泛素化是一种翻译后修饰，在细胞过程中发挥重要作用，并受到去泛素化的严密调控。这两种反应的异常与人类疾病密切相关。我们提供了使用纯化组分在体外进行泛素化和去泛素化反应的实验方案。
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摘要
摘要
泛素化是一种翻译后修饰，在多种信号通路中发挥重要作用，尤其参与染色质功能和DNA相关过程的调控。该修饰过程涉及一系列酶的级联反应，包括E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶，并由去泛素化酶（DUBs）催化其逆向反应。泛素化可导致蛋白质降解或功能改变，包括调节酶活性、蛋白质-蛋白质相互作用以及亚细胞定位。证明蛋白质发生泛素化或去泛素化的关键步骤是使用纯化的组分进行体外反应。有效的泛素化和去泛素化反应可能受到所用组分、酶辅因子、缓冲体系以及底物性质的显著影响。 本文提供了进行泛素化和去泛素化反应的逐步操作方案。我们以小鼠多梳抑制复合物1（PRC1）的最小组分BMI1和RING1B为例，其中RING1B是一种E3泛素连接酶，可在组蛋白H2A的第119位赖氨酸上催化单泛素化。核小体上H2A的去泛素化反应则采用由人源去泛素化酶BAP1及其辅助因子ASXL2的DEUBiquitinase ADaptor（DEUBAD）结构域组成的最小多梳抑制去泛素化酶复合物（PR-DUB）来完成。这些泛素化/去泛素化检测可在两种体系中进行：一种是利用细菌表达纯化的蛋白重构的重组核小体，另一种是从小鼠哺乳动物细胞中纯化的天然核小体。我们强调了可能对这些反应产生重大影响的技术细节，并指出这些方案中的通用原则可快速适用于其他E3泛素连接酶和去泛素化酶的研究。
引言
泛素化是最保守的翻译后修饰之一，对包括酵母、植物和脊椎动物在内的多种生物体至关重要。泛素化是指将一种高度保守的76个氨基酸多肽——泛素，共价连接到靶蛋白上，该过程由三种酶依次催化完成，即E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶1,2,3。这种翻译后修饰在广泛的生物学过程中发挥核心作用。事实上，提供反应特异性的E3连接酶构成了一大类酶的超家族，是泛素系统中最丰富的酶类4,5,6。蛋白质泛素化的下游效应取决于修饰的性质：单泛素化、多单泛素化，以及线性或分支的多聚泛素化。单泛素化通常不与蛋白酶体降解相关，而是参与调控多种信号转导事件。多聚泛素化涉及泛素分子自身的N端或赖氨酸残基，而多聚泛素化蛋白的命运取决于泛素链延伸所使用的残基。已知由泛素K48位点介导的多聚泛素化可诱导蛋白酶体降解；相反，通过泛素K63位点进行的多聚泛素化则常与蛋白质活化相关7,8,9。与其他重要的翻译后修饰类似，泛素化....
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方案
1. GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 泛素连接酶复合物的 GSH-琼脂糖亲和纯化
- 使用 pGEX6p2rbs-GST-RING1B（1-159 aa）-BMI1（1-109 aa）细菌表达载体转化 BL21（DE3）菌株（参见 材料表)23该质粒构建体可在pGEX-6P-2载体骨架中表达小鼠RING1B的1-159区段与BMI1的1-109区段的融合蛋白，并带有GST标签。
- 接种表达 GST-RING1B（1-159 aa）- BMI1（1-109 aa）的 RIL 细菌至含 100 µg/mL 氨苄青霉素和 50 µg/mL 氯霉素的 20 mL LB 液体培养基中，进行过夜培养。于 37 °C 摇床中孵育过夜。次日，将该种子培养物按 1/26 体积比转接至含氨苄青霉素的 500 mL 新鲜 LB 液体培养基（1 L 三角瓶）中，于 37 °C 摇床中继续培养 2 至 4 小时。
- 孵育期间，使用分光光度计在600 nm处测定OD值。当菌液培养物在600 nm处达到0.6 OD单位时，取1 mL等分试样置于1.5 mL离心管中，作为未诱导样品。向1 L培养物中加入400 µM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）以诱导蛋白表达。将细菌在25 °C下孵育6小时至过夜。
- 将1 mL等份样品....
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结果
GST-BMI1 和 RING1B 蛋白在细菌中表达良好，可轻松从可溶性组分中提取。 图1A 展示了 GST-BMI1-RING1B 复合物典型纯化过程的考马斯亮蓝染色结果。GST-BMI1 和 RING1B 条带的迁移分子量分别为约 45 kDa 和约 13 kDa，符合预期。值得注意的是，该 E3 泛素连接酶复合物具有高度均一性，细菌蛋白污染物和/或降解产物含量极低。此外，纯化所得复合物的化学计量比理想，当摩尔比为 1:1 时，GST-RING1B 蛋白的条带强度预计为 BMI1 的两到三倍。类似地，His-BAP1/MBP-DEUBAD 复合物的纯化也获得了相对高度均一的产物，其条带分别位于约 90 kDa 和约 55 kDa（图1B）。通过镍-琼脂糖和直链淀粉-琼脂糖分别对 BAP1 和 DEUBAD 进行串联亲和纯化，可确保复合物具有适当的化学计量比，并去除纯化复合物中游离的 BAP1。另一方面，纯化的核小体组分主要由 147 bp 条带组成，.......
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讨论
建立针对目标蛋白的稳定体外泛素化和去泛素化检测方法具有多项优势。这些检测方法可用于：（i）确立反应的最佳条件并定义其最低需求；（ii）测定酶促反应动力学参数和生物化学常数；（iii）明确影响这些反应的辅因子或抑制剂的作用；（iv）界定相互作用界面；（v）评估人工引入或疾病相关突变的影响；以及（vi）建立可用于进一步开发高通量化学筛选检测的实验条件。本文以核小体底物上BMI1/RING1B介导的H2A泛素化以及BAP1/ASXL介导的H2A去泛素化为例，详细说明这些检测方法的操作过程。
使用最少的组分即可在体外重现组蛋白H2A的泛素化，几乎可以观察到BMI1-RING1B复合物介导的H2A完全泛素化。需要注意的是，该反应是在重组核小体上进行的。重组核小体的优势在于不受哺乳动物细胞中其他组蛋白翻译后修饰的干扰。尽管如此，该泛素化反应也可在天然核小体上高效进行。如果泛素化反应较弱，可提高酶与底物的比例以获得最佳的泛素连接效果。需要注意的是，如果后续需进行去泛素化反应或相互作用检测，则可直接在磁珠结合的底物上进行泛素化反应。通过免疫沉淀回收泛素化的底物，并弃去含有泛素化反应组分的上清液。然.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
感谢Diana Adjaoud提供的技术协助。本工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（2015-2020年）、魁北克基因组学中心（2016-2019年）和加拿大基因组学中心（2016-2019年）向E.B.A.提供的资助。E.B.A.是魁北克健康研究基金会（FRQ-S）的资深学者。L.M和N.S.K.获得了FRQ-S的博士奖学金。H.B获得了突尼斯高等教育与科学研究部以及Cole基金会的博士奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 直链淀粉琼脂糖珠 | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL 10K 离心滤器 | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| 抗-H2AK119ub（H2Aub）抗体 | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| 抗-Flag 琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL 菌株 | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM 培养基 | Wisent | #319-005-CL | |
| 空层析柱 | Biorad | #731-1550 | |
| Flag 肽段 | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH 琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T 细胞 | ATCC | #CRL-3216 | |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| 微球菌核酸酶（MNase） | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA 琼脂糖珠 | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-甲基马来酰亚胺（NEM） | Bioshop | #ETM222 | |
| 孔径 0.45 μm 注射器滤器 | Sarstedt | #83.1826 | |
| 聚乙烯亚胺（PEI） | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) 质粒 | Addgene | #63139 | |
| 泛素激活酶（UBE1） | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C（UBE2D3） | Boston Biochem | #E2-627 |
参考文献
- Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
- Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews ....
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重印与许可
