通过肺动脉缩窄诱导小鼠右心室衰竭及右心室功能评估

摘要

本文提供了一种研究右心室衰竭机制的有效方法。通过使用自制的手术器械，建立了一种更为简便且高效的肺动脉缩窄方法。此外，还提供了利用超声心动图和导管插入术评估该方法质量的技术。

摘要

右心室衰竭（RVF）具有独特性、高发病率、高死亡率及难治性等特点，其发病机制亟需阐明。既往已有模拟RVF进展的大鼠模型报道。与大鼠相比，小鼠在动物实验中更为易得、经济且应用广泛。我们建立了一种肺动脉缩窄（PAC）方法，通过结扎小鼠肺动脉干以诱导右心室（RV）肥厚。我们设计了一种特殊的外科搭扣针，便于更清晰地分离主动脉与肺动脉干。在实验中，使用该自制搭扣针显著降低了动脉破裂风险，使手术成功率提高至90%。我们采用不同直径的垫片针实现精确的定量缩窄，从而诱导不同程度的右心室肥厚。通过无创经胸超声心动图测量肺动脉（PA）血流速度，对缩窄程度进行量化评估。术后8周通过右心导管术精确评估右心室功能。自制手术器械采用常规材料，制作工艺简单，易于掌握。因此，本研究所述的PAC方法可利用实验室自制器械轻松复制，适用于其他实验室广泛开展。本研究提出了一种改良的PAC方法，其手术成功率高于其他现有模型，术后8周存活率达97.8%。该PAC技术为研究右心室衰竭机制提供了有效手段，有助于进一步加深对RVF的理解。

引言

右心室功能障碍（RVD）在此定义为存在右心室结构或功能异常的证据，与不良临床预后相关。右心室衰竭（RVF）是右心室功能进行性恶化的终末阶段，是一种表现为心力衰竭体征和症状的临床综合征，由进行性RVD所致¹。由于结构和生理功能的差异，左心室（LV）衰竭与右心室衰竭具有不同的病理生理机制。已有研究报道了右心室衰竭中一些独立的病理生理机制，包括β2-肾上腺素能受体信号通路的过度表达²、炎症反应³、横小管重构以及钙离子（Ca²⁺）处理功能障碍⁴。

右心室衰竭（RVF）可由右心室的容量或压力超负荷引起。既往的动物模型采用SU5416（一种强效且选择性的血管内皮生长因子受体抑制剂）联合低氧（SuHx）^5,6 或野百合碱⁷ 诱导肺动脉高压，从而导致继发于肺血管疾病的右心室衰竭²。进行这些研究的研究人员主要关注血管系统，而非右心室衰竭的病理进展过程。此外，野百合碱具有心脏外效应，无法精确模拟心源性疾病的状况。其他模型则采用动静脉分流术诱导容量超负荷及右心室衰竭⁸。然而，该手术操作困难，且不适用于小鼠，因为小鼠需要较长的诱导期才能形成右心室衰竭。

也有使用结扎夹构建大鼠PAC模型的方法^9,10。与大鼠相比，小鼠作为心脏疾病动物模型具有多种优势，例如繁殖更容易、应用更广泛、成本更低，且便于进行基因修饰¹¹。然而，结扎夹的直径通常在0.5 mm至1.0 mm之间，对于小鼠而言过大⁹。此外，结扎夹难以制作、复制，并在其他实验室中推广使用。

我们提供一种基于已有研究的改良型右心室衰竭（RVF）小鼠模型构建方案，该方案采用肺动脉缩窄术（PAC）模拟法洛四联症、努南综合征或其他肺动脉高压性疾病^{12,13,14,15,16,17,18,19}。该PAC技术通过使用实验室自制的带锁扣和垫片的针具结扎小鼠肺动脉干，以精确控制缩窄程度。锁扣针由一支90°弯曲的注射器针头制成，其中穿引一条编织丝线缝合线，针体由常规材料制成，制作过程易于掌握。垫片针则由标准规格针头弯曲120°制成，根据小鼠体重（20–35 g）选用不同直径（0.6–0.8 mm）的垫片针。此外，我们建立了通过超声心动图和右心导管检查评估RVF模型稳定性和质量的评价标准。选择小鼠作为模型动物，因其在其他实验中已被广泛使用。本实验室自制的针具易于复制，可推广应用于其他实验室。本研究为研究人员探索右心室衰竭的机制提供了一种可靠的方法。

方案

所有操作均按照动物研究的机构指南进行，这些指南符合美国国立卫生研究院（NIH出版号85-23，1996年修订版）发布的《实验动物护理与使用指南》。C57BL/6雄性小鼠（8-10周龄，体重20-25 g）由南方医科大学动物中心提供。小鼠到达后，在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，并提供充足的食物和饮水。

1. 手术器械的准备及针头的制备

1. 准备无菌外科手术器械（图1A）、用于结扎的6-0编织丝线（图1B[a]）以及用于关闭切口的5-0尼龙缝线（图1B[b]）。
2. 将6-0编织丝线（图1B[a]）穿入从1 mL注射器上拆下的25 G针头中。然后使用止血钳将针头弯曲90°，制成锁针（图1C[a]）。将22 G针头弯曲120°（图1C[b]），制成垫针。

2. 手术准备

1. 手术前对所有外科器械进行高压灭菌。将加热垫调节至 37 °C。通过腹腔注射给予小鼠赛拉嗪（5 mg/kg）和氯胺酮（100 mg/kg）混合物以实现镇痛麻醉。将小鼠分别放入单独的盒子中，等待麻醉起效。
   注意：也可使用 1.5% 异氟烷进行吸入麻醉。
2. 通过观察足底回缩反射消失来评估麻醉深度。使用缝线固定小鼠门齿，并用胶带固定四肢，使其仰卧于加热垫上。再次检查反射，以确认麻醉深度。
3. 在从颈部至剑突区域的皮肤上涂抹脱毛膏。先用碘伏消毒，再用 75% 酒精脱碘。
4. 进行气管插管。
   1. 调节动物微型呼吸机（图 1D）的参数，设置呼吸频率为 150 次/分钟，潮气量为 300 µL。
   2. 用尖头镊子轻轻拉出舌头，使用自制的刮板抬起下颌（图 1C[c]），以暴露声门；同时将冷光源对准喉部，在直视下轻柔地将自制的气管插管（图 1C[d]）经声门插入。
   3. 连接插管与呼吸机，确认插管是否已正确进入气管。若位置正确，使用胶带固定气管插管。

3. 手术

1. 打开胸腔。
   1. 使用眼科剪在皮肤上平行于第二肋处做一切口，长度约10 mm，切口应从胸骨角开始，至左侧腋前线结束。通过从胸骨角开始计数肋骨，确定第二肋间隙。
   2. 使用剪刀和弯头镊子分离并剪开第二肋间隙上方的胸大肌和胸小肌，以暴露该间隙。
      注意：建议钝性分离、游离胸大肌并向右侧及头侧牵拉。
   3. 用弯头镊子钝性穿入第二肋间隙并撑开该间隙。随后钝性分离肺实质和胸腺组织，直至可见肺动脉干。
2. 缩窄肺动脉。
   1. 使用弯头镊子钝性分离肺动脉干和升主动脉。用持针器将缝线穿过肺动脉干与升主动脉之间的结缔组织。
   2. 将垫片针（见步骤1.2）置于肺动脉干下方，随后使用6-0编织丝线连同垫片针一起结扎肺动脉干。观察到肺动脉球充盈后立即取出垫片针，并剪断缝线末端。
   3. 观察肺动脉球的充盈情况，以评估是否存在缩窄。再次评估动物的反射，确认结扎成功。
      注意：假手术组应执行上述所有步骤，但不进行缩窄操作。
3. 使用5-0尼龙缝线关闭胸腔和皮肤。再次用75%酒精对皮肤进行消毒。
4. 皮下注射0.5 mL生理盐水，以补充手术过程中丢失的体液。将小鼠单独置于垫有加热垫的笼中以促进恢复。待意识恢复后，将小鼠转移至12小时光照/12小时黑暗循环的房间内笼养。术后连续3天通过饮水给予布托啡诺进行镇痛治疗。
5. 术后第一周内每日观察小鼠2次，特别注意开胸切口的愈合情况，及时发现愈合不良、活动能力下降或体重减轻等异常表现。

4. 术后右心室功能的超声心动图评估

注意：术后3天可检测到超声心动图变化。

1. 通过吸入3%异氟烷麻醉小鼠，并以1.5%异氟烷维持麻醉深度。将小鼠固定于平台，将其爪子用胶带固定在电极上，保持动物仰卧位。通过调节异氟烷浓度在1.5%至2.5%之间，维持小鼠心率在450-550次/分钟。
2. 使用脱毛膏去除小鼠胸部的毛发，并在胸部皮肤上涂抹超声耦合剂。
3. 使用30 MHz探头评估肺动脉干狭窄情况。
   1. 将探头保持在相对于左侧胸骨旁线逆时针30°的位置，同时使探头切迹朝向尾侧。在B模式下调节y轴和x轴，直至清晰显示二尖瓣、主动脉和左心室腔。
   2. 将探头绕其y轴向胸部方向旋转30°-40°。调节y轴和x轴，直至清晰显示肺动脉圆锥。
   3. 将光标置于肺动脉瓣叶尖端以测量峰值血流速度。依次按下Color、PW，进入彩色多普勒模式，然后移动光标，使PW虚线与血流方向平行。
   4. 测量肺动脉峰值流速。使用Cine Store和Frame Store保存数据和图像。
4. 使用30 MHz探头评估右心室参数。
   1. 调整垫子左侧，使其低于右侧。将探头沿右侧前腋线放置，与水平方向成30°角，探头切迹指向尾侧。调节y轴和x轴，直至清晰显示右心室。
   2. 连续按两次M-Mode以显示指示线。测量右心室腔径、缩短分数及右心室壁厚度。使用Cine Store和Frame Store保存数据和图像。
5. 停止吸入异氟烷，使小鼠恢复意识，随后将其放回饲养笼，置于12小时光照/12小时黑暗循环的环境中。

5. 用于评估右心室功能的右心导管检查

注意：术后8周使用1.0 F导管和监测系统进行右心导管检查，以评估右心室功能。

1. 将所有手术器械进行高压灭菌。通过腹腔注射给予赛拉嗪（5 mg/kg）和氯胺酮（100 mg/kg）混合物以麻醉动物。
2. 当足底回缩反射消失后，将小鼠固定在平台上，用胶带将其爪子固定在电极上，并保持小鼠仰卧位。使用脱毛膏去除手术区域的毛发。
3. 用75%酒精对手术区域皮肤进行消毒。使用尖头镊子轻轻拉出舌头，用自制的刮板抬起下颌以暴露声门，在冷光源照射喉部的同时，轻柔地将自制的气管套管经声门插入。使用呼吸机（图1E）辅助通气。
4. 使用眼科剪刀和镊子，在剑突下方穿过膈肌做1.5 cm的双侧切口，打开胸腔。用眼科剪刀剪开膈肌和肋骨以暴露心脏。用23 G针头穿刺右心室游离壁，随后拔出针头；用棉签轻轻按压穿刺点以止血。通过该穿刺口将导管尖端插入心室。
   注意：也建议通过右颈静脉进行右心导管插入术⁶。当导管尖端进入心室时，监测仪将显示右心室压力曲线。
5. 当压力曲线稳定后，连续记录10分钟的右心室收缩压、右心室舒张末期压、右心室dP/dt、小鼠心率以及右心室舒张松弛指数时间常数（Tau）。使用软件，点击选择，然后点击分析。
6. 调整导管尖端朝向右心室流出道。记录完成后将导管缓慢退出。测量结束后将导管置于生理盐水中保存。
7. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg/kg）处死小鼠，随后进行颈椎脱位。然后取出心脏、肺脏和胫骨，用于组织形态学和分子生物学分析。

结果

本研究中，小鼠被随机分配至PAC组（n = 9）和假手术组（n = 10）。术后1周、4周和8周进行超声心动图检查。术后8周，在完成最后一次超声心动图和导管评估后，处死小鼠并取其心脏进行形态学和组织学评估。

肺动脉干缩窄导致右心室肥厚（图2）。与假手术组相比，PAC组在术后8周经胸骨旁长轴切面测得的峰值流速（图2A，C）、压力阶差（图2A，D）以及右心室壁厚度（图2B，E）均显著升高。此外，术后8周时，PAC组的右心室收缩功能（右心室射血分数和右心室缩短分数）较假手术组显著降低（<...

讨论

右心室充盈压的病理性升高会导致室间隔向左移位，从而改变左心室几何形态²¹。这些改变可导致心输出量和左心室射血分数（LVEF）下降，进而引起循环系统的血流动力学紊乱²²。因此，建立一种高效、稳定且经济的右心衰竭（RVF）机制研究模型具有重要价值。

我们开发了一种更有效且高度可重复的经导管肺动脉缩窄（PAC）方法，使用自制的锁扣和垫片针。自制的锁扣可更轻松地分离主动脉和肺动脉干，从而降低动脉破裂的风险，并提高手术成功率。通过选择不同直径的垫片针，我们诱导出不同程度的右心室肥厚。

尽管本文所述肺动脉干束窄术的一般操作步骤与既往文献报道相似^4,9,10,14,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ALC-V8S 呼吸机	SHANGHAI  ALCOTT  BIOTECH  CO	ALC-V8S	辅助通气
动物微型呼吸机	Haverd	型号 845	辅助通气
动物超声系统 VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	超声心动图
冷光源照明器	Olympus	ILD-2	照明
恒温手术垫系统（ALC-HTP-S1）	SHANGHAI  ALCOTT  BIOTECH  CO	ALC-HTP-S1	加热
异氟烷	RWD 生命科学	R510-22	吸入麻醉
Matrx VIP 3000 异氟烷蒸发器	Midmark Corporation	VIP 3000	麻醉
医用编织丝线缝合线（6-0）	上海浦东金环医疗用品有限公司	6-0	结扎
医用尼龙缝合线（5-0）	宁波医用针厂有限公司	5-0	缝合
Millar 导管（1.0 F）	AD instruments	1.0F	用于右心导管插入术
戊巴比妥钠盐	Merck	25MG	麻醉
PowerLab 多通道生理信号记录系统	AD instruments	4/35	记录右心导管插入术结果
精密电子天平	Denver Instrument	TB-114	称重传感器
自制钩针			分离主动脉和肺动脉干
自制垫针			缩窄
自制气管插管			气管插管
小型动物显微外科设备	Napox	MA-65	手术器械
传导凝胶	广工牌	250ML	超声心动图
Veet 脱毛膏	利洁时集团（Reckitt Benckiser）	RQ/B 33 型号 2	去除小鼠体毛
立式自动电热压力蒸汽灭菌器	合肥华泰医疗设备有限公司	LX-B50L	自动清洁手术器械
立式小型动物手术显微镜	一华光学仪器	Y-HX-4A	用于右心导管插入术