离子交换色谱 (IEX) 与多角度光散射 (ALS) 相结合, 用于蛋白质分离和表征

蛋白质产品的定量表征作为质量控制 (QC) 的一种手段越来越重要, 这既是生物制药行业的监管目的, 也是保证生命科学研究的可靠性和完整性^1,2. 如欧洲蛋白质网络蛋白质生产和纯化伙伴关系 (P4EU) 和欧洲生物物理研究资源协会 (ARBRE-MOBIEU) 网站上所述 (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs 和 https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control,), 蛋白质 qc 不仅必须表征最终产品的纯度, 还必须表征其寡聚状态、均质性、同一性、特性、构象、结构、翻译后修饰和其他属性^3,4。

最常见的 QC 表征方法之一是 SEC-MALS。在这种方法中, 分析证交会柱与 ALS、分光光度法和折射率检测器耦合, 能够准确测量每个峰⁵的蛋白质摩尔质量。SEC-MALS 独立于洗脱量确定洗脱峰的摩尔质量, 并克服了使用柱校准的分析 SEC 的不准确性。动态光散射 (DLS) 模块的加入增加了尺寸测量能力, 可用于流体动力半径的测定。在学术研究中, SEC-MALS 通常用于确定蛋白质的寡聚状态、构象、纯度、聚集水平和修饰蛋白, 如糖蛋白或脂溶膜蛋白 (确定蛋白的摩尔质量和单独共轭的成分)^6,7,⁸。

在许多情况下, 纯化过程的最终蛋白质不是明确定义的分子物种, 而是包含一些异质性。这种混合物中的蛋白质可以在结构 (例如, 不同的寡聚形式)、构象或蛋白质异形方面发生变化。蛋白质异质性也可能是由 c-端赖氨酸处理或芦笋-谷氨酰胺脱胺引起的轻微化学差异的结果, 导致电荷变异^9,10.翻译后修饰 (如糖基化) 的差异也会导致具有电荷变化的异质样本⁹。这些不同类型的异质性反映在蛋白质的生物物理特性中, 并可能影响目标蛋白11的稳定性和生物活性^.

对此类异质样品进行可靠的质量控制检测需要一种高分辨率的分析分离技术。在某些情况下, 由于分析证交会列的分辨率和分离能力^有限, 可对其进行良好分离挑战, 从而导致证交会-als 分析存在缺陷。将 IEX 和 MAX 等高特异性分离技术结合起来, 可以克服非均质样品中 SEC-MALS 的局限性, 为蛋白质表征提供了一种互补的方法 (表 1, Amam满^{等人, 12})。与证交会不同的是, iex 通过其流体动力学尺寸13分离大分子^,而 iex 则通过其表面电荷¹⁴分离大分子。阴离子交换 (AIEX) 和阳离子交换 (CIEX) 矩阵分别结合负电荷和正电荷变量。IEX-MALS 在质量或形状相对较近的蛋白质种群之间进行了精细的分离, 成功地确定了混合物^{样本 12}中每个单独蛋白质状态的摩尔质量。

在这里, 我们提出了一个标准协议, 用于运行 IEX-MALS 实验, 用于分离和分析同一样本中存在的 BSA 寡聚形式。为特定蛋白质选择 IEX 柱是重要的, 并进行了讨论, 缓冲器的 pH 值和电导率条件也是如此。并逐步描述了 IEX-MALS 实验数据的分析。尽管在 SES-MALS 中 BSA 低聚物的分离是很好的、足够的, 但 BSA 是一个很好的例子, 可以展示 IEX-MALS 的能力, 并演示实验的优化。在前面的研究¹²中讨论了 SES-MALS 实现的不良分离和 IEX-MALS 促成的适当分离和分析的例子。

1. 系统的准备

1. 安装快速蛋白质液相色谱 (FPLC) 系统和 Mals/折射率 (ri) 检测器 (见材料表) 及其各自的软件包, 以便根据制造商进行控制、数据采集和分析。指示。
2. 将 MAS 和 RI 探测器连接到 FPLC uv 和电导率探测器的下游。绕过 pH 检测器, 除非绝对需要 ph 梯度, 以最大限度地减少紫外线和载货流检测器之间的检测器体积。在色谱检测器输出到废物或分数收集器上, 使用柱和检测器之间 0.25-0.5 mm 内径 (i. d.) 的毛细管和 0.75 mm 的 i. d. 毛细管。
3. 确保 FPLC 和探测器之间的必要信号连接已经建立, 包括从 FPLC 探测器到 MALS aux 输入的紫外线模拟输出, 以及从 FPLC 到 MALS 自动注入的数字输出, 通过 i传递-o 盒。

2. 样品和缓冲液的制备

1. 使用0.1μm 过滤器过滤所有试剂, 包括洗涤和洗脱缓冲液。将第一个 50–100 mL 的缓冲液过滤到一个废物瓶中, 以消除干式过滤器中的颗粒, 并将剩余的缓冲液保存在一个干净的无菌瓶中, 该瓶子已被过滤过的水彻底清洗, 并被封盖, 以防止灰尘进入。
2. 将 BSA 样品调整为 pH 值和离子强度 (例如, pH = 8, 50 mM NaCl), 以便在稀释、超滤或缓冲交换过程中与 IONIC 柱结合。
   注: 建议将蛋白质样品预过滤到不去除感兴趣的材料 (0.02 –0.1μm) 的最小孔径。或者, 样品可以在高速 (13000–16000 x g) 下离心 10分钟, 以实现大颗粒的沉淀。
3. 准备至少0.3–0.5 毫克的 BSA (见材料表), 注入 1 ml 柱 (5\ 50 mm), 以实现高质量的 als 分析。请注意, 注入的音量是无限的。

3. 蛋白质的 IEX 方法的选择和发展

1. 根据主序列计算蛋白质的等电点 (pI), 对于 ExPASy 网站上的Protparam 工具等服务器, 可以使用¹⁵。请注意, BSA 的 pI 为5.8。
2. 选择列类型和缓冲区参数。
   1. 根据缓冲区的 pK a 和缓冲区的离子性质, 对 AIEX 和 CIEX 使用不同的缓冲区.在运行 AIEX 列时使用阳离子缓冲区, 在运行带有小反离子的 CIEX 列时使用阴离子缓冲区。在本例中, 使用 20 mM Tris-HCl 缓冲液 ph 8 在 AIEX 柱上分析 BSA。
   2. 对于 pI 低于7的蛋白质 (如 BSA), 请使用 AIEX 色谱柱和 ph 值高于 pI 至少两个单位的缓冲液。对于 pI 高于7的蛋白质, 请使用 CIEX 色谱柱和 ph 值低于蛋白质 pI 至少两个单位的缓冲液。
   3. 根据蛋白质与柱基质之间的结合强度优化缓冲液 ph 值。如果蛋白质与色谱柱的结合不好, 请使用离 pI 较远的 pH 值。确保蛋白质在使用的 ph 值下是稳定的。
   4. 使用低盐浓度的结合和洗涤缓冲液, 以允许蛋白质结合到基质, 因为蛋白质结合取决于加载样品的离子强度。蛋白质通常需要一些盐才能稳定;因此, 在蛋白质加载和柱状洗涤步骤中使用 50 mM 氯化钠 (或替代盐)。
   5. 对于洗脱缓冲液, 最多使用 0.5 M Ncl 将蛋白质从色谱柱中分离。
      注: 由于仪器的范围限制, 使用标准型号 RI 折射率仪时, 不建议使用较高的盐浓度。但是, 可以使用高浓度模型, 并可容纳2m 氯化碳。
3. 执行初始方法, 如下所示。
   1. 在 20 mM Tris-HCl 缓冲液的负载缓冲液 ~ 0.5 mL 中装载1毫克 BSA (170μl, 合 6 Mg/ml), ph 值 8, 含 50 mM 氯化碳。用10–15列体积 (CV) 用相同的缓冲液清洗色谱柱, 以便在光散射 (LS)、UV 和 RI 信号完全稳定之前, 将未绑定的分子和粒子从系统中完全洗脱。
   2. 执行一个短的线性盐梯度 20-30 Cv, 使用洗脱缓冲液 20 mm Tris-HCl, pH 值 8, 包含 0.5 M 氯化碳, 以分离蛋白质从色谱柱。执行洗脱缓冲液的 0%-100% (或替代广泛梯度) 的梯度或将其拆分为两个梯度: 0%-50% 的洗脱缓冲液, 然后是 50%-100% 洗脱缓冲液的额外梯度, 每个梯度为 10–20 CV。对于 BSA, 对于 30cv, 使用广泛的梯度为 15%-70% 作为初始方法。
      注: 在某些情况下, 初始方法可能为可靠的 MALS 分析提供分离, 并且不需要额外的运行。在许多情况下, 初始方法仅为进一步的方法优化提供指导。
4. 通过改变不同的参数, 优化 IEX 方法, 提高分辨率, 提高峰值分离。
   1. 更改渐变斜率和长度。具有高坡度的短梯度提供了较强的峰值, 分离较少, 而具有轻度坡度的较长的坡度则提供较低的峰值和较好的分离。找到峰值分辨率和信号强度之间的平衡, 以实现最佳的 MALS 分析。
      注: 加载更多的蛋白质会增加 LS、UV 和 RI 信号, 但这样做是以牺牲分辨率为代价的。
   2. 使用逐步盐浓度的轮廓进行洗脱。请记住, 步骤和线性渐变的组合是常用的。
   3. 降低流量, 提高峰值分离。
      注: 对于颗粒非常小的矩阵, 这不是很重要。
   4. 改变缓冲液 pH 值, 以增加样品中蛋白质种群之间的电荷变化, 并改善这些变体之间的分离。请注意, 在一个 ph 值处没有适当分离的蛋白质可以在不同的 pH 值处分离。
   5. 使用线性或逐步的 ph 梯度将蛋白质从 IEX 柱中分离出来。如有必要, 请使用将 pH 值和盐浓度变化结合起来的洗脱梯度。
   6. 使用更强的盐 (如 MgCl 2) 或较弱的盐 (如醋酸钠₎来提高灵敏度和分辨率¹⁶。
   7. 使用较长的 IEX 列或具有较小颗粒的不同列矩阵, 以提高分离能力。
   8. 更改列的类型 (AIEX/CIEX) 以提供不同的分离模式。请注意, 具有强、弱或组合 (混合模式) 配体的矩阵也是可用的, 可以提高某些样本的分辨率。
   9. 使用不同供应商的列, 该组合具有连接到不同基体树脂的相同配体。树脂本身, 独立于配体, 可以与蛋白质不同地相互作用, 并影响分离轮廓。
   10. 在缓冲液中加入添加剂 (稳定溶液中蛋白质的分子), 以提高蛋白质稳定性, 避免蛋白质聚集, 从而改进 IEX 实验。
       注: 此类添加剂的例子包括糖、醇、尿素、非离子或 zwittionic 洗涤剂, 以及各向异性和 kosmot非特盐^17、18。

4. IEX-MALS 实验

1. 打开 MAL 软件中的 "方法实验", 从"光散射系统方法" 文件夹中选择联机方法。如果 DLS 模块可用, 并且要获取 DLS 数据, 请从"光散射"子文件夹中选择联机方法。
2. 在 "配置"部分下设置运行的参数。
   1. 将 "通用泵" 部分中运行的流量设置为 fplc 中使用的流量 (1.5 mL/min), 然后输入或验证"溶剂" 部分下的缓冲参数。
   2. 输入蛋白质名称 (BSA)、折射率增量 (dn/dc; 蛋白质的标准值为 0.185 mlp)、波长为280纳米的紫外线消光系数 (0.185 格l-1 ·cm-1) 和蛋白质样品浓度 (6 mL/g)."喷射器" 部分下的"示例" 选项卡。在同一部分下插入用于注射的样品体积 (170μl)。
   3. 在 "基本集合" 选项卡的 "过程" 部分下, 选中 "自动注入触发" 复选框,并设置运行持续时间, 以便在渐变达到其状态后至少持续5分钟的数据收集最终值。
3. 在 FPLC 软件中设置实验参数。
   1. 在"方法编辑器"选项卡中创建新实验。最初的实验将是盐或 pH 值的线性梯度 (见步骤 3.3)。对于优化的方法, 根据初始方法期间的洗脱结果创建更具体的渐变或逐步程序 (参见步骤3.4 和图 1)。在将触发数据收集的方法中包括一个脉冲信号。
   2. 用相关缓冲液清洗色柱和阀门:20 mM Tris-HCl, pH 8, 用于洗涤缓冲液 (A 阀) 的 50 mM 氯化碳和用于洗脱缓冲液 (B 阀) 的相同缓冲液。确保最终的柱洗使用结合缓冲液, 含有较低的盐浓度, 使蛋白质结合到色谱柱基质。要大量清洗强结合的杂质, 请使用 0.5 M NaOH, 然后使用相关的缓冲液清洗, 然后进行中和缓冲清洗。
   3. 使用注射器将蛋白质样本放入循环中。如果样品的负载超过10毫升, 请使用超环或 FPLC 仪器的泵阀, 同时绕过过滤泵和 FPLC 的混合器。
4. 首先在 MALS 软件中开始实验, 先单击 "运行" 按钮, 然后在 fplc 软件中单击。数据将在通过 ALS 检测器接收到 FPLC 仪器的脉冲信号后收集。
5. 如果 IEX-MAS 是使用连续流模式而不是独立方法手动执行的, 则应用运行的相同参数和步骤4.1-4.4 中描述的说明。
6. 验证并运行最终方法后, 使用空白注入 (加载缓冲区而不是示例) 执行完全相同的方法。自动注入脉冲和空白运行的渐变之间的时间与示例运行的时间相同, 这一点很重要。

5. IEX-MALS 实验数据分析

1. 在 MALS 软件的"过程" 部分下逐步执行分析。"基本集合" 视图显示实验的原始数据收集。
   1. 如果色谱显示出很大的噪声, 请使用 "下降" 选项卡平滑色谱图。通常情况下, 使用正常级别。
   2. 在"基线" 视图中定义所有信号 (所有 ls、UV 和 ri 探测器) 的基线。
   3. 在"峰值"视图中定义分析的峰值。验证每个峰下蛋白质的正确值和紫外消光系数。
      注: 对于蛋白质, 通常使用 0.185 mlp 的标准 RI 增量值, 但对于其他大分子, 应根据分子的性质使用不同的 dn/dc 值。多核苷酸 (dna/rna) 的平均 dn/dc 为 0.17 mllx19,而糖类, 如蔗糖, 平均 dn/dc 值为 0.17 mL/g²⁰ , 脂质和洗涤剂的 dn/dc 值在 0.1-0.16 ml/g²¹之间。
   4. 利用从 LS 和 r. els 视图中的摩尔质量 & 半径和r_h 的拟合参数和相关函数, 分析了摩尔质量和半径。
2. 由于盐浓度的增加, 在 IEX-MAL 运行期间, RI 信号发生了显著变化。因此, 从空白注入中减去基线信号, 以便进行需要 RI 数据的质量计算。
   1. 打开蛋白质和空白的 IEX-MALS 实验。右键单击蛋白质实验名称, 选择 "应用方法", 然后从文件对话框中选择 "基线减法"文件夹。选择正确类型的方法 (例如在线) 进行标准磨牙质量分析。请注意, 为蛋白质实验定义的参数和设置将保存在新的打开方法上。
   2. 在 "基线减法"视图下, 单击 "导入空白"以导入空白运行的信号。在 "仪器 " ("导入空白"按钮旁边) 下, 检查所有检测器以减去。
   3. 在峰值视图中, 由于溶液在蛋白质峰区域的电导率, 因此在运行¹²期间更改了溶液的 ri, 因此调整 dn\ dc 值 (如有必要)。
3. 用 BSA 单体校准 IEX-MALS 系统。
   注: 通常情况下, IEX-MALS 系统定期校准, 以确保角探测器与90°探测器的峰值对齐、波段加宽和归一化, 使用的单分散蛋白的旋转半径 (r_g)为 lt;10 nm,如 BSA 单体。在本例中, BSA 既是校准分子, 也是摩尔质量分析的主题。
   1. 在 "过程>配置" 视图下对齐峰值。
   2. 在规范化视图下执行规范化, 将 3.0 nm 输入为r_{g 值}。
   3. 在同一"配置"选项卡中的"波段加宽" 下, 使用 "执行调整" 按钮选择峰值并将 UV 和 ls 信号与 ri 信号匹配。
4. 结果的图形显示在 "结果拟合"视图中。通过右键单击图形, 选择"编辑", 然后单击 "高级" 按钮, 更改轴比例和其他图形参数。" Easi 图形"选项卡中还提供了包含更多显示选项的图形图: 从窗口顶部的"显示 " 下拉菜单中选择 "摩尔质量"。
5. 请注意, 所有结果 (包括摩尔质量、半径、纯度水平等) 都可在 "结果" 部分下的"报告" 视图 (摘要或详细) 中找到。使用"报表设计器"按钮可向报表中添加更多结果或参数以及数字。

BSA 是一种常用的蛋白质, 用于色谱校准实验系统22 , 非常适用于练习 IEX-MALS 以及 SES-MALS。它主要是单体, 理论单体质量为 66.7 kDa, 通常含有少量的二聚体和较高的低聚物23。

利用阴离子交换分析柱 (见材料表) 在 IEX-MAS 上对 bsa 进行了分析。由 75 mM 到 350 mM 氯化器的 30 Cv 组成的宽线性梯度将 BSA 单体从较高的低聚物中分离出来。下游 MAS 分析得出的单体摩尔质量为 668±0.7 kDa, 计算出的二聚体摩尔质量为 130±5 kDa (图 1a)。

根据洗脱峰处的缓冲电导率, 梯度被改变为不同的程序: 175 mM Ncl 的长步, 然后是 175 mm 到 500 mM Ncl 的线性梯度。新梯度极大地提高了 BSA 单体 (计算摩尔质量为 661±0.7 kDa) 与其较高的低聚物种 (计算平均质量为 132±2 kDa) 之间的分辨率和良好分离 (图 1b)。为了也集中在高寡聚物种和计算每个单独的寡聚形式的分子质量的 bsa, 一个逐步计划 200 mM 和 250 mM Ncl 应用。该实验的结果是, BSA 单体 (计算质量为 62.4±0.4 kDa)、二聚体 (计算质量为 130±10 kDa) 和三聚体 (计算质量为 170±10 kDa) (图 1c) 之间进行了出色的分离。所有 IEX-MALS 实验表明, BSA 大部分是纯度为80% 的单体, 这与 SES-MALS 的结果一致, 即 BSA 单体的纯度为 85%12。

图 1: BSA iex-mals 实验的优化.(A) bsa 的 Iex-mals 实验, 梯度程序为 75–350 mm 氯化钠。(B) 由 175 Mm ncl 步骤的程序进行 bsa 的 iex-mals 实验, 然后是 175–500 Mm ncl 的线性梯度程序。(C) bsa Iex-mals 实验, 步进程序为 200 mm 和 250 Mm Ncl。色谱图显示紫外线为280纳米 (蓝色), 光散射为90°角 (红色), 折射率 (粉红色) 和电导率 (灰色) 曲线与 MAALS (黑色) 计算的每个峰的摩尔质量一起显示。请点击这里查看此图的较大版本.

D. s. 是怀亚特科技公司的员工, 其产品在本协议中得到了使用。A . t . 是 Danyel Biotech 的员工 , 他是怀亚特和 KTA 仪器的分销商。