需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

斑马鱼胚胎模式缩放研究的手术尺寸减小法

6.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59434

⸱

2019年5月3日

 ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, Harvard Medical School

本文内容

摘要

本文介绍一种在不干扰斑马鱼胚胎正常发育过程的前提下缩小其体积的方法。该技术可用于研究模式形成在尺寸变化下的比例调节以及发育过程对尺寸改变的稳健性。

摘要

在发育过程中，胚胎表现出一种显著的能力，即能够使其身体图式与身体大小相匹配；即使在一定范围内体积较大或较小的胚胎中，其身体比例仍能保持不变。尽管这种缩放现象已受到逾一个世纪的关注，但由于缺乏对不同大小胚胎发育动态的定量描述，人们对潜在机制的理解一直受到限制。为了克服这一局限，我们开发了一种新技术，可通过手术方式减小斑马鱼胚胎的体积，而斑马鱼在活体成像方面具有显著优势。我们证明，在囊胚阶段分步平衡地去除部分细胞和卵黄后，胚胎在适宜条件下能够迅速恢复，并发育成体积更小但其他方面正常的胚胎。由于该技术无需特殊设备，易于推广，可用于研究多种缩放相关问题，包括形态发生素介导的图式形成的稳健性。 

引言

长期以来，科学家们已知胚胎具有形成恒定身体比例的显著能力，尽管在自然条件和实验条件下胚胎大小可能存在很大差异1,2,3。尽管已有数十年的理论与实验研究，这种对大小变化的稳定性——称为比例缩放（scaling）——及其潜在机制在许多组织和器官中仍不清楚。为了直接捕捉发育系统的动态过程，我们在斑马鱼中建立了一种可重复且简单的尺寸减小技术4，该技术在活体成像方面具有显著优势5。

斑马鱼已被用作研究生物学多个领域的模式脊椎动物，包括发育生物学。特别是，斑马鱼非常适合进行活体实时成像6，原因如下：1）其发育可在母体外及卵壳外正常进行；2）胚胎具有透明性。此外，斑马鱼胚胎能够耐受一定程度的温度和环境波动，使其可在实验室条件下进行研究。除了通过吗啉代寡核苷酸（morpholino）和mRNA注射进行传统的基因表达干扰外7,8，近年来CRISPR/Cas9技术的进步使得斑马鱼的反向遗传学研究变得极为高效9。此外，许多经典的胚胎学技术，如细胞移植或组织手术，也可应用于斑马鱼研究4,10,11。

尺寸减小技术最初是在两栖动物和其他无脊椎动物中开发的12。例如，在另一种常用的脊椎动物模型Xenopus laevis中，于囊胚期沿动-植轴进行二等分可产生尺寸减小的胚胎12,13。然而，我们发现这种一步切割法在斑马鱼中会导致背侧化或腹侧化胚胎，这可能是由于背侧决定因子分布不均，且无法通过胚胎形态判断其定位。本文中，我们展示了一种适用于斑马鱼的替代性两步切割技术，可产生正常发育但体积更小的胚胎。该技术首先从动物极区域去除细胞，该区域为未分化细胞区，不具有组织者活性；随后为平衡卵黄与细胞的比例（这对外包运动及后续形态发生至关重要），再去除部分卵黄。本文详细描述了该实验方案，并提供了两个在图式形成中尺寸不变性的实例：体节形成和腹侧神经管图式建立。结合定量成像技术，我们利用尺寸减小方法研究了体节和神经管在尺寸减小胚胎中的大小变化情况。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有与鱼类相关的操作均经哈佛医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 工具和试剂准备

  1. 制作金属丝环以切割胚胎
    1. 取一段长度为 20 cm、质地坚硬且耐腐蚀的不锈钢丝，直径为 40 μm。将金属丝穿入玻璃毛细管（外径 1.0 mm，内径 0.5 mm，无纤维芯）中，在顶端形成一个小环（环的长度为 1.0 mm）
    2. 在玻璃毛细管尖端的金属丝环之间滴一小滴透明指甲油，以固定金属丝环。待其自然干燥。注意不要让指甲油沾到金属丝环部分，以免损伤胚胎。
    3. 使用实验室胶带将带有金属丝环的玻璃毛细管固定在一根木制筷子上（使用 9 英寸的一次性竹筷，折成两半），使玻璃毛细管末端伸出筷子约 2.5 cm，以确保使用时筷子部分不会浸入水中。可根据个人习惯调整该长度。
  2. 或者，制作玻璃针以切割胚胎
    1. 用镊子夹住玻璃巴斯德吸管的一端，另一端用手握住，将吸管较细的部分置于酒精灯或本生灯火焰上加热。
    2. 手动拉伸玻璃吸管。理想的吸管尖端直径约为 30 μm，并具有平缓的弯曲弧度（曲率半径约为 5 mm）。合适的直径和曲率需通过练习和经验逐步掌握。
  3. 准备甲基纤维素溶液
    1. 甲基纤维素用于在切割过程中固定胚胎。在 ⅓x 林格氏液（116 mM NaCl，2.9 mM KCl，1.8 mM CaCl2，5 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES；pH 7.2））中配制 2% 的甲基纤维素溶液。将甲基纤维素粉末加入 ⅓x 林格氏液中，于 4 °C 下振荡过夜。
    2. 可选：向 10 mL 2% 甲基纤维素溶液中加入约 1.5 mL 酚红（DPBS 中 0.5% 储备液），直至溶液呈红色，以便观察。持续振荡至颜色均匀。

2. 斑马鱼胚胎手术缩小尺寸的制备

  1. 收集胚胎
    1. 将一至两条雄性与一至两条雌性斑马鱼放入盛有大量水的交配盒中，使用塑料隔板将雄鱼和雌鱼分隔开。用于体节成像（第4节）时选用AB品系，用于神经管成像时选用神经管模式形成的转基因报告品系（nkx2.2:mem-gfp, dbx1b:gfp 或 Olig2:dsred）。将鱼留在交配盒中过夜。
      注意：成鱼的选择对于获得能够良好耐受手术的卵子至关重要。通常，年轻的健康雌鱼可产生健康的卵子。
    2. 次日早晨，将交配盒转移至浅水中，并使交配盒略微倾斜。移除隔板，使鱼类可以交配。
    3. 通过将水倒入茶筛来收集卵子。将卵子转移至含有卵水的培养皿中（20倍浓度卵水配方：6 g 瞬时海盐、1.5 g CaSO4 和 1 L H2O；使用时稀释为1倍浓度）。为了更准确地确定发育阶段，应在产卵后立即收集卵子。将胚胎置于28.5 °C的培养箱中培养。
    4. 如有必要，按照通用方案在1–4细胞期注射吗啉代寡核苷酸（morpholino）、mRNA等7,8。为进行神经管成像（第5节），注射编码荧光膜标记物的mRNA（mem-mCherry, mem-mBFP1 或 mem-mCitrine）。
  2. 使用蛋白酶去除卵膜
    1. 在约128细胞至256细胞期，将健康的胚胎转移至一个盛有卵水的35 mm玻璃培养皿中。尽可能吸除培养皿中的卵水。
    2. 加入1 mL浓度为20 mg/mL的蛋白酶溶液。通过移动培养皿轻轻晃动胚胎，并使用玻璃移液管轻轻吹打溶液，以促进去卵膜过程。
    3. 当卵膜开始失去弹性时（通常在加入蛋白酶后1–4分钟，具体时间取决于卵子数量和水量），尽可能加入卵水以稀释蛋白酶。用镊子轻轻触碰卵膜评估其弹性丧失情况；卵膜应能 保持压痕而不立即回弹。使用玻璃移液管将卵子转移至另一个盛有卵水的培养皿中（此时大多数卵膜尚未破裂）。
      1. 或者，可将胚胎从培养皿中轻轻倾倒至一个装有卵水的400 mL大玻璃烧杯中，过程中避免胚胎暴露于空气中。然后让胚胎完全沉降。倾斜烧杯使胚胎滑至一侧。使用玻璃移液管收集这些胚胎，并转移至另一个盛有⅓x Ringer溶液的35 mm玻璃培养皿中。
    4. 静置数分钟，直至大多数卵膜完全失去弹性。通过轻轻吹打将残留的卵膜从胚胎上去除。剔除受损的胚胎，并将健康胚胎置于28.5 °C培养箱中继续培养。

3. 外科尺寸缩小与恢复

  1. 准备一个干净的 35 mm 玻璃培养皿。用塑料刮刀将约 0.5 mL 的 2% 甲基纤维素（溶于 ⅓x Ringer 溶液，含酚红以便观察）涂抹在较大培养皿底部中央附近。将甲基纤维素薄而均匀地铺展至约 0.5 mm 厚度。
  2. 将约 30 mL 的 ⅓x Ringer 溶液沿培养皿侧壁加入，使其自然扩散至整个皿面，覆盖甲基纤维素区域。
  3. 将去壳膜的 256 细胞期至 1k 细胞期胚胎置于 2% 甲基纤维素上。调整胚胎方向使其侧置，以便同时观察细胞和卵黄。（图 1）
  4. 使用金属丝环（或玻璃针）沿动植物极轴垂直切割，切除胚盘靠近动物极约 30%–40% 的细胞（图 1，上图）。去除细胞后，轻轻敲击金属丝两端，促使剩余细胞重新贴合。数分钟内，死亡细胞将在胚胎开始愈合时脱落。
  5. 在植物极附近的卵黄处制造一个小伤口，而非“切碎”卵黄（图 1，中图）。使用固定好的金属丝划破卵膜以造成卵黄损伤。损伤后卵黄将持续渗出数分钟，随后伤口将自行愈合（图 1，下图）。
  6. 当卵黄停止渗出后，用移液器将胚胎从甲基纤维素区域移出至同一培养皿的其他位置，以利于其更好地恢复。
  7. 对所有胚胎重复步骤 3.4­–3.6。将培养皿静置 30 分钟，使胚胎恢复。
  8. 将胚胎转移至含有新鲜 ⅓x Ringer 溶液的新培养皿中，并置于 28.5 °C 培养箱中，使其完全恢复。
    1. （可选）若目标发育阶段为早期体节期，可在胚胎于 28.5 °C 培养至盾牌期后，转移至 20 °C 继续培养，以调整实验和成像的时间节点。

4. 斑马鱼体节形成过程的活体成像

  1. 通过将1 g琼脂糖加入100 mL卵水中，加热至琼脂糖完全溶解，制备100 mL的1%琼脂糖溶液。冷却5-10分钟，使温度降至62-72 °C。
  2. 准备用于成像的样品台。
    注意：    本指南适用于倒置宽场显微镜。
    1. 将约15 mL的1%琼脂糖倒入100 mm × 15 mm的塑料培养皿中。
    2. 将Dorsal Mount V1模具模板5轻轻放置在培养皿底部。使用重物（如装有水的15 mL离心管）将模具固定在底部。
      注意：这样可使胚胎尽可能靠近培养皿底部，适用于使用倒置显微镜观察。尽管在体节成像时胚胎为侧向固定，但此处使用Dorsal Mount V15，因其在早期体节阶段能更好地固定胚胎。
    3. 冷却至琼脂糖完全凝固。加入约30 mL含0.01%三卡因的卵水，并用镊子轻轻撬起，小心移除模具。
  3. 固定胚胎用于体节成像
    1. 使用⅓× Ringer溶液（或卵水）配制1%低熔点琼脂糖，并保持在42 °C。等待温度降至42 °C。
    2. 在解剖显微镜下，每个孔中放置一个胚胎。用移液器向孔中加入约1 μL低熔点琼脂糖，以精细调节孔的大小，使其适应不同大小的胚胎，尤其是存在或不存在体积减小的胚胎之间的差异。
    3. 在低熔点琼脂糖凝固前迅速调整胚胎方向，使其完全侧向朝向培养皿。固定胚胎后，轻轻将盖玻片置于琼脂糖固定装置上，以固定胚胎位置。此方向对于长期体节成像尤为重要，因为必须确保胚胎完全侧向固定，以便在后期清晰成像所有体节边界。
    4. 从固定区域移开并操作一块25 mm × 25 mm的盖玻片，使其相对于模具形成的方形凹槽呈45度偏移。以该方向将盖玻片滑过模具，直至每个角分别落在模具的不同侧边上。
      注意：尽管本方案用于倒置显微镜，但在模具上方放置盖玻片仍然重要，以防止在转移至显微镜过程中胚胎移动。
  4. 成像体节形成过程
    1. 使用泡沫板和柜式加热器构建的培养箱，将显微镜预热至28 °C。
    2. 将带有固定胚胎的培养皿放置在显微镜载物台上。先用低倍物镜找到琼脂糖固定装置左上角孔中的胚胎，然后切换至10倍物镜。
    3. 设置图像采集参数。
      注意： 本说明适用于明场成像。
    4. 调节光源功率、曝光时间和聚光镜条件，使体节边界清晰可见。使用z轴扫描设置所需的最低和最高成像平面。设定总时长和时间间隔。定位并记录所有固定胚胎的xy位置，以便同时对多个胚胎进行延时成像。
  5. 使用Fiji16测量PSM和体节的长度。

5. 神经管图式形成的成像

  1. 通过将1 g琼脂糖加入100 mL卵水中，加热至琼脂糖完全溶解，制备100 mL的1%琼脂糖溶液。冷却5–10分钟至62–72 °C。调节三卡因（tricaine）浓度至0.01%。
  2. 准备用于成像的背侧固定装置。
    注意：    本指南适用于直立式荧光显微镜。对于倒置显微镜，需使用盖玻片底培养皿，且第3步中的固定方向需反转。
    1. 将约15 mL的1%琼脂糖倒入100 mm × 15 mm的塑料培养皿中。将背侧固定模具V1轻轻漂浮于琼脂糖表面，避免引入气泡。待琼脂糖完全凝固。
    2. 用镊子或刀片小心取出模具。用含0.01%三卡因的卵水填充培养皿，并加盖保存至使用。
  3. 固定胚胎以进行神经管成像。
    1. 使转基因或显微注射后表达荧光、体型缩小的实验胚胎及对照组胚胎发育至20–25体节期（受精后约18–22小时）。用于成像的胚胎应表达荧光膜标记（mem-mCherry、mem-mBFP1或mem-mCitrine）以及神经管模式形成的转基因报告基因（nkx2.2:mem-gfp、dbx1b:gfp或Olig2:dsred）。
    2. 将预先准备的背侧固定装置中的卵水更换为含0.01%三卡因的工作液。用移液器轻柔地将待成像胚胎转移至背侧固定模具的孔洞中。
    3. 调整胚胎方向，使其头部朝前，尾部朝后，背侧朝向液面。
    4. 调整胚胎使尾部平放，而非向下倾斜指向培养皿底部。有时可将尾部后段轻置于固定孔边缘，以防止尾部下沉而误将后脑纳入成像区域。对每个胚胎重复此操作。确保体型缩小的胚胎不会过深陷入孔中而影响成像。
    5. 远离固定区域操作，手持25 mm × 25 mm盖玻片，使其方向相对于模具形成的方形凹槽偏转45°。在此角度下将盖玻片滑过模具，使四个角分别落在模具的四个侧边上。
    6. 缓慢旋转盖玻片，使其轻柔地覆盖在固定区域上。检查胚胎是否仍处于正确位置和方向。若盖玻片下落引起过多移动，应轻柔移除后从步骤C重新开始固定。
  4. 对发育中的脊髓进行三维成像。
    1. 轻柔地将含有固定胚胎的培养皿转移至共聚焦显微镜。若进行长时间活体成像，务必使用带温控的显微镜；否则，较低温度也可耐受。
    2. 在明场照明下定位待成像胚胎，并将视野中心对准所需的前后位置。为便于胚胎间的详细比较，每个胚胎上的该位置必须保持一致。
    3. 设置成像参数以激发并捕获目标荧光蛋白的信号。可通过肉眼调节初始样本的参数以获得理想的图像。为确保测量一致性，将这些参数应用于数据集中的所有胚胎。若需采集大量z轴层扫图像，应优化参数以提高速度。
    4. 使用z轴层扫设置，确定最低和最高的成像平面。为获得最佳z轴层扫图像质量，将z轴分辨率设为与孔径设置相匹配的最高值。通常使用1 μm的z轴间距即可获得良好图像。
  5. 采用任意合适的方法分析成像数据。
    注意：本实验中，数据分析使用定制的MATLAB脚本完成，该脚本可实现图像中神经区域的简单分割及荧光信号的定量分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

卵黄体积的减少对于正常形态至关重要
正如 Almuedo-Castillo 等人最近所述17，可以在不减少卵黄体积的情况下实现胚胎尺寸的缩小。为了比较是否减少卵黄体积的效果，我们分别进行了两步切割法（同时切割囊胚和卵黄）和仅切割囊胚法（图2 和 补充视频1）。与对照组（仅去壳）胚胎相比，两步切割的胚胎在整个发育阶段均表现出看似正常的整体形态，仅存在尺寸差异（见 图2 的上排和中排图示）。相反，仅切割囊胚的胚胎则表现出异常的形态，尤其是在早期阶段。在表层扩展过程中，这些胚胎呈现出收缩和凹陷的外观（见 图2 中70%表层扩展阶段的下排图示）。在随后的体节阶段，许多轴向水平的中线结构变得扁平化（即背腹轴长度相对于内外侧长度较短）（见 图2 中8体节和20体节阶段的下排图示）。在后期阶段...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

历史上，在脊椎动物中，体积缩小主要通过对囊胚期的两栖类胚胎沿动-植物极轴进行切割来实现12。然而，当我们对胚胎进行切割时，青蛙胚胎与斑马鱼胚胎之间存在两个主要差异。首先，在斑马鱼胚胎能够耐受切割的阶段（囊胚期），胚胎组织中心位于囊胚边缘的一个局限区域18,19,20,21。由于无法通过胚胎形态判断组织中心的位置，因此沿动-植物极轴随机切割会产生背侧化或腹侧化的胚胎。其次，与青蛙胚胎不同，斑马鱼胚胎会经历一种称为外包（epiboly）的过程，即细胞围绕分离的卵黄向植物极移动，直至完全包裹卵黄。如果仅移除部分胚盘，则剩余细胞数量较少，难以包裹相对体积较大的卵黄，结果导致外包完成后形态异常。因此，我们采用两步切割法：首先在动物极附近切割囊胚，以避免切除组织中心；同时损伤卵黄膜，使卵黄体...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在竞争性或经济利益。

致谢

本工作由日本科学技术振兴机构（JST）的PRESTO项目资助 (JPMJPR11AA)  美国国立卫生研究院基金（R01GM107733）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
60 mm PYREX 培养皿CORNING 3160-60
琼脂糖affymetrix75817用于制备活体成像用的封片
低凝胶温度琼脂糖，Type VII-ASIGMA-ALDRICHA0701-25G
CaCl2EMDCX0130-1用于配制1/3 Ringer's 溶液
CaSO4用于卵水配制
盖玻片（25 mm × 25 mm，厚度 1）CORNING2845-25
一次性刮勺VWR 80081-188
泡沫板ELMER'S951300用于显微镜培养箱
显微镊（No 55）FST11255-20
玻璃移液管VWR14673-043
HEPESSIGMA Life ScienceH4034用于配制1/3 Ringer's 溶液
INCUKIT XL 柜式培养箱组件INCUBATOR Warehouse.com用于显微镜培养箱
Instant sea 盐Instant Ocean138510用于卵水配制
KClSIGMA-ALDRICHP4504用于配制1/3 Ringer's 溶液
甲基纤维素SIGMA-ALDRICHM0387-100G
NaClSIGMA-ALDRICHS7653用于配制1/3 Ringer's 溶液
培养皿Falcon351029用于制备活体成像用的封片
酚红SIGMA Life ScienceP0290
移液器泵BEL-ART PRODUCTSF37898
蛋白酶 K（Pronase）EMD Millipore Corp53702-250KU
Tricaine-S（MS222）WESTERN CHEMICAL INCNC0135573
超细亮退火 316L 直径 0.035 mm 不锈钢编织丝Sandra我们所使用的金属丝约 20 年前获得，目前无法找到完全相同的型号。该产品与我们所用金属丝的材质和直径相同。

参考文献

  1. Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
  2. Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
  3. Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
  4. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
  5. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
  6. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217(2009).
  7. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  8. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113(2009).
  9. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394(2009).
  11. Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
  12. Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
  13. Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
  14. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
  15. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  17. Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
  18. Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
  19. Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
  20. Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
  21. Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

斑马鱼胚胎尺寸减小技术囊胚切割卵黄损伤胚胎恢复体节形成神经管比例调节活体成像甲基纤维素林格氏液
斑马鱼胚胎模式缩放研究的手术尺寸减小法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。