体共定位。此外，在内皮细胞和星形胶质细胞之间检测到 NP110s，其穿过插入物的膜孔。图 3A).

通过测量从血液和脑组织两侧收集的样品的荧光强度，定量分析NP110s的通透性。将这些通透性数值与纳米颗粒的相应测定值进行比较。 ø 350 nm（NP350）。结果表明，只有NP110能够穿过BBTB模拟物图3BNP350 保留在 BBTB 模型的血液侧，导致这些纳米颗粒的通透性值较低。

为了凸显BBTB模型相较于体内模型的相关性，将用肿瘤靶向肽CooP包被并偶联红色荧光染料（TRITC）的NP110或NP350纳米颗粒通过静脉注射到裸鼠体内进行检测。在多个时间点采集组织后发现，8小时后，能够穿透血脑屏障（BBB）的纳米颗粒已从血管渗出进入脑实质，而无法穿透的纳米颗粒则滞留在循环系统中，并主要被体内清除。因此，我们在注射后8小时采集了脑组织，并量化了每平方毫米脑组织中的纳米颗粒数量。与体外实验结果一致，只有NP110而非NP350成功渗入脑实质（图3C）。对纳米颗粒在脑内定位的高倍成像显示，NP110均匀分布在脑毛细血管外的脑实质中，并成功靶向至植入的胶质母细胞瘤细胞（图3D）。尽管具有相同的肿瘤靶向基团（CooP），NP350无法渗入脑实质，仅在脑血管管腔内被检测到（图3E），这与体外实验结果相似。

figure-results-1
图1：血脑肿瘤屏障（BBTB）模型的描述。 (A不同细胞类型位置的示意图。B) 示意图展示将插入式培养小室置于6孔板盖上的位置，以及在插入式培养小室的脑组织侧接种星形胶质细胞的技术’膜。C) 星形胶质细胞黏附用6孔板放置示意图。D) 紧密连接蛋白ZO-1（Zonula occludens-1，上排，红色）和claudin-5（下排，绿色）的免疫荧光显微图像。蛋白表达情况比较了单独培养于BBTB血液侧的鼠脑微血管内皮细胞（bEND3）单层培养（左列）与共培养鼠永生化HIFko星形胶质细胞（右列）的情况。细胞核用DAPI复染（蓝色）。E免疫荧光显微图像显示培养于血脑肿瘤屏障（BBTB）脑侧的HIFko星形胶质细胞中的胶质纤维酸性蛋白（GFAP，红色）。高倍镜图像显示星形胶质细胞的突起和终足（箭头）通过膜孔与内皮细胞接触（右图）。通过免疫荧光染色检测用于细胞永生化的猴病毒40大T抗原（SV40 large T，绿色）验证了HIFko星形胶质细胞的身份。内皮细胞不表达GFAP和SV40 large T，因此可通过膜对侧透明部分观察到仅被DAPI染色的细胞（虚线）。细胞核用DAPI复染（蓝色）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-2
图 2： 小鼠血脑屏障通透性的活体实时测定。 （A）可植入尾静脉导管的制备过程。（1）所需工具和设备如下：（a）PE20 聚乙烯管（b）两根 25 G 针头（c）Rochester-Ochsner 镊子，以及（d）小型鳄嘴钳。（2）使用镊子通过多次扭转移除一根 25 G 针头，并（3）小心地将其插入聚乙烯管中。（4）将管子的另一端连接至另一根 25 G 针头。（B）导管植入与定位操作示意图，用于通过小鼠尾静脉灌注荧光素钠溶液。图中圆圈区域表示滴加氰基丙烯酸酯胶水以固定导管的位置。使用鳄嘴钳辅助导管操作，在导管固定后将其移除。（C）代表性成像与定量方法，用于测定荧光素钠通透性数值。在灌注荧光素钠之前（左列），在脑区（上图，白色矩形）和血管区域（下图，红色矩形）设置感兴趣区域（ROI），测量自发荧光/空白值。在荧光素钠灌注期间（右列），同步测量两个 ROI 内的荧光强度，从而计算血脑屏障通透性。请点击此处查看该图的高清版本。

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图3：利用体外BBTB模型预测纳米颗粒通过血脑屏障的脑内转胞吞作用 (A) BBTB实验的图示及在小鼠BBTB模型不同水平获取的代表性共聚焦图像。将直径为110 nm、偶联FITC（绿色）的纳米颗粒（NP110）加入BBTB的血液侧。细胞用溶酶体探针（LT-99，红色）标记。  (1内皮细胞，2) 纳米颗粒通过膜孔（白色虚线）的内皮细胞转胞吞作用（3) 星形胶质细胞，以及 (4) 患者胶质母细胞瘤球体在图示及相应的共聚焦显微图像（右）中被识别。纳米颗粒的溶酶体包封（箭头）提示其通过血脑肿瘤屏障的内皮细胞层和星形胶质细胞层发生主动转胞作用。B) 体外定量测定所示纳米颗粒通过血脑肿瘤屏障（BBTB）的通透性n = 6). (C) 裸鼠尾静脉注射后8小时，脑组织切片中指定纳米颗粒密度的定量分析n = 3). (D) 共聚焦显微镜图像显示了分布情况 ø 110 nm 纳米颗粒（NP110，红色）在小鼠脑组织切片中与抗小鼠 CD31 抗体（绿色）共标。箭头指示纳米颗粒的转胞吞作用（左图）。由于颗粒表面展示的 CooP 靶向肽，纳米颗粒在脑肿瘤细胞周围（肿瘤，右图）富集。在正常脑组织（脑）中未观察到显著的靶向富集。E) 共聚焦显微镜图像显示了分布情况 ø 350 nm 纳米颗粒（NP350，红色）在经抗小鼠 CD31 抗体（绿色）标记的小鼠脑组织切片中的分布。箭头指示滞留在血管腔内的 NP350，其可能由于直径较 NP110 更大而无法穿越血脑屏障（BBB）。细胞核用 DAPI 复染呈蓝色。** P < 0.01. P使用双尾非参数Mann-Whitney U检验计算P值。误差线表示标准差。 请点击此处以查看此图的放大版本。

小鼠 BBTB 模型bEND3bEND3+HIFko AsbEND3+GBbEND3+HIFko As+GB体内
通透性 (10-6 cm/s)27.636.7426.810.835.57
标准差 (10-6 cm/s)3.453.017.992.652.19
人源 BBTB 模型HuAR2THuAR2T+hIAsHuAR2T+GBHuAR2T+hIAs+GB
通透性 (10-6 cm/s)104.9247.489.0848.24
标准差 (10-6 cm/s)27.114.3210.2113.07

表1：在指定的共培养系统中体外测定以及在NMRI裸鼠体内测定的荧光素钠（Na-Fl）通透性值（单位：厘米每秒）。 数据来自一次代表性实验（n = 3 只小鼠）。

讨论

患者间肿瘤异质性概念的兴起推动了个体化癌症治疗研究的发展21。这种异质性同样是中枢神经系统肿瘤的显著特征。由于肿瘤行为的不可预测性，化疗反应与血脑屏障（BBB）对药物递送的阻碍效应叠加，共同构成了临床治疗中的重大挑战22。为了开发更有效的治疗方法，通常需要对大量新分子库进行筛选。评估新型治疗候选物的抗肿瘤效果及其到达肿瘤部位的能力，最佳选择是在小鼠患者替身模型中开展基于患者来源细胞的体内临床前研究。然而，由于实际因素（经费、时间、人力和设施资源）以及伦理考量（使用实验动物时需遵循3R原则），建立大规模体内筛选平台往往难以实现，因此基于细胞的检测方法仍然是首选模型23。选择已建立的细胞系而非原代细胞的主要原因在于提高实验可重复性，并减少对实验动物的使用——后者是分离和建立原代小鼠细胞培养的主要来源。本文所介绍的方法严格遵循3R原则，可高效排除那些无法穿透模型血脑肿瘤屏障（BBTB）的纳米颗粒，从而避免其进入后续的临床前研究。作为原理验证，本文描述了在BBTB模型构建与验证过程中获得的研究结果。例如，在测量376 Da的荧光素钠被动扩散时，我们成功地在体内验证了体外实验结果。 

本文所述方案描述了在体外构建系统中，通过内皮细胞与星形胶质细胞共培养以形成类似血-脑肿瘤屏障（BBTB）界面的制备方法。当这两种细胞类型之间建立物理接触后，内皮细胞层表现出与血脑屏障（BBB）相似的特性（例如紧密连接蛋白在细胞表面的表达以及相对较低的通透性）。有趣的是，小鼠来源的BBTB模拟模型在Na-Fl通透性方面似乎与体内小鼠BBB通透性测量值非常接近24。因此，BBTB模拟模型的性能将直接取决于用于构建屏障的细胞选择。bEND3内皮细胞来源于脑组织，已知在与星形胶质细胞共培养时能够成功形成屏障25。然而，我们采用的是永生化的HIFko星形胶质细胞26来构建BBTB模拟模型。由于这些星形胶质细胞缺乏缺氧诱导因子，不会产生VEGF-A，而这对于本研究中所述BBTB模拟模型的稳定至关重要。星形胶质细胞已被确认为BBB通透性的调节因子，例如在神经炎症反应中通过释放VEGF-A发挥作用27。血管内皮生长因子受体（VEGFRs）的激活是体外28和体内29内皮/血管通透性的关键调控因子。因此，培养基中添加的VEGF-A会激活内皮细胞上的VEGFR2，从而诱导黏附连接蛋白（如VE-钙黏蛋白）发生磷酸化30。内皮细胞间连接的丧失会导致血管通透性显著升高。类似地，细胞培养实验中使用的胎牛血清具有强烈的促有丝分裂特性且其成分不明确，这也会对屏障的稳定性和实验的可重复性造成重大问题。

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）有时被用于体外构建血脑屏障（BBB）31；然而，它们在基因表达和屏障形成特性方面与脑微血管内皮细胞（如hCMEC/D3细胞系）32存在显著差异。尽管单独培养的HuAR2T细胞相比bEND3细胞表现出相对较高的通透性，但当其与人原代星形胶质细胞共培养时，通透性显著降低。虽然内皮细胞是形成细胞屏障所必需的，但显然星形胶质细胞在血脑肿瘤屏障（BBTB）的形成与稳定过程中同样发挥着至关重要的作用。

当将患者来源的胶质瘤细胞球体加入该体系后，小鼠血脑肿瘤屏障（BBTB）模型重现了某些小鼠异种移植瘤的特征，例如药物通过脑血管系统的扩散以及对肿瘤细胞的靶向作用。例如，在筛选多种不同直径的纳米颗粒时，本文所述的BBTB模型成功模拟了体内行为。为了说明体外模型与体内模型之间的对应关系，我们采用了先前描述的介孔硅酸盐纳米颗粒33 具有细胞穿透特性34 与肿瘤靶向肽CooP在其表面偶联20。CooP靶向肽通过特异性结合乳腺源性生长抑制因子（MDGI）靶向侵袭性肿瘤细胞。多种癌症（包括胶质瘤）中MDGI的表达水平均高于正常组织35，这使得CooP成为一种高效的肿瘤靶向部分，能够增强载荷的递送20此处使用的纳米颗粒此前已被证明可扩散至脑实质（27547955），当其用紫杉醇功能化后，这些纳米载体在临床前模型中已成功抑制胶质瘤的生长。36在纳米颗粒表面添加聚乙二醇（PEG）残基亦可使其静态电荷保持在正值（约 +4 mV），从而促进与神经血管单元的更好相互作用37 同时提高其在循环中的稳定性。在本研究的数据中，NP110s 被偶联了 3 kDa 的 PEG，而 NP350s 则包被了 10 kDa 的 PEG。然而，分子量更高的 PEG 也导致纳米颗粒直径显著增加，从而影响其穿越血脑屏障（BBB）的物理能力。因此，我们检测了颗粒的物理尺寸是否阻碍其通过血脑肿瘤屏障（BBTB），以及这些观察结果是否能在体内得到印证。

与先前已发表的观察结果一致，我们发现 NP110s 能够穿过体外血-脑肿瘤屏障（BBTB）以及颅内肿瘤小鼠的血-脑屏障（BBB），而 NP350s 则滞留在 BBTB 模型的管腔侧以及小鼠的血管内。这些相似的结果强烈表明，BBTB 模型能够预测纳米颗粒在体内穿越血-脑屏障并进入大脑的能力。 

血脑屏障（BBB）的细胞模型的相关性经常被讨论，即使在纳米颗粒中枢递送的研究中也是如此38。本文表明，通常被认为是最具相关性的原代星形胶质细胞和内皮细胞，可以被永生化细胞和/或商业可获得的细胞所替代，从而提高实验的可扩展性和可重复性。下一代体外血脑屏障模型可通过整合微流控装置来构建，从而形成结构上高度模拟真实血脑屏障的神经血管单元12,14。然而，由于递送过程的后续监测存在技术限制，这类模型目前尚不适用于胶质瘤靶向分子的高通量筛选14。在培养皿中准确再现血脑屏障的生理复杂性确实存在困难，某些已知由血脑屏障表达的受体或蛋白的缺失可能会影响结果的解释。另一个问题是体内与体外条件下基因表达存在显著差异，不同细胞系之间也存在较大变异，尤其是内皮细胞。然而，也有人指出，神经血管单元在脑内并非均一的结构实体39。生物学研究已进入一个更加注重人道的时代，在设计实验前，动物福利、伦理责任以及使用动物所涉及的成本始终被纳入考量。因此，为了推动动物实验的替代，越来越多的近期研究表明，充分认识模型的局限性，并谨慎选择用于构建屏障的细胞模型——特别是星形胶质细胞——能够使体外实验结果与动物模型结果之间具有良好的一致性40。通过本文所述的方法，我们在减少用于潜在治疗药物血脑屏障转胞吞筛选所需的实验动物数量方面又迈进了一步。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究获得了芬兰癌症组织、Jane & Aatos Erkko 基金会和Sigrid Juselius基金会（资助P.L.和V.L.J.）、瑞士国家科学基金会（高级博士后流动资助号：P300PB_164732，资助S.K.）、Orion研究基金会（资助S.K.）、Maud Kuistila纪念基金会（资助S.K.）以及芬兰科学院（TERVA 2017，资助号：314 498）的资助。特此感谢Biomedicum影像中心（赫尔辛基）提供显微成像核心设施。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞
bEND3ATCCCRL-2299培养条件：DMEM（1 g/L 葡萄糖）添加 10% FBS、5 mL L-谷氨酰胺和 5 mL 青霉素/链霉素
HIFko 永生化小鼠星形胶质细胞由 Gabriele Bergers 博士实验室分离https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6培养条件：BME-1 添加 5% FBS、5 mL 1 M HEPES、5 mL 100 mM 丙酮酸钠、3 g D-葡萄糖和 5 mL 青霉素/链霉素
HuAR2T由 Dagmar Wirth 博士实验室分离https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184培养条件：EBM-2 加 SupplementMix
正常人原代星形胶质细胞LonzaCC-2565培养条件：ABM 加 SingleQuots
材料与试剂
100 mm × 17 mm 培养皿，Nunclon DeltaThermoFisher Scientific150350
10 mL 血清移液管ThermoFisher Scientific170361
15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管ThermoFisher Scientific339650
ABM 基础培养基，500 mLLonzaCC-3187用于人原代星形胶质细胞。ABM+：包含补充剂混合物中的所有添加剂。ABM-：除 rhEGF 和 FBS 外的所有添加剂
Accutase 细胞解离溶液Corning25-058-CI
AGM SingleQuots 补充剂和生长因子LonzaCC-4123
B27 补充剂Gibco17504-044用于 GBM+ 和 GBM- 培养基
基础培养基伊格尔（Basal Medium Eagle）ThermoFisher Scientific21010046BME-1
Corning Costar TC 处理 6 孔板Sigma-AldrichCLS3506
Corning Transwell 聚酯膜细胞培养小室Sigma-AldrichCLS3452 
D-葡萄糖Sigma-AldrichG8270溶于 50 mL BME-1 中，过滤除菌后加入培养基
杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆 F-12 营养混合物（Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham）Gibco21331-020专用于本实验室分离的患者来源类球体培养，其他胶质瘤细胞系可能不同
EBM-2 生长培养基 SupplementMixPromoCellc-39216EBM+：包含补充剂混合物中的所有添加剂。EBM-：除 VEGF-A 和 FBS 外的所有添加剂
内皮基础培养基 2（EBM-2）PromoCellc-22211EBM+：包含补充剂混合物中的所有添加剂。EBM-：除 VEGF-A 和 FBS 外的所有添加剂
胎牛血清（FBS），经认证、热灭活、欧盟批准、南美来源ThermoFisher Scientific10500056
荧光素钠盐Sigma-AldrichF6377
Greiner CELLSTAR 96 孔板Sigma-AldrichGreiner 655090黑色聚苯乙烯平底孔（带 micro-clear 底部）
Menzel-Gläser 0.9 cm 圆形硼硅酸盐盖玻片Thermo Scientific10313573
PBS 片剂Medicago09-9400-100每升 dH2O 中加入一片，然后通过高压灭菌对溶液进行灭菌
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐Sigma-AldrichP6407 
重组人 EGFPeprotechGMP100-15用于 GBM+ 培养基
重组人碱性 FGF（154 个氨基酸）Peprotech100-18B用于 GBM+ 培养基
免疫荧光
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
24 mm × 60 mm 显微镜载玻片盖玻片ORSAtec0224601-D
AlexaFluor 488 和 594 二抗ThermoFisher Scientific稀释比例：1/500
抗 Claudin-5 抗体Abcamab15106稀释比例：1/150
抗 GFAP 抗体，克隆 GF5Abcamab10062稀释比例：1/150
抗小鼠 CD31 抗体，克隆 MEC 13.3BD Biosciences550274稀释比例 1/800
抗 SV40 T-抗原抗体Abcamab16879稀释比例：1/150
抗 Zonula Occludens-1 抗体Abcamab96587稀释比例：1/200
DAPITOCRIS5748
Fluoromount 水性封片介质 Sigma-AldrichF4680
LysoTracker Red DND-99ThermoFisher ScientificL7528
动物实验操作
10 cm 弯头解剖剪刀World Precision Instruments14394
BD Microlance 25 G 针头Becton Dickinson300600
精细镊子（12.5 cm）World Precision Instruments503283用于组织解离
Intramedic 聚乙烯导管 PE20Becton Dickinson427406
Ketaminol vet 50 mg/mLIntervetVnr511485氯胺酮
电动微型钻机World Precision Instruments503599
Menzel-Gläser 0.5 cm 圆形硼硅酸盐盖玻片Thermo Scientific11888372
微型血管夹World Precision Instruments14119
生理盐水溶液Mustela无菌单剂量小瓶 20 × 5 mL / 40 × 5 mL - 医疗器械类
Rochester-Oschner 镊子World Precision Instruments501709
Rompun vet 20 mg/mLIntervetVnr148999赛拉嗪
立体定位适配器World Precision Instruments502063
Sugi 海绵头Kettenbach31603
设备
Axio Zoom.V16 荧光体视变倍显微镜 Carl Zeiss
FLUOstar Omega 微孔板读数仪BMG Labtech
ORCA-Flash 4.0 数字 sCMOS 相机Hamamatsu Photonics
Universal 320 台式离心机 HettichCat. No. 1401
ZEISS LSM 880 配备 Airyscan 共聚焦显微镜Carl Zeiss

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