方法文章

一种利用慢病毒介导的人类神经元转导研究 Tau 蛋白聚集的体外模型

DOI：

10.3791/59433

⸱

2019年5月23日

 ,  ,  , 
1Department of Neurosciences, University of California, San Diego

本文内容

摘要

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本方案详细描述了一种将编码突变人源tau蛋白的慢病毒载体转导至人神经元培养物中的实验方法。经转导的培养物可出现tau蛋白聚集物及相关病理学特征。

摘要

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蛋白tau的异常聚集在包括阿尔茨海默病（AD）在内的多种神经退行性疾病中具有致病作用。尽管tau蛋白病的小鼠模型为研究聚集态tau的神经毒性机制提供了宝贵的资源，但越来越多的证据表明，由于物种间神经生理学的差异，小鼠大脑并不适合模拟人类疾病状态。细胞培养技术的进步使得人类神经元培养物可在体外实验中被获取，并促进了神经治疗药物的开发。然而，尽管已建立了人类神经元细胞培养体系，目前仍缺乏广泛应用的体外人类tau蛋白病模型。本方案描述了一种tau蛋白聚集的细胞模型，其中人类神经元被转导携带编码致病性突变tau蛋白的慢病毒载体，该tau蛋白与黄色荧光蛋白（YFP）报告分子融合。转导后的神经元培养物可形成tau蛋白聚集体，可被硫黄素染色阳性标记，并表现出神经毒性的相关特征，例如轴突长度减少和溶酶体体积增大。该方法可能是一种研究人类tau蛋白病的有用且经济高效的模型。

引言

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微管相关蛋白tau的病理性聚集是多种神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病（AD）、额颞叶痴呆（FTD）、皮克病和进行性核上性麻痹（PSP））的典型特征1。在非疾病状态下，tau蛋白可结合并稳定神经元轴突中的微管纤维2。然而，与疾病相关的tau蛋白过度磷酸化会促进其聚集、脱离微管，并导致神经元毒性3。聚集态tau蛋白的毒性作用可能涉及胆碱能4和谷氨酸能受体5的异常激活，从而引起细胞内钙离子稳态失调，并最终导致细胞死亡。在动物模型中，降低脑内tau蛋白水平可改善阿尔茨海默病小鼠6以及反复轻度创伤性脑损伤小鼠模型7的病理表现。

越来越多的证据表明，小鼠来源的tau蛋白在结构和结合亲和力方面与人源tau蛋白存在差异，且小鼠tau蛋白不适合用于模拟人类tau蛋白病8。然而，目前 commercially 可获得的人类细胞tau蛋白病模型尚不广泛。本研究的总体目标是建立一种体外tau蛋白聚集模型，其中人源神经元被转导携带突变人源tau构建体的慢病毒载体9。诱导tau蛋白聚集的慢病毒构建体编码含有P301L和V337M突变的tau重复结构域，并与YFP报告基因融合（Tau-RDLM-YFP），而对照构建体则编码野生型（Wt）tau重复结构域与YFP报告基因的融合蛋白（Tau-Wt-YFP）。采用该方法转导的神经元培养物中tau蛋白表达量约为未转导培养物的九倍。尽管Tau-RDLM-YFP和Tau-Wt-YFP转导细胞中tau蛋白的过表达水平大致相等，但仅有转导了Tau-RDLM-YFP的神经元出现蛋白聚集。使用Tau-RDLM-YFP转导的培养物对硫黄素染色呈阳性，并表现出轴突长度缩短和突触密度降低。因此，该细胞模型可能成为研究体外tau蛋白聚集的有用工具。

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方案

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1. 培养基与试剂的准备

  1. 在 4 °C 下解冻用于培养板包被的基底膜基质（切勿使基底膜基质升温，否则会凝固）。分装为 1 mL 等份，保存于 -20 °C 或 -70 °C。
  2. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）重悬至 10 µg/mL，并分装为 10 µL 等份，于 4 °C 保存。
  3. 向一个新开封的 500 mL 含谷氨酰胺的 DMEM/F12 培养基中加入 B27（10 mL）、N2（5 mL）和青霉素-链霉素（5 mL）。取 50 mL 此神经干细胞（NSC）培养基置于锥形管中，加入 10 µL 的 10 µg/µL bFGF（终浓度为 2 µg/mL）。将添加了 bFGF 的 NSC 培养基（NSC (+)bFGF）于 4 °C 保存。
  4. 制备不含 bFGF 的培养基（(-)bFGF 培养基）时，采用与步骤 1.3 相同的配方，但不添加 bFGF。该培养基用于诱导神经干细胞向神经元分化，并用于分化后神经元培养物的维持。

2. 慢病毒载体构建

注意：在开始使用慢病毒载体之前，需确保实验室已获得使用生物安全二级（BSL-2）试剂的许可。此外，操作慢病毒载体时必须使用生物安全二级（BSL-2）的超净工作台、个人防护装备（PPE）以及相应的废弃物处理方法。

  1. 从首选来源获取包装在慢病毒中的 tau 载体（有关载体信息，请参见 Sanders 等人10）。

3. 培养人类神经干细胞

注意： NSCs 通常以每平方厘米 100,000–150,000 个细胞的密度接种2 且大多数市售的NSCs以1 x 106 细胞/管。本方案已针对10 cm细胞培养皿进行优化（尽管也可使用其他规格的培养皿）；因此，若使用商业化获得的NSCs，则可能需要先在六孔板中进行扩增培养，以获得足够数量的细胞用于接种10 cm培养皿。本方案亦可适用于多种规格的细胞培养皿（但不包含NSCs传代操作的说明，相关方案可参见其他文献）。11,12).

  1. 准备细胞培养板时，取出一份冻存的基底膜基质涂层，置于 4 °C 下解冻（可在接种细胞的前一天晚上将分装样品置于 4 °C 过夜）。将 385 µL 基底膜基质涂层加入 5 mL DMEM/F12 培养基 + 青霉素-链霉素中。
    注意：    5 mL DMEM/F12 培养基 + 青霉素-链霉素足以包被一个 10 cm 培养皿（该基底膜基质包被液 1 mL 可包被六孔板的一个孔）。或者，若需对细胞进行固定和免疫染色，或硫黄素染色，则将细胞培养于 24 孔板中的玻璃盖玻片上。
    1. 在将培养基和基质涂层加入培养皿前及操作过程中，均应保持其低温状态。将基底膜基质涂层加入培养皿后，置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。为获得最佳包被效果，孵育时间不得超过或少于 1 小时。1 小时后，吸除细胞培养皿中的基底膜基质涂层。确保此步骤与神经干细胞（NSCs）准备接种的时间相匹配。
      注意：若细胞非从冻存状态复苏，则跳过步骤 3.2，继续进行步骤 3.3。
  2. 若从冻存的神经干细胞（NSC）库存中复苏细胞，取一管冻存细胞，在 37 °C 水浴中通过来回移动使其快速升温。解冻后，用 70% 乙醇喷洒管体，并将其转移至细胞培养超净台中。将细胞转移至约 10 mL DMEM/F12 + 青霉素-链霉素培养基中，在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，将细胞重悬于 NSC 培养基中。
  3. 用 NSC 培养基稀释细胞，以获得适用于所用细胞培养容器的合适接种密度。
    注意：例如，若将神经干细胞（NSCs）接种至六孔板中——六孔培养板每孔表面积为 9 cm2——需接种 900,000 至 1,350,000 个细胞。因此，含有 1,000,000 个细胞的一管细胞可重悬于 2 mL 培养基中，加入六孔板的一个孔中。
  4. 将适量悬浮于 NSC 培养基中的细胞接种至已包被基底膜基质的培养皿中（接种密度为 100,000 个细胞/cm2），并每隔一天更换一次培养基（若使用冻存细胞，接种后次日更换培养基，之后每隔一天更换一次）。培养细胞至其融合度达到 75%–80%。
    注意：细胞在接种后不久可能即达到 75%–80% 融合度，但若使用冻存细胞，可能需要更长时间。
  5. 当神经干细胞（NSCs）融合度达到 75%–80% 时，开始神经元分化：移除含 bFGF 的 NSC 培养基（NSC (+)bFGF），更换为不含 bFGF 的 NSC 培养基（NSC (-)bFGF）。在此培养基中继续培养细胞（每隔一天更换一次培养基），至少持续 4 周。
    注意：撤除 bFGF 后，细胞仍会继续分裂数天，因此细胞融合度可能达到 90–100%。经过 4 周培养后，细胞将获得神经元命运，可进行慢病毒处理。

4. 神经元培养物的转导与维持

  1. 使用慢病毒转导神经元时，采用每细胞 3.4 × 105 可转导单位的滴度（一个100%汇合的10 cm培养皿约含有1000万个神经元）。将可转导单位用细胞培养基稀释至所需浓度后加入细胞中（使用细胞培养皿的正常培养基体积）。加入慢病毒两天后，用新鲜的不含bFGF培养基（不含慢病毒）洗涤细胞一次，并继续在不含bFGF培养基中常规培养。
  2. 慢病毒转导后的处理：每隔一天更换一次细胞培养基（[-]bFGF培养基）以喂养转导后的神经元。转导后维持细胞培养约8周。定期在光学显微镜下观察细胞，以确保细胞存活。
    注意：细胞稀疏或树突断裂是细胞失去活性的征兆。

5. 细胞成像

  1. 活细胞成像
    1. 转导后（加入慢病毒4天后），在具备活细胞成像功能的荧光显微镜下观察YFP信号。将细胞培养皿从培养箱中取出，并通过保持培养皿盖在上方来确保培养孔保持无菌状态。使用10倍物镜，激发波长约514 nm，发射滤光片约527 nm，对细胞进行成像。
      注意：在施加慢病毒后6–8天，转导的细胞培养物中通常可见聚集体。
  2. 固定细胞染色（β-微管蛋白III标记与硫黄素染色）
    1. 为用多聚甲醛（PFA）固定细胞，移除生长在玻璃盖玻片上的转导神经元的培养基。用PBS洗涤细胞1次，弃去洗涤液，然后向盖玻片加入300–500 µL（若使用24孔板）4% PFA（溶于PBS中），室温孵育20分钟。移除PFA后，用PBS洗涤盖玻片2次。
    2. 配制封闭液，包含PBS、3%牛血清白蛋白（BSA）和0.3% Triton X-100。向各孔加入300–500 µL封闭液，将盖玻片在4 °C孵育2小时。2小时后，将一抗（抗体稀释比例为1:500）用封闭液稀释，并向每孔加入300–500 µL一抗溶液。将培养板置于摇床或旋转平台（低速）上，4 °C孵育过夜。
    3. 次日，移除一抗溶液，用PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟。将二抗用封闭缓冲液稀释（稀释比例为1:1,000），并向每孔加入二抗溶液。选择合适的二抗时，应使用荧光标记不与YFP信号重叠的二抗（例如CY-3）。将细胞置于摇床或旋转平台上，室温孵育2小时。2小时后，移除二抗溶液，用PBS洗涤盖玻片3次，每次10分钟。
    4. 用双蒸水（DDW）洗涤盖玻片10分钟。移除DDW后，向每孔加入300 µL 0.015%硫黄素-S（溶于50%乙醇中），孵育10分钟。移除硫黄素溶液后，用50%乙醇洗涤盖玻片2次，每次4分钟；随后用30%乙醇洗涤1次，4分钟；再用30%乙醇洗涤2次，每次5分钟。在封片前，用DDW洗涤盖玻片1次。
      注意：步骤5.2.4中描述的硫黄素染色为可选步骤。
    5. 将盖玻片封固于载玻片上时，取一滴封片介质滴加在载玻片的“+”面。移除含玻璃盖玻片孔中的所有液体，用精细镊子小心取出盖玻片，并注意记录哪一侧为培养细胞面。
    6. 用镊子夹住盖玻片，轻轻将其边缘接触Kimwipe纸以去除多余水分。仍用镊子夹持盖玻片，使细胞面朝向封片介质液滴，先将盖玻片边缘接触液滴，然后轻轻将盖玻片放置于封片介质上（使培养的细胞进入封片介质中，并夹在盖玻片与载玻片之间）。让封片介质在成像前硬化30分钟。载玻片可于-20 °C保存以供后续使用。
    7. 使用荧光显微镜及相应的激发/发射光谱（YFP = ~514/527 nm，CY-3 = ~555/568 nm，硫黄素S = ~390/426 nm）对细胞进行成像。

6. 可选方法

  1. 每隔2天，从培养物中收集条件培养基，并于 -20 °C 保存，用于后续分析培养物释放的tau蛋白亚型。

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结果

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经Tau-RDLM-YFP转导的神经元通过YFP进行荧光标记，而RDLM转导的培养物在转导后出现聚集物。这些包涵体经硫黄素染色呈阳性（图1）。如图1所示，本方案可获得呈现硫黄素阳性tau蛋白聚集物的神经元培养物。在初始实验中，建议通过免疫标记神经元特异性标志物β-微管蛋白III来确认神经元的分化情况。重要的是，所使用的荧光标记二抗的激发/发射光谱不应与YFP重叠（例如可选用Cy3）。尽管在未染色的情况下也可观察到黄色荧光的tau蛋白聚集物，但仍建议使用硫黄素进行成像，以确认荧光信号来源于聚集的tau蛋白，而非细胞碎片。此外，图1中的示例未包含DAPI染色以标记细胞核，因为DAPI的激发/发射光谱与硫黄素-S存在重叠；如需同时显示细胞核，应选用其他与硫黄素-S兼容的核染料。

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讨论

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本方案描述了一种体外人源tau蛋白病模型的建立方法，该模型可形成银染阳性聚集物和硫黄素阳性神经原纤维缠结（NFTs）。此外，转导后的细胞表现出tau蛋白诱导的病理特征，如形态学缺陷、突触生成减少以及溶酶体体积增大。本方案的主要优势在于提供了一种易于获取且成本较低的神经元tau蛋白病模型，可用于药物筛选研究以及tau蛋白毒性的分析。该模型填补了神经退行性疾病研究中的材料需求空白，因为目前人源tau蛋白病细胞系尚未广泛可得，而使用来源于小鼠神经元的转基因tau蛋白则需要动物繁育，且受限于不同物种间神经元特性的差异。

除了上述步骤外，本实验的成功还依赖于若干关键步骤。首先，必须确保使用正确的病毒滴度，因为如果病毒滴度太低，细胞培养物将无法形成聚集体。其次，应妥善维持神经干细胞（NSC）培养物，并确保其融合度不超过约80%。NSC过度生长会导致过早分化。最后，在从NSC中撤除bFGF培养基后，需等待整整4周，以使神经元培养物充分分化。这一时间长度对于确保神经元的成熟至关重要。

尽管上述方法是构建体外tau蛋白病模型的有效手段，但该方案...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者谨此感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院的 Peter Davies 博士提供 PHF-1 和 CP13 抗体，以及德克萨斯大学西南医学中心的 Marc Diamond 博士提供 tau 蛋白表达质粒。本研究工作获得了阿尔茨海默病协会（项目编号：NIRG-14-322164）向 S.H.Y. 提供的资助，以及加州再生医学研究所（项目编号：TB1-01193）向 P.R. 提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 cm 培养皿Thermofisher12556002
15 mL 离心管BiopioneerCNT-15
16% 多聚甲醛Thermofisher50-980-487
24 孔细胞培养板Thermofisher930186
50 mL 离心管BiopioneerCNT-50
喷雾瓶中的 70% 乙醇多种来源NA
B27 添加剂Thermofisher17504044
基底膜基质（Matrigel）Corning356231
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）BiopioneerHRP-0011
牛血清白蛋白SigmaA7906
细胞培养孵箱多种来源NA
离心机多种来源NA
含谷氨酰胺的 DMEM-F12 培养基Thermofisher10565042
乙醇（浓度 50% 或更高）多种来源NA
荧光标记的二抗多种来源，依实验而定NA
荧光显微镜多种来源NA
玻璃盖玻片Thermofisher1254581
载玻片Thermofisher12-550-15
人神经干细胞多种来源NA
慢病毒载体多种来源定制
封片剂ThermofisherP36934
N2 添加剂Thermofisher17502048
青霉素-链霉素Thermofisher15140122
磷酸盐缓冲液Thermofisher14190250
一抗多种来源，依实验而定NA
摇床或旋转平台多种来源NA
无菌细胞培养操作台多种来源NA
硫黄素 SSigmaT1892-25G
吐温 X-100ThermofisherBP151-100
水浴锅多种来源NA

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
  2. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
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  4. Gomez-Ramos, A., et al. Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).
  5. Warmus, B. A., et al. Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).
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  7. Cheng, J. S., et al. Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLOS ONE. 9 (12), e115765(2014).
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  10. Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species. The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).
  11. Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLOS ONE. 6 (3), e17540(2011).
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