斑马鱼手术尺寸缩小术中胚胎形态缩放的研究

摘要

在这里, 我们描述了一种在不破坏正常发育过程的情况下减小斑马鱼胚胎大小的方法。这种技术可以研究模式缩放和针对大小变化的开发鲁棒性。

摘要

在发育过程中, 胚胎表现出显著的能力, 使他们的身体模式与他们的身体大小相匹配;即使在较大或较小的胚胎中, 它们的身体比例也保持在一定范围内。虽然这种规模现象在一个多世纪以来引起了人们的注意, 但对其基本机制的了解有限, 部分原因是缺乏对不同大小胚胎发育动态的定量描述。为了克服这一限制, 我们开发了一种新的技术, 通过手术缩小斑马鱼胚胎的大小, 这对活体成像有很大的优势。我们证明, 在囊胚阶段分别平衡切除细胞和蛋黄后, 胚胎可以在合适的条件下迅速恢复, 发育成较小但原本正常的胚胎。由于这种技术不需要特殊的设备, 它很容易适应, 并可用于研究广泛的缩放问题, 包括形态原介导的模式的鲁棒性。

引言

科学家们早就知道, 胚胎有一个显着的能力, 形成恒定的身体比例, 虽然胚胎大小可以很大的差异, 在自然和实验条件^下1^{, 2,3}。尽管几十年的理论和实验研究, 这种鲁棒性的大小变化, 称为缩放, 其潜在的机制仍然是未知的许多组织和器官。为了直接捕捉开发系统的动力学, 我们在斑马鱼⁴中建立了一种可重复、简单的尺寸缩小技术, 在活体成像⁵中具有很大的优势。

斑马鱼曾作为脊椎动物的模型, 研究生物学的多个学科, 包括发育生物学。特别是, 斑马鱼是体内活体成像的理想选择^,因为 1) 发育可以在母亲和蛋壳之外正常进行, 2) 胚胎是透明的。此外, 胚胎还能承受一定的温度和环境波动, 从而能够在实验室条件下进行研究。此外, 除了常规基因表达摄动的吗啡和 mrna 注射^7,8, 最近的进展 crispr/cas9 技术使反向遗传学在斑马鱼高效⁹。此外, 胚胎学中的许多经典技术, 如细胞移植或组织手术, ....

方案

所有与鱼类有关的程序都是在哈佛医学院动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准下进行的。

1. 工具和试剂制备

1. 做一个钢丝圈来切割胚胎
   1. 取20厘米的不锈钢丝, 它坚硬且无腐蚀性, 直径为40μm。将电线循环到玻璃毛细管中 (外径 1.0 mm, 内径 0.5 mm, 无长丝), 使顶部有一个小循环 (环路长度为 1.0 mm)
   2. 在钢丝圈之间的玻璃毛细管尖端放一点透明的指甲油, 将其固定到位。让它干。一定不要在环路部分涂上指甲油, 因为它可能会损害胚胎。
   3. 用实验室胶带将玻璃毛细管与环路连接在木制筷子上 (9 "竹一次性筷子被撕成两半)。离开约2.5 厘米的玻璃毛细管延伸到筷子以外, 使筷子部分的工具不会浸入水中。将此长度调整为首选项。
2. 或者, 做一个玻璃针切割胚胎
   1. 用钳子夹住玻璃巴斯德移液器的一端, 同时用手握住另一端。在精神灯或本森燃烧器上加热移液器的薄部分。
   2. 手拉玻璃移液器。理想的移液器直径约为30微米和曲线柔和 (曲率半径 = 约5毫米)。通过实践和一定的机会, 得到了合适的直径和曲率。
3. 准备甲基纤维素

结果

蛋黄体积减少对正常形态很重要
正如最近在 Almuedo-castylo 等人 17中所描述的, 在不减少蛋黄体积的情况下, 可以减少胚胎的大小。为了与蛋黄体积减少和不减少, 我们执行了两步切碎 (包括囊胚和蛋黄) 和只切碎 (图 2和补充电影 1)。与对照 (仅 dechorionation) 相比, 两步切碎的胚胎在整个发育阶段显示出看似正常的整体形态 (大小差异除外) (见图 2中的顶部和中间面板)。另一方面, 仅有囊胚的胚胎表现出一种特殊的形态, 尤其是在早期阶段。在上皮化过程中, 胚胎有收缩和缩进的外观 (参见图 2中70% 的上皮的底部面板)。在接下来的微结构阶段, 发现中线结构在许多轴向水平上被压平 (即 DV 长度相对小于 ML 长度) (参见图 2中8和20体细胞.......

讨论

从历史上看, 在脊椎动物中, 大小缩小主要是使用两栖动物胚胎, 在第12条阶段沿动物-植物轴将胚胎一分为二.然而, 当我们将青蛙和斑马鱼胚胎一分为二时, 主要有两个区别。首先, 在斑马鱼胚胎耐受分分割 (囊胚阶段) 的阶段, 组织者位于^{脂肪边缘 18、19、20、21 的}禁区内。因为不能从胚胎的形态中分辨出组织者的位置, 所以沿着动物-植物轴随机切割胚胎会产生背生或腹形胚胎。其次, 与青蛙胚胎不同的是, 斑马鱼胚胎经历了一个叫做表皮的过程, 在这个过程中, 细胞在分离的蛋黄周围向植物极点移动, 直到它被细胞完全包围。如果只去除一部分囊胚, 那么较少的细胞仍然会吞没体积相对较大的蛋黄, 因此, 在表观形成后, 形态会出现影响。因此, 我们采用两步切碎, 在动物杆附近切碎囊胚, 以避.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
60 mm PYREX 培养皿	CORNING&	nbsp;3160-60
琼脂糖	affymetrix	75817	用于制作实时成像的支架
琼脂糖，低胶凝温度 VII-A	SIGMA-ALDRICH	型 Cácl
2	EMD	CX0130-1	用于 1/3 林格溶液
CaSO4			用于鸡蛋水
盖玻片（25 mm x 25 mm，厚度 1）	康宁	2845-25
一次性刮刀	VWR	80081-188
泡沫板	ELMER'S	951300	用于显微镜培养箱
Forcept （No 55）	FST	11255-20
玻璃移液器	VWR	14673-043
HEPES	SIGMA 生命科学	H4034	用于 1/3 林格溶液
INCUKIT XL 用于橱柜式培养箱	培养箱 Warehouse.com		用于显微镜培养箱
速溶海盐	Instant Ocean	138510	用于蛋水
KCl	SIGMA-ALDRICH	P4504	用于 1/3 林格溶液
甲基纤维素	SIGMA-ALDRICH	M0387-100G
NaCl	SIGMA-ALDRICH	S7653	用于 1/3 林格液
培养皿	Falcon	351029	用于制作实时成像支架
酚红	SIGMA Life Science	P0290
移液器泵	BEL-ART PRODUCTS	F37898
链霉蛋白酶	EMD Millipore Corp	53702-250KU
三卡因-S （MS222）	WESTERN CHEMICAL INC
超薄光亮退火 316L 直径 0.035 毫米 不锈钢编织线	Sandra		我们使用的电线是 ~20 年前获得的，我们找不到完全相同的电线。该产品的材料和直径与我们使用的相同。