本方案详细描述了一种将编码突变人源tau蛋白的慢病毒载体转导至人神经元培养物中的实验方法。经转导的培养物可出现tau蛋白聚集物及相关病理学特征。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白tau的异常聚集在包括阿尔茨海默病（AD）在内的多种神经退行性疾病中具有致病作用。尽管tau蛋白病的小鼠模型为研究聚集态tau的神经毒性机制提供了宝贵的资源，但越来越多的证据表明，由于物种间神经生理学的差异，小鼠大脑并不适合模拟人类疾病状态。细胞培养技术的进步使得人类神经元培养物可在体外实验中被获取，并促进了神经治疗药物的开发。然而，尽管已建立了人类神经元细胞培养体系，目前仍缺乏广泛应用的体外人类tau蛋白病模型。本方案描述了一种tau蛋白聚集的细胞模型，其中人类神经元被转导携带编码致病性突变tau蛋白的慢病毒载体，该tau蛋白与黄色荧光蛋白（YFP）报告分子融合。转导后的神经元培养物可形成tau蛋白聚集体，可被硫黄素染色阳性标记，并表现出神经毒性的相关特征，例如轴突长度减少和溶酶体体积增大。该方法可能是一种研究人类tau蛋白病的有用且经济高效的模型。
引言
微管相关蛋白tau的病理性聚集是多种神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病（AD）、额颞叶痴呆（FTD）、皮克病和进行性核上性麻痹（PSP））的典型特征1。在非疾病状态下，tau蛋白可结合并稳定神经元轴突中的微管纤维2。然而，与疾病相关的tau蛋白过度磷酸化会促进其聚集、脱离微管，并导致神经元毒性3。聚集态tau蛋白的毒性作用可能涉及胆碱能4和谷氨酸能受体5的异常激活，从而引起细胞内钙离子稳态失调，并最终导致细胞死亡。在动物模型中，降低脑内tau蛋白水平可改善阿尔茨海默病小鼠6以及反复轻度创伤性脑损伤小鼠模型7的病理表现。
越来越多的证据表明，小鼠来源的tau蛋白在结构和结合亲和力方面与人源tau蛋白存在差异，且小鼠tau蛋白不适合用于模拟人类tau蛋白病8。然而，目前 commercially 可获得的人类细胞tau蛋白病模型尚不广泛。本研究的总体目标是建立一种体外tau蛋白聚集模型，其中人源神经元被转导携带突变人源tau构建体的慢病毒载体9。诱导tau蛋....
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方案
1. 培养基与试剂的准备
- 在 4 °C 下解冻用于培养板包被的基底膜基质（切勿使基底膜基质升温，否则会凝固）。分装为 1 mL 等份，保存于 -20 °C 或 -70 °C。
- 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）重悬至 10 µg/mL，并分装为 10 µL 等份，于 4 °C 保存。
- 向一个新开封的 500 mL 含谷氨酰胺的 DMEM/F12 培养基中加入 B27（10 mL）、N2（5 mL）和青霉素-链霉素（5 mL）。取 50 mL 此神经干细胞（NSC）培养基置于锥形管中，加入 10 µL 的 10 µg/µL bFGF（终浓度为 2 µg/mL）。将添加了 bFGF 的 NSC 培养基（NSC (+)bFGF）于 4 °C 保存。
- 制备不含 bFGF 的培养基（(-)bFGF 培养基）时，采用与步骤 1.3 相同的配方，但不添加 bFGF。该培养基用于诱导神经干细胞向神经元分化，并用于分化后神经元培养物的维持。
2. 慢病毒载体构建
注意：在开始使用慢病毒载体之前，需确保实验室已获得使用生物安全二级（BSL-2）试剂的许可。此外，操作慢病毒载体时必须使用生物安全二级（BSL-2）的超净工作台、个人防护装备（PPE）以及相应的废弃物处理方法。
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结果
经 Tau-RDLM-YFP 转导的神经元通过 YFP 进行了荧光标记，而 RDLM 转导的培养物在转导后出现聚集物。这些包涵体对硫黄素呈阳性染色（图1）。如图1所示，本方案可获得呈现硫黄素阳性 tau 蛋白聚集物的神经元培养物。在初始实验中，建议通过免疫标记神经元特异性标志物 β-微管蛋白 III 来确认神经元的分化。重要的是，荧光标记的二抗应选择激发/发射光谱不与 YFP 重叠的染料（例如 Cy3）。尽管在未染色的情况下即可观察到黄色荧光的 tau 聚集体，但仍建议使用硫黄素进行成像，以确认荧光信号来源于聚集的 tau 蛋白，而非细胞碎片。此外，图1中的示例未包含 DAPI 染色以标记细胞核，因为 DAPI 的激发/发射光谱与硫黄素-S 重叠；如需同时显示细胞核，应选用其他与硫黄素-S 兼容的核染料。
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讨论
本方案描述了一种体外人源tau蛋白病模型的建立方法，该模型可形成银染阳性聚集物和硫黄素阳性神经原纤维缠结（NFTs）。此外，转导后的细胞表现出tau蛋白诱导的病理特征，如形态学缺陷、突触生成减少以及溶酶体体积增大。本方案的主要优势在于提供了一种易于获取且成本较低的神经元tau蛋白病模型，可用于药物筛选研究以及tau蛋白毒性的分析。该模型填补了神经退行性疾病研究中的材料需求空白，因为目前人源tau蛋白病细胞系尚未广泛可得，而使用来源于小鼠神经元的转基因tau蛋白则需要动物繁育，且受限于不同物种间神经元特性的差异。
除了上述步骤外，本实验的成功还依赖于若干关键步骤。首先，必须确保使用正确的病毒滴度，因为如果病毒滴度太低，细胞培养物将无法形成聚集体。其次，应妥善维持神经干细胞（NSC）培养物，并确保其融合度不超过约80%。NSC过度生长会导致过早分化。最后，在从NSC中撤除bFGF培养基后，需等待整整4周，以使神经元培养物充分分化。这一时间长度对于确保神经元的成熟至关重要。
尽管上述方法是构建体外tau蛋白病模型的有效手段，但该方案.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院的 Peter Davies 博士提供 PHF-1 和 CP13 抗体，以及德克萨斯大学西南医学中心的 Marc Diamond 博士提供 tau 蛋白表达质粒。本研究工作获得了阿尔茨海默病协会（项目编号：NIRG-14-322164）向 S.H.Y. 提供的资助，以及加州再生医学研究所（项目编号：TB1-01193）向 P.R. 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cm 培养皿 | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 mL 离心管 | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% 多聚甲醛 | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 孔细胞培养板 | Thermofisher | 930186 | |
| 50 mL 离心管 | Biopioneer | CNT-50 | |
| 喷雾瓶中的 70% 乙醇 | 多种来源 | NA | |
| B27 添加剂 | Thermofisher | 17504044 | |
| 基底膜基质（Matrigel） | Corning | 356231 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | Biopioneer | HRP-0011 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7906 | |
| 细胞培养孵箱 | 多种来源 | NA | |
| 离心机 | 多种来源 | NA | |
| 含谷氨酰胺的 DMEM-F12 培养基 | Thermofisher | 10565042 | |
| 乙醇（浓度 50% 或更高） | 多种来源 | NA | |
| 荧光标记的二抗 | 多种来源，依实验而定 | NA | |
| 荧光显微镜 | 多种来源 | NA | |
| 玻璃盖玻片 | Thermofisher | 1254581 | |
| 载玻片 | Thermofisher | 12-550-15 | |
| 人神经干细胞 | 多种来源 | NA | |
| 慢病毒载体 | 多种来源 | 定制 | |
| 封片剂 | Thermofisher | P36934 | |
| N2 添加剂 | Thermofisher | 17502048 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermofisher | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Thermofisher | 14190250 | |
| 一抗 | 多种来源，依实验而定 | NA | |
| 摇床或旋转平台 | 多种来源 | NA | |
| 无菌细胞培养操作台 | 多种来源 | NA | |
| 硫黄素 S | Sigma | T1892-25G | |
| 吐温 X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| 水浴锅 | 多种来源 | NA |
参考文献
- Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
- Kadavath, H., et al.
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重印与许可
