斑马鱼手术尺寸缩小术中胚胎形态缩放的研究

摘要

在这里, 我们描述了一种在不破坏正常发育过程的情况下减小斑马鱼胚胎大小的方法。这种技术可以研究模式缩放和针对大小变化的开发鲁棒性。

摘要

在发育过程中, 胚胎表现出显著的能力, 使他们的身体模式与他们的身体大小相匹配;即使在较大或较小的胚胎中, 它们的身体比例也保持在一定范围内。虽然这种规模现象在一个多世纪以来引起了人们的注意, 但对其基本机制的了解有限, 部分原因是缺乏对不同大小胚胎发育动态的定量描述。为了克服这一限制, 我们开发了一种新的技术, 通过手术缩小斑马鱼胚胎的大小, 这对活体成像有很大的优势。我们证明, 在囊胚阶段分别平衡切除细胞和蛋黄后, 胚胎可以在合适的条件下迅速恢复, 发育成较小但原本正常的胚胎。由于这种技术不需要特殊的设备, 它很容易适应, 并可用于研究广泛的缩放问题, 包括形态原介导的模式的鲁棒性。

引言

科学家们早就知道, 胚胎有一个显着的能力, 形成恒定的身体比例, 虽然胚胎大小可以很大的差异, 在自然和实验条件^下1^{, 2,3}。尽管几十年的理论和实验研究, 这种鲁棒性的大小变化, 称为缩放, 其潜在的机制仍然是未知的许多组织和器官。为了直接捕捉开发系统的动力学, 我们在斑马鱼⁴中建立了一种可重复、简单的尺寸缩小技术, 在活体成像⁵中具有很大的优势。

斑马鱼曾作为脊椎动物的模型, 研究生物学的多个学科, 包括发育生物学。特别是, 斑马鱼是体内活体成像的理想选择^,因为 1) 发育可以在母亲和蛋壳之外正常进行, 2) 胚胎是透明的。此外, 胚胎还能承受一定的温度和环境波动, 从而能够在实验室条件下进行研究。此外, 除了常规基因表达摄动的吗啡和 mrna 注射^7,8, 最近的进展 crispr/cas9 技术使反向遗传学在斑马鱼高效⁹。此外, 胚胎学中的许多经典技术, 如细胞移植或组织手术, 可以应用^4,10,11。

减少大小的技术最初是在两栖动物和其他非脊椎动物中开发的.例如, 在另一种流行的脊椎动物模型月子劳维斯, 在囊胚阶段沿着动物-植物轴进行混合, 可以产生大小减少的胚胎 12^,13.然而, 在我们手中, 这种一步的方法会导致斑马鱼的背化或腹形胚胎, 大概是因为背侧决定因素分布不均, 人们无法从胚胎的形态中知道它们的定位。在这里, 我们演示了另一种两步切碎技术的斑马鱼, 产生正常发育, 但较小的胚胎。有了这一技术, 细胞首先从动物极点中取出, 这是一个缺乏组织者活动的天真细胞区域。为了平衡蛋黄和细胞的数量, 蛋黄被去除, 这对上皮和随后的形态发生很重要。在这里, 我们详细介绍了这个协议, 并给出了模式形成中大小不变性的两个例子;体细胞形成和腹侧神经管模式。结合定量成像, 我们利用尺寸缩小技术, 考察了体细胞和神经管的大小在减少胚胎大小方面的影响。

方案

所有与鱼类有关的程序都是在哈佛医学院动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准下进行的。

1. 工具和试剂制备

1. 做一个钢丝圈来切割胚胎
   1. 取20厘米的不锈钢丝, 它坚硬且无腐蚀性, 直径为40μm。将电线循环到玻璃毛细管中 (外径 1.0 mm, 内径 0.5 mm, 无长丝), 使顶部有一个小循环 (环路长度为 1.0 mm)
   2. 在钢丝圈之间的玻璃毛细管尖端放一点透明的指甲油, 将其固定到位。让它干。一定不要在环路部分涂上指甲油, 因为它可能会损害胚胎。
   3. 用实验室胶带将玻璃毛细管与环路连接在木制筷子上 (9 "竹一次性筷子被撕成两半)。离开约2.5 厘米的玻璃毛细管延伸到筷子以外, 使筷子部分的工具不会浸入水中。将此长度调整为首选项。
2. 或者, 做一个玻璃针切割胚胎
   1. 用钳子夹住玻璃巴斯德移液器的一端, 同时用手握住另一端。在精神灯或本森燃烧器上加热移液器的薄部分。
   2. 手拉玻璃移液器。理想的移液器直径约为30微米和曲线柔和 (曲率半径 = 约5毫米)。通过实践和一定的机会, 得到了合适的直径和曲率。
3. 准备甲基纤维素
   1. 甲基纤维素用于在切碎时保持胚胎。在半环质溶液中制备2% 的甲基纤维素溶液 (116 Mm Ncl、2.9 mM KCl、1.8 mm CaCl₂和 5 mm 4-(2-羟乙基)-1-吡嗪-乙酰磺酸 (HIPES; ph 7.2))。在4°c 下隔夜摇晃甲基纤维素粉。
   2. (可选) 在10毫升2% 甲基纤维素溶液中添加 ~ 1.5 mL 苯酚红 (DPBS 库存溶液中的 0.5%), 直到红色, 使溶液可见。摇一摇, 直到颜色变得均匀。

2. 斑马鱼胚胎的制备, 用于缩小手术尺寸

1. 收集胚胎
   1. 将一、两只雄性和一、一、两只雌性斑马鱼放在充满大量水的交配室中。使用塑料分隔器将男性和女性分开。使用 AB 线进行体细胞成像 (第4节) 和用于神经管成像的神经管模式 (nkx2.2: mem-gfp、dbx1b: gfp 或 Olig2: dsred)的转基因记者线。把他们留在房间里过夜。
      请注意:成人的选择对于获得手术中存活良好的鸡蛋很重要。通常情况下, 年轻的健康雌性会产生健康的卵子。
   2. 第二天早上, 将房间转移到浅水中, 并将房间稍微倾斜。取下分隔线, 使鱼可以交配。
   3. 倒进茶过滤器中收集鸡蛋。用鸡蛋水将鸡蛋放入培养皿中 (20x 鸡蛋水、6克速份海盐、1.5 克 CaSO₄和 1 l_h2o;使用在 1x)。为了更好地进行分期, 产卵后立即收集鸡蛋。将胚胎放置在28.5°c 的孵化器中。
   4. 如有必要, 在遵循共同协议^7,8 的1-4 个细胞阶段注射吗啡、mrna 等.注入用于荧光膜标签的 mRNA (mem-mCherry、Mem-mbfp1或mem-mitrine) 用于神经管成像 (第5节)。
2. 使用原酶进行 dechorionate
   1. 在128细胞至256个细胞阶段, 将健康的胚胎转移到一个35毫米的玻璃盘子里, 里面装满了鸡蛋水。从盘子里取出尽可能多的鸡蛋水。
   2. 加入1毫升的 20 mgl 原化酶。通过移动盘子轻轻旋转胚胎, 并将溶液上下轻轻移液, 以帮助使用玻璃移液器进行旋转。
   3. 当脉络膜开始失去弹性 (通常在添加原酶后 1-4, 取决于鸡蛋和水的数量), 添加尽可能多的鸡蛋水, 以稀释原酶。用钳子轻轻触摸绒毛膜, 评估弹性损失;绒毛膜应保持凹痕, 而不是立即反弹回来。用玻璃移液器将鸡蛋用鸡蛋水转移到另一道菜中 (此时, 大部分绒毛膜没有破裂)。
      1. 或者, 轻轻地将盘子中的胚胎倒入一个装有蛋水的400毫升玻璃烧杯上, 而不会将胚胎暴露在空气中。然后, 让胚胎完全沉淀。倾斜烧杯, 让胚胎掉落到一边。使用玻璃移液器收集这些胚胎, 并转移到一个新的35毫米玻璃盘子充满了半林格的溶液。
   4. 等待几分钟, 直到大多数绒脉络完全失去弹性。通过轻轻移液鸡蛋, 从胚胎中取出剩余的绒布。取出受损的胚胎, 在28.5°c 的孵化器中孵育胚胎。

3. 手术尺寸的减少和恢复

1. 准备一个干净的35毫米玻璃盘。使用塑料铲子在较大的盘子底部中心附近传播约0.5 毫升的2% 甲基纤维素 (在半 x 林格的溶液中, 用苯酚红色帮助可视化)。将甲基纤维素均匀地分布到约0.5 毫米的厚度。
2. 将大约30毫升的林格溶液倒在盘子的一侧, 并允许扩散到菜的其他部分, 覆盖甲基纤维素。
3. 在2% 的甲基纤维素上, 在256细胞-1k 细胞阶段放置脱孔胚胎。调整胚胎在侧面的方向, 使细胞和蛋黄都能显示出来。(图 1)
4. 用钢丝圈 (或玻璃针) 切割垂直于动物-植物轴的方式, 从动物极点附近的囊虫中切割出大约 30%-40% 的细胞 (图 1, 顶部面板)。取出细胞后, 轻轻点击两端在一起, 以帮助剩余的细胞坚持回来。几分钟内, 当胚胎开始愈合时, 死细胞应该会脱落。
5. 在植物杆附近的蛋黄上做一个小伤口, 而不是 "切碎" 蛋黄 (图 1中间面板)。用安装的金属丝划痕卵泡膜, 将蛋黄缠绕在一起。受伤后, 蛋黄会渗出几分钟, 然后伤口就会愈合 (图1底部面板)。
6. 当蛋黄停止渗出时, 在同一道盘中使用甲基纤维素外的管道将胚胎移动, 以便更好地恢复。
7. 对所有胚胎重复步骤 3.4-3.6。在胚胎恢复的过程中, 让盘子稳定30分钟。
8. 用新鲜的半鱼林格溶液将胚胎转移到新的盘子中, 并将其放入28.5°c 的孵化器中, 使其完全恢复。
   1. (可选)如果感兴趣的阶段是早期体细胞阶段, 胚胎可以在28.5°c 孵育后在20°c 孵育到屏蔽阶段, 以调整实验和成像的时间。

4. 斑马鱼体细胞发生的活体成像

1. 在100毫升的鸡蛋水中加入1克琼脂糖, 制备1% 琼脂糖溶液的100毫升, 加热至琼脂糖完全溶解。冷却5-10 至62-72°C 的温度。
2. 准备用于成像的安装。
   注:本指南是为与倒置广域显微镜一起使用而开发的。
   1. 将1% 琼脂糖的 ~ 15 毫升倒在100毫米 X15 毫米塑料培养皿中。
   2. 轻轻地将背山 V1 模具模板⁵放在培养皿的底部。使用重量, 如15毫升管与水, 保持模具在底部。
      请注意:在使用倒置显微镜时, 胚胎尽可能接近培养皿的底部。虽然胚胎是横向安装的体细胞成像, 这里使用背侧山 V1^5,因为它持有更好的胚胎在早期体细胞阶段。
   3. 让冷却, 直到琼脂糖完全凝固。用0.01% 的滴虫倒在 ~ 30 毫升的鸡蛋水中, 用钳子轻轻窥探, 小心去除霉菌。
3. 安装胚胎进行体细胞成像
   1. 在半环的溶液 (或蛋水) 中制备1% 低熔融琼脂糖, 并将其保持在42°c。等待, 直到温度下降到42°C。
   2. 在解剖显微镜下, 每口井放置一个胚胎。在井中的低熔融琼脂约1μl 的移液器, 以微调井的大小, 以适应大小不同的单个胚胎的大小, 特别是在有和没有大小缩小的胚胎之间。
   3. 在低熔融琼脂糖凝固之前, 快速定位胚胎, 使胚胎完全侧向到盘子。安装胚胎后, 轻轻地将盖板滑放在琼脂糖安装中, 以将胚胎固定在适当的位置。这个方向对于长期的体细胞成像特别重要, 因为胚胎必须完全横向安装, 才能在后期清晰地成像所有的体细胞边界。
   4. 从安装区域沉入, 并操纵25毫米 x 25 毫米盖板玻璃, 使其与模具所做的方形缩进的方向偏移45度。在这个方向上滑动覆盖板在模具上, 直到每个角落都在模具的不同一侧休息。
      请注意:虽然该协议适用于倒置显微镜, 但将盖板玻璃放置在模具顶部仍然很重要, 这样胚胎在转移到显微镜时不会移动。
4. 成像体细胞的形成过程
   1. 将显微镜预热至 28°c, 安装在用泡沫板和机柜加热器建造的孵化器中。
   2. 将培养皿与安装的胚胎放在显微镜下的舞台上。找到安装在琼脂糖安装的左上角井的胚胎, 用较低的放大镜, 然后将目标切换到10倍。
   3. 设置图像采集。
      请注意:本指令适用于明亮的领域。
   4. 找出光功率、曝光时间和冷凝器的条件, 以便可以清楚地看到的边界。使用 z 堆栈设置可设置所需的最低和最高成像平面。设置总时间和时间间隔。查找并登记所有安装的胚胎的 xy 位置, 以便同时对多个胚胎进行时间流逝。
5. 使用斐济¹⁶测量 psm 和体细胞的长度。

5. 神经管图案成像

1. 在100毫升的鸡蛋水中加入1克琼脂糖, 制备1% 琼脂糖溶液的100毫升, 加热至琼脂糖完全溶解。冷却5-10 至62-72°c。将滴原调整为0.01%。
2. 准备用于成像的背安装。
   注:本指南是为使用直立荧光显微镜而开发的。对于倒置显微镜, 需要覆盖底部的菜品, 步骤3中的安装方向被翻转。
   1. 将 ~ 15 毫升的1% 琼脂糖倒在100毫米 x15 毫米塑料培养皿中。轻轻地将背山 V1 模具漂浮在琼脂糖表面, 以避免引入气泡。让冷却, 直到琼脂糖完全凝固。
   2. 小心地取出模具与钳子或剃须刀刀片。用0.01% 的滴虫盖满鸡蛋水, 盖上, 直到使用。
3. 安装胚胎进行神经管成像。
   1. 允许转基因或注射荧光大小缩小和控制胚胎发育, 直到20-25 体细胞阶段 (受精后大约 18-22小时)。表示荧光膜标签 (mem-mCherry、 Mem-mbfp1或mem-mitrine) 的胚胎和神经管模式 (nkx2.2: mem-gfp 、Dbx1b:gfp 或 olig2: dsred)的转基因记者用于成像。
   2. 用0.01% 的滴虫工作溶液代替准备好的背安装中的鸡蛋水介质。在胚胎中轻轻的移液器被成像到背口的井。
   3. 操纵胚胎进入正确的方向, 使头部朝前方在坐骑和尾巴指向后方与背侧面向水面。
   4. 将胚胎定向到尾巴平躺, 而不是指向盘子底部。有时, 将尾巴的后部休息在安装井的侧窗台上是有帮助的, 以防止尾巴下沉, 并在不经意间成像后脑。对每个胚胎重复上述步骤。确保随着大小缩小的胚胎, 他们不会深入到井里进行成像。
   5. 从安装区域沉入水中, 并操纵25毫米 x 25 mm 的盖板玻璃, 使其与模具所做的方形缩进方向的方向偏移45°。在这个方向上滑动覆盖板在模具上, 直到每个角落都在模具的不同一侧休息。
   6. 慢慢旋转盖板玻璃, 直到它轻轻落在安装区域。检查, 以确保胚胎仍然安装在正确的位置和方向。如果覆盖玻璃的坠落造成了太多的运动, 轻轻取出并从步骤 C 重复安装。
4. 三维图像发育中的脊髓。
   1. 轻轻地将含有安装胚胎的盘子输送到共聚焦显微镜上。对于长期的活体成像, 一定要使用孵化显微镜。否则, 低温是可以容忍的。
   2. 在明亮场照明下, 导航到胚胎图像, 并将视野集中在首选的前后位置。为了能够对胚胎进行详细比较, 每个胚胎上的这一位置必须是一致的。
   3. 设置成像参数, 以激发和捕获正在成像的荧光蛋白的信号。参数可以通过眼睛进行调整, 以便在初始样本上创建所需的图像。若要实现测量一致性, 请将这些设置应用于数据集中的所有胚胎。如果需要多个 z 堆栈, 请优化速度设置。
   4. 使用 z 堆栈设置, 设置所需的最低和最高成像平面。为了在 z 堆栈中获得最佳图像质量, 请将 z 分辨率设置为最佳光圈设置的最高分辨率。可以用 1μm z 间距生成良好的图像。
5. 使用任何首选方法分析成像数据。
   请注意:在这种情况下, 使用自定义 MATLAB 脚本进行分析, 从而能够对图像的神经部分进行简单的分割和对成像信号进行量化。

结果

蛋黄体积减少对正常形态很重要
正如最近在 Almuedo-castylo 等人 17中所描述的, 在不减少蛋黄体积的情况下, 可以减少胚胎的大小。为了与蛋黄体积减少和不减少, 我们执行了两步切碎 (包括囊胚和蛋黄) 和只切碎 (图 2和补充电影 1)。与对照 (仅 dechorionation) 相比, 两步切碎的胚胎在整个发育阶段显示出看似正常的整体形态 (大小差异除外) (见图 2中的顶部和中间面板)。另一方面, 仅有囊胚的胚胎表现出一种特殊的形态, 尤其是在早期阶段。在上皮化过程中, 胚胎有收缩和缩进的外观 (参见图 2中70% 的上皮的底部面板)。在接下来的微结构阶段, 发现中线结构在许多轴向水平上被压平 (即 DV 长度相对小于 ML 长度) (参见图 2中8和20体细胞...

讨论

从历史上看, 在脊椎动物中, 大小缩小主要是使用两栖动物胚胎, 在第12条阶段沿动物-植物轴将胚胎一分为二.然而, 当我们将青蛙和斑马鱼胚胎一分为二时, 主要有两个区别。首先, 在斑马鱼胚胎耐受分分割 (囊胚阶段) 的阶段, 组织者位于^{脂肪边缘 18、19、20、21 的}禁区内。因为不能从胚胎的形态中分辨出组织者的位置, 所以沿着动物-植物轴随机切割胚胎会产生背生或腹形胚胎。其次, 与青蛙胚胎不同的是, 斑马鱼胚胎经历了一个叫做表皮的过程, 在这个过程中, 细胞在分离的蛋黄周围向植物极点移动, 直到它被细胞完全包围。如果只去除一部分囊胚, 那么较少的细胞仍然会吞没体积相对较大的蛋黄, 因此, 在表观形成后, 形态会出现影响。因此, 我们采用两步切碎, 在动物杆附近切碎囊胚, 以避...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
60 mm PYREX 培养皿	CORNING&	nbsp;3160-60
琼脂糖	affymetrix	75817	用于制作实时成像的支架
琼脂糖，低胶凝温度 VII-A	SIGMA-ALDRICH	型 Cácl
2	EMD	CX0130-1	用于 1/3 林格溶液
CaSO4			用于鸡蛋水
盖玻片（25 mm x 25 mm，厚度 1）	康宁	2845-25
一次性刮刀	VWR	80081-188
泡沫板	ELMER'S	951300	用于显微镜培养箱
Forcept （No 55）	FST	11255-20
玻璃移液器	VWR	14673-043
HEPES	SIGMA 生命科学	H4034	用于 1/3 林格溶液
INCUKIT XL 用于橱柜式培养箱	培养箱 Warehouse.com		用于显微镜培养箱
速溶海盐	Instant Ocean	138510	用于蛋水
KCl	SIGMA-ALDRICH	P4504	用于 1/3 林格溶液
甲基纤维素	SIGMA-ALDRICH	M0387-100G
NaCl	SIGMA-ALDRICH	S7653	用于 1/3 林格液
培养皿	Falcon	351029	用于制作实时成像支架
酚红	SIGMA Life Science	P0290
移液器泵	BEL-ART PRODUCTS	F37898
链霉蛋白酶	EMD Millipore Corp	53702-250KU
三卡因-S （MS222）	WESTERN CHEMICAL INC
超薄光亮退火 316L 直径 0.035 毫米 不锈钢编织线	Sandra		我们使用的电线是 ~20 年前获得的，我们找不到完全相同的电线。该产品的材料和直径与我们使用的相同。