斑马鱼胚胎模式缩放研究的手术尺寸减小法

摘要

本文介绍一种在不干扰斑马鱼胚胎正常发育过程的前提下缩小其体积的方法。该技术可用于研究模式形成在尺寸变化下的比例调节以及发育过程对尺寸改变的稳健性。

摘要

在发育过程中，胚胎表现出一种显著的能力，即能够使其身体图式与身体大小相匹配；即使在一定范围内体积较大或较小的胚胎中，其身体比例仍能保持不变。尽管这种缩放现象已受到逾一个世纪的关注，但由于缺乏对不同大小胚胎发育动态的定量描述，人们对潜在机制的理解一直受到限制。为了克服这一局限，我们开发了一种新技术，可通过手术方式减小斑马鱼胚胎的体积，而斑马鱼在活体成像方面具有显著优势。我们证明，在囊胚阶段分步平衡地去除部分细胞和卵黄后，胚胎在适宜条件下能够迅速恢复，并发育成体积更小但其他方面正常的胚胎。由于该技术无需特殊设备，易于推广，可用于研究多种缩放相关问题，包括形态发生素介导的图式形成的稳健性。 

引言

长期以来，科学家们已知胚胎具有形成恒定身体比例的显著能力，尽管在自然条件和实验条件下胚胎大小可能存在很大差异^1,2,3。尽管已有数十年的理论与实验研究，这种对大小变化的稳定性——称为比例缩放（scaling）——及其潜在机制在许多组织和器官中仍不清楚。为了直接捕捉发育系统的动态过程，我们在斑马鱼中建立了一种可重复且简单的尺寸减小技术⁴，该技术在活体成像方面具有显著优势⁵。

斑马鱼已被用作研究生物学多个领域的模式脊椎动物，包括发育生物学。特别是，斑马鱼非常适合进行活体实时成像⁶，原因如下：1）其发育可在母体外及卵壳外正常进行；2）胚胎具有透明性。此外，斑马鱼胚胎能够耐受一定程度的温度和环境波动，使其可在实验室条件下进行研究。除了通过吗啉代寡核苷酸（morpholino）和mRNA注射进行传统的基因表达干扰外^7,8，近年来CRISPR/Cas9技术的进步使得斑马鱼的反向遗传学研究变得极为高效⁹

方案

所有与鱼类相关的操作均经哈佛医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 工具和试剂准备

1. 制作金属丝环以切割胚胎
   1. 取一段长度为 20 cm、质地坚硬且耐腐蚀的不锈钢丝，直径为 40 μm。将金属丝穿入玻璃毛细管（外径 1.0 mm，内径 0.5 mm，无纤维芯）中，在顶端形成一个小环（环的长度为 1.0 mm）
   2. 在玻璃毛细管尖端的金属丝环之间滴一小滴透明指甲油，以固定金属丝环。待其自然干燥。注意不要让指甲油沾到金属丝环部分，以免损伤胚胎。
   3. 使用实验室胶带将带有金属丝环的玻璃毛细管固定在一根木制筷子上（使用 9 英寸的一次性竹筷，折成两半），使玻璃毛细管末端伸出筷子约 2.5 cm，以确保使用时筷子部分不会浸入水中。可根据个人习惯调整该长度。
2. 或者，制作玻璃针以切割胚胎
   1. 用镊子夹住玻璃巴斯德吸管的一端，另一端用手握住，将吸管较细的部分置于酒精灯或本生灯火焰上加热。
   2. 手动拉伸玻璃吸管。理想的吸管尖端直径约为 30 μm，并具有平缓的弯曲弧度（曲率半径约为 5 mm）。合适的直径和曲率需通过练习和经验逐步掌握。
3. 准备甲基纤维....

结果

卵黄体积的减少对于正常形态至关重要
正如 Almuedo-Castillo 等人最近所述¹⁷，可以在不减少卵黄体积的情况下实现胚胎尺寸的缩小。为了比较是否减少卵黄体积的效果，我们分别进行了两步切割法（同时切割囊胚和卵黄）和仅切割囊胚法（图2 和 补充视频1）。与对照组（仅去壳）胚胎相比，两步切割的胚胎在整个发育阶段均表现出看似正常的整体形态，仅存在尺寸差异（见 图2 的上排和中排图示）。相反，仅切割囊胚的胚胎则表现出异常的形态，尤其是在早期阶段。在表层扩展过程中，这些胚胎呈现出收缩和凹陷的外观（见 图2 中70%表层扩展阶段的下排图示）。在随后的体节阶段，许多轴向水平的中线结构变得扁平化（即背腹轴长度相对于内外侧长度较短）（见 图2 中8体节和20体节阶段的下排图示）。在后期阶段.......

讨论

历史上，在脊椎动物中，体积缩小主要通过对囊胚期的两栖类胚胎沿动-植物极轴进行切割来实现¹²。然而，当我们对胚胎进行切割时，青蛙胚胎与斑马鱼胚胎之间存在两个主要差异。首先，在斑马鱼胚胎能够耐受切割的阶段（囊胚期），胚胎组织中心位于囊胚边缘的一个局限区域^18,19,20,21。由于无法通过胚胎形态判断组织中心的位置，因此沿动-植物极轴随机切割会产生背侧化或腹侧化的胚胎。其次，与青蛙胚胎不同，斑马鱼胚胎会经历一种称为外包（epiboly）的过程，即细胞围绕分离的卵黄向植物极移动，直至完全包裹卵黄。如果仅移除部分胚盘，则剩余细胞数量较少，难以包裹相对体积较大的卵黄，结果导致外包完成后形态异常。因此，我们采用两步切割法：首先在动物极附近切割囊胚，以避免切除组织中心；同时损伤卵黄膜，使卵黄体.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
60 mm PYREX 培养皿	CORNING	3160-60
琼脂糖	affymetrix	75817	用于制备活体成像用的封片
低凝胶温度琼脂糖，Type VII-A	SIGMA-ALDRICH	A0701-25G
CaCl2	EMD	CX0130-1	用于配制1/3 Ringer's 溶液
CaSO4			用于卵水配制
盖玻片（25 mm × 25 mm，厚度 1）	CORNING	2845-25
一次性刮勺	VWR	80081-188
泡沫板	ELMER'S	951300	用于显微镜培养箱
显微镊（No 55）	FST	11255-20
玻璃移液管	VWR	14673-043
HEPES	SIGMA Life Science	H4034	用于配制1/3 Ringer's 溶液
INCUKIT XL 柜式培养箱组件	INCUBATOR Warehouse.com		用于显微镜培养箱
Instant sea 盐	Instant Ocean	138510	用于卵水配制
KCl	SIGMA-ALDRICH	P4504	用于配制1/3 Ringer's 溶液
甲基纤维素	SIGMA-ALDRICH	M0387-100G
NaCl	SIGMA-ALDRICH	S7653	用于配制1/3 Ringer's 溶液
培养皿	Falcon	351029	用于制备活体成像用的封片
酚红	SIGMA Life Science	P0290
移液器泵	BEL-ART PRODUCTS	F37898
蛋白酶 K（Pronase）	EMD Millipore Corp	53702-250KU
Tricaine-S（MS222）	WESTERN CHEMICAL INC	NC0135573
超细亮退火 316L 直径 0.035 mm 不锈钢编织丝	Sandra		我们所使用的金属丝约 20 年前获得，目前无法找到完全相同的型号。该产品与我们所用金属丝的材质和直径相同。