硝基肽的分析与鉴定：以血管紧张素II为例

摘要

酪氨酸硝化蛋白的蛋白质组学分析一直是一项具有挑战性的技术，原因是3-硝基酪氨酸修饰的丰度较低。本文以血管紧张素II为模型，介绍一种新型的硝基肽富集与分析方法。该方法可推广应用于其他 体外 或 体内 系统。

摘要

蛋白质酪氨酸残基的硝基化是最重要的翻译后修饰（PTM）之一，可由真核细胞中活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的化学作用诱导产生。精确鉴定蛋白质上的硝基化位点，对于理解与蛋白质硝基化相关的生理和病理过程（如炎症、衰老和癌症）至关重要。由于即使在诱导条件下，细胞内硝基化蛋白质的丰度仍然很低，目前尚未建立通用且高效的蛋白质硝基化位点分析与鉴定方法。本文介绍一种通过化学还原反应结合生物素标记富集硝基肽段，并利用高分辨质谱进行检测的实验方案。该方法可实现对硝基肽段衍生物的高精度鉴定。与先前报道的方法相比，本方法具有两个优势：第一，采用二甲基标记封闭硝基肽段上的伯胺基团，从而可获得定量分析结果；第二，使用含二硫键的NHS-生物素试剂进行富集，该连接键可在后续步骤中被还原并烷基化，从而增强质谱检测信号。本方案已在本文中成功应用于模型肽段血管紧张素II（Angiotensin II）的检测。

引言

蛋白质中酪氨酸残基硝化形成3-硝基酪氨酸，可调控多种生物学过程。由于酪氨酸与3-硝基酪氨酸在化学性质上存在差异，硝化后的蛋白质其信号传导活性可能发生改变^1,2。因此，开发能够高效富集并鉴定蛋白质硝化位点的方法具有重要意义。相较于磷酸化、乙酰化等其他蛋白质翻译后修饰形式，3-硝基酪氨酸在蛋白质中的丰度较低，因此直接从细胞系或组织样本中鉴定内源性硝化位点具有挑战性。尽管如此，利用质谱（MS）分析硝化肽段裂解模式的方法已有报道（例如Zhan & Desiderio³），这为硝化蛋白质组学新方法的建立奠定了基础。 

目前，富集步骤结合质谱分析是硝基肽谱分析最有效的策略^4,5富集方法可分为两类：一类基于能够特异性识别3-硝基酪氨酸的抗体，另一类则基于化学衍生法，将硝基还原为氨基。^4,5对于基于抗体的方法，使用硝基酪氨酸亲和柱进行富集，随后对洗脱物进行高分辨率质谱分析。^6,7对于基于化学衍生化的方法，首先应通过乙酰化、相对与绝对定量同重标记（iTRAQ）或串联质谱标签（TMT）试剂阻断肽段N端或赖氨酸的氨基。随后使用还原剂将硝基酪氨酸还原为氨基酪氨酸，接着对新生成的氨基进行修饰，包括生物素连接、巯基肽转化或其他类型的标记系统。^8,9,10,11. 目前建立的大多数方案均基于 体外 过度硝化的蛋白质，而非内源性硝化的蛋白质。

本研究建立了一种改良的硝基酪氨酸化学衍生化方法，用于硝基肽的富集与鉴定，该方法在质谱检测中表现出更高的灵敏度，并适用于定量分析。我们近期在生物系统中应用该方法的研究发现，髓源性抑制细胞（MDSCs）产生的活性氮物种（RNS）可导致淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK）在Tyr394位点发生硝基化，这在肿瘤微环境的免疫抑制过程中发挥着重要作用¹²。因此，我们的硝基肽鉴定方法同样可应用于复杂的生物样品。本文以血管紧张素II作为模型肽进行实验方案的描述，该肽段的碎裂模式已知，且在硝基蛋白质组学研究中被广泛使用^8,9,10,11。

方案

1. 血管紧张素II的硝化反应

1. 为制备硝化肽，将10 μL血管紧张素II（DRVYIHPF）母液（2 mM水溶液）加入390 μL PBS溶液（10 mM NaH₂PO₄，150 mM NaCl，pH 7.4）中稀释，终浓度为50 μM。
2. 向血管紧张素II溶液中加入10 μL过氧亚硝酸盐（200 mM，溶于4.7% NaOH），使过氧亚硝酸盐终浓度达到5 mM。
   注意：过氧亚硝酸盐不稳定，在酸性条件下易分解，因此其母液需保存在碱性溶液中，并储存在-80 °C。
3. 用1 M HCl调节溶液pH至7–8。将反应管以400 rpm振荡5分钟，以启动硝化反应。
4. 使用市售反相固相萃取柱（见材料表）进行脱盐。
   1. 准备两种脱盐用溶液：5%甲醇水溶液用于洗涤，80%甲醇水溶液用于洗脱。
   2. 依次加入500 μL甲醇和500 μL水对柱子进行预处理，将1 mL移液枪装上吸头后置于柱子上方，按压移液枪以加快流速。
   3. 将步骤1.3中的410 μL样品加载到柱子上，弃去穿流液。
   4. 用500 μL 5%甲醇洗涤后，使用300 μL 80%甲醇洗脱硝化肽，随后在常温下以真空离心浓缩仪默认设置完全干燥。
      注意：脱盐对后续反应至关重要，因前一步骤残留的溶剂可能对后续步骤产生不利影响。

2. 通过二甲基标记对伯胺进行烷基化

1. 将粉末状硝基血管紧张素II溶于100 μL的100 mM三乙基铵碳酸氢盐（TEAB）溶液中。
   注意：溶液pH值应在7至9之间，确保溶液中不含有伯胺基团。
2. 向溶液中加入4 μL 4%甲醛溶液，短暂混匀。
   警告：甲醛蒸气有毒，实验应在通风橱中进行。
3. 向溶液中加入4 μL 0.6 M NaBH₃CN，于室温下以400 rpm振荡反应1小时。
4. 加入16 μL 1%氨水溶液以终止标记反应，室温孵育5分钟。
5. 加入8 μL甲酸对溶液进行酸化，并按照步骤1.4所述方法使用反相固相萃取柱进行脱盐处理。

3. 将硝基酪氨酸还原为氨基酪氨酸

1. 将二甲基标记的硝基血管紧张素II溶于500 μL PBS（10 mM NaH₂PO₄，150 mM NaCl，pH 7.4）中进行重悬。
2. 向溶液中加入10 μL 1 M连二亚硫酸钠，室温孵育1小时。还原反应完成后，溶液的黄色变为无色。
   注意：称取174.1 mg连二亚硫酸钠，溶于水中并定容至1 mL，配制成溶液。该溶液可在-20 °C保存，但不得超过一周。
3. 使用反相SPE柱进行脱盐，操作步骤如第1.4步所述。

4. 生物素标记、富集与检测

1. 将二甲基标记的血管紧张素II溶于500 μL PBS（10 mM NaH₂PO₄，150 mM NaCl，pH 7.4）中进行重悬。
2. 在室温孵育2小时后，向溶液中加入5 μL溶于DMSO的40 nM NHS-S-S-生物素，随后加入1 μL 5%羟胺以终止反应。
3. 在此期间，用500 μL PBS（10 mM NaH₂PO₄，150 mM NaCl，pH 7.4）对链霉亲和素琼脂糖珠进行平衡：在室温下以580 × g 离心5分钟，弃去上清液。重复平衡步骤3次。
4. 向反应体系中加入100 μL链霉亲和素琼脂糖珠，在室温下于旋转摇床上孵育1小时。用PBS（10 mM NaH₂PO₄，150 mM NaCl，pH 7.4）洗涤4次。每次洗涤时，向珠子中加入500 μL PBS，充分混匀，然后在室温下以580 × g 离心5分钟，弃去上清液。
5. 用400 μL 10 mM二硫苏糖醇（DTT）在50 °C下与琼脂糖珠孵育45分钟，于室温下以580 × g 离心5分钟，弃去珠子，向上清液中加入20 μL 0.5 M碘乙酰胺（IAM），避光反应20分钟。
   注：DTT用于断裂生物素与肽之间连接子的二硫键，使后者从珠子上释放，并进一步被IAM烷基化。
6. 采用反相固相萃取柱进行脱盐处理，操作如步骤1.4所示。
7. 将干燥的肽溶解于20 μL 0.1%甲酸（FA）中后，对每部分产物进行液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析。
   1. 使用纳米高效液相色谱系统直接连接高分辨质谱仪，以60分钟梯度洗脱分离修饰后的Ang II肽（0–8分钟，2% B；8–10分钟，5% B；10–35分钟，18% B；35–50分钟，28% B；50–52分钟，80% B；52–58分钟，80% B；58–59分钟，2% B；59–60分钟，2% B），流速为0.300 μL/min。
      注：分析柱内径为75 μm，长度为150 mm，填充C-18树脂。流动相A为0.1%甲酸，流动相B为100%乙腈含0.1%甲酸。
   2. 将质谱仪设置为数据依赖性采集模式，先采集一次全扫描质谱（300–1800 m/z，分辨率60,000），随后进行20次数据依赖性MS/MS扫描，归一化碰撞能量设为28%。
   3. 打开质谱数据文件，鉴定各步骤产物的峰，以确认化学反应已成功完成。

5. 硝基肽的定量分析

1. 从步骤1.4制备3组硝基血管紧张素II溶液，每组包含两种不同浓度的硝基血管紧张素II：第1组，A管和B管各含20 nmol，每管溶于100 μl TEAB溶液中；第2组，C管含10 nmol，D管含20 nmol，每管溶于100 μl TEAB溶液中；第3组，E管含40 nmol，F管含10 nmol，每管溶于100 μl TEAB溶液中。
   注意：每组中的两种硝基血管紧张素II浓度分别用于二甲基标记，与甲醛（轻型）和氘代甲醛（重型）反应。
2. 对于每组样品，分别向需标记为轻型和重型的样品中加入4 μL 4%的甲醛和氘代甲醛。按照步骤2.3至2.5完成二甲基标记。
3. 混合轻型和重型标记的样品。
4. 按照步骤3.1至4.6进行还原、生物素标记、富集和检测。

结果

本文中硝基化肽段分析的流程图见图1。图2、3、4和5分别为血管紧张素II、硝基化血管紧张素II、二甲基标记的硝基化血管紧张素II和二甲基标记的氨基化血管紧张素II的质谱图。各图中单一同位素峰的m/z值可反映化合物的分子量，表明每一步中血管紧张素II的化学修饰均成功实现。图6展示了第4.7步检测和通过LC-MS/MS表征的最终产物。图7显示了通过二甲基标记对硝基化肽段的定量结果。轻链和重链的相对含量通过各组单一同位素峰强度的比较确定，从而实现对来自不同组别的富集硝基化肽段的定量分析。

讨论

本方案描述了硝基化肽段的富集与分析流程。以血管紧张素II作为模型肽段，我们展示了如图1所示的操作步骤。在获得硝基化血管紧张素II后，应封闭肽段上的伯胺基团，以避免进一步发生胺基偶联反应，这是本方案中最关键的步骤之一。在本方案中，采用二甲基标记法封闭伯胺基团，原因有二：第一，该方法可实现定量分析；第二，其反应成本低于基于NHS的反应，且封闭效率较高¹³。在定量分析中，实测的轻重同位素比值与预期比值非常接近（图7），误差小于10%。

该实验方案的另一个关键步骤是使用连二亚硫酸钠将二甲基标记的肽段上的3-硝基酪氨酸快速高效地还原为氨基酪氨酸。新生成的氨基基团进一步与过量4-5倍的NHS-S-S-生物素进行标记。若NHS-S-S-生物素用量过少或过多，将分别导致标记反应不完全或富集不完全。DTT可完全断裂二硫键，使富集的肽段从链霉亲和素磁珠上释放，随后经IAM烷基化并进行LC-MS/MS分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Acclaim pepmap 100 C18 色谱柱	Thermo-Fisher	164534
1 M TEAB 溶液	Sigma-Aldrich	T7408
50% 羟胺	Thermo-Fisher	90115
乙腈	Thermo-Fisher	A955	质谱级
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	43819
甲醛	Sigma-Aldrich	F8775	分子生物学级
甲醛-D2	Toronto Research Chemicals	F691353
甲酸	Sigma-Aldrich	695076	ACS 试剂
Fusion Lumos 质谱仪	Thermo
碘乙酰胺	Sigma-Aldrich	I1149
甲醇	Thermo-Fisher	A456	质谱级
NHS-S-S-生物素	Thermo-Fisher	21441
Oasis HLB 柱（10 mg）	Waters	186000383
过氧亚硝酸盐	Merck-Millipore	516620
氰基硼氢化钠	Sigma-Aldrich	42077	PharmaGrade
连二亚硫酸钠	Sigma-Aldrich	157953	工业级
链霉亲和素 Sepharose	GE Healthcare	GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC	Thermo