使用标准化定量 Western Blotting 在不同组织及发育过程中对蛋白质水平进行稳健比较

摘要

本方法介绍了一种采用标准化定量蛋白质印迹技术，对不同组织及不同发育阶段的蛋白质水平进行可靠且可重复比较的实验方案。

摘要

Western blotting 是一种常用于检测和定量蛋白质表达的技术。多年来，该技术在基础研究和临床研究中均推动了诸多进展。然而，与许多类似的实验技术一样，Western blot 分析的结果极易受到实验设计和操作过程中各种选择的影响。传统上，研究中常使用特定的看家蛋白来对蛋白质水平进行归一化定量，但这种方法存在诸多局限性，因此近年来受到越来越多的批评。本文中，我们描述了一种详细的实验方案，该方案由我们开发，可用于在不同组织、小鼠模型（包括疾病模型）以及不同发育时间点之间进行复杂的蛋白质表达差异比较。通过使用荧光总蛋白染色并引入内参上样标准，可以克服传统方法在单次实验中可比较样本数量上的限制，从而系统性地比较多种实验条件下的蛋白质水平。该方法拓展了传统 Western blot 技术的应用范围，使研究人员能够更深入地探究不同组织和样本间的蛋白质表达情况。

引言

Western blotting 是一种常用于检测和定量蛋白质表达的技术，包括在组织匀浆或提取物中的蛋白质。多年来，该技术推动了基础研究和临床研究的许多进展，在临床中可用作诊断工具，以识别疾病的存在^1,2。Western blotting 于1979年首次被描述，其方法是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜上，随后使用标记有放射性物质或与荧光素或过氧化物酶偶联的二抗来可视化蛋白质³。随着商业化试剂盒和设备的发展，Western blotting 方法在近年来已日益标准化和简化。事实上，如今不同背景和经验水平的科研人员均可轻松开展该技术。然而，与许多类似的实验技术一样，Western blot 分析的结果极易受到实验设计和操作过程中各项选择的影响。因此，尽管标准化的 Western blotting 方法易于获取，但仍必须认识到精心的实验规划与设计不可或缺。实验中需考虑的因素包括但不限于样品的制备与处理、用于蛋白质检测的抗体的选择与验证，以及特别小或大（<10 或 >140 kDa）蛋白质从凝胶向膜转移的效率^4,5,6,7,8,9。原始样品中蛋白质的质量对后续 Western blot 分析结果具有重要影响。由于蛋白质可从多种样品和来源中提取，包括细胞系、动物模型组织以及死后人体组织，因此必须保持处理和操作的一致性，以获得可重复的结果。例如，当需要长期储存样品用于蛋白质提取时，应认识到尽管蛋白质在 -80 °C 下通常较为稳定，但已有报道指出提取后的蛋白质与完整组织在 -80 °C 下的稳定性存在差异¹⁰。此外，为了获得可重复的蛋白质定量结果，样品均一化的处理至关重要。在开展大规模定量实验之前，可能需要优化不同的裂解缓冲液和均质化方法（例如手动均质化与自动化方法的比较）。

为校正蛋白上样量和定量过程中的变异，采用标准化策略对于获得可靠且定量的蛋白表达结果至关重要。传统上，常使用看家蛋白（如 β-actin、α-tubulin、β-tubulin 和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH））对蛋白水平进行标准化以实现定量。然而，近年来，针对特定看家蛋白进行定量标准化的方法受到越来越多的质疑^11,12。例如，看家蛋白的表达水平在不同发育阶段^13,14、同一动物的不同组织之间⁴，以及在多种疾病状态下^4,15,16,17均可能发生改变。因此，依赖特定看家蛋白进行标准化会限制在不同组织、不同时间点以及不同实验条件下进行更复杂蛋白表达比较的可能性。为控制蛋白上样差异，一种替代看家蛋白的方法是使用总蛋白染色（TPS），该方法可标记并可视化样品中所有存在的蛋白。TPS 能够基于总蛋白载量而非单一特定蛋白的表达水平进行信号标准化，因此 TPS 信号的定量结果应在不同实验条件、样品类型或发育时间点之间具有可比性和可重复性。总蛋白染色的示例包括 Ponceau S、免染胶、Coomassie R-350、Sypro-Ruby、Epicocconone、Amydo Black 和 Cy5（详见参考文献18）。这些方法各有其特定的优势与局限性，具体方法的选择取决于可用的时间、工具以及实验设计^4,18。

除了使用总蛋白上样量标准化（TPS）方法来校正膜内上样和定量的差异外，在不同膜之间进行样本比较也可能是必要的，尤其是在进行大规模蛋白质表达分析时。然而，由于抗体结合效率、总蛋白染色强度等因素的差异，可能会在分别运行于不同凝胶和转印膜上的蛋白质样本之间引入额外的变异。因此，在这种情况下，为了实现可靠的定量分析，有必要引入进一步的归一化步骤，以校正膜间差异。这一目标可通过在每张独立分析的膜上均加入一个内部上样标准品来实现，该标准品在各次实验中保持恒定。该标准品可以是任何能够获得足够数量的蛋白裂解液，以便在实验所涉及的所有膜上使用。本文中我们采用小鼠脑组织裂解液（来源于5日龄对照小鼠），因为脑组织易于匀浆，且所得蛋白裂解液含有较高浓度的丰富蛋白。将内部标准品以三复孔形式上样，即可实现对不同膜上样本的归一化和直接比较。

本文中，我们描述了一种已开发的详细实验方案，可用于在不同组织、小鼠模型（包括疾病模型）以及发育时间点之间进行复杂的蛋白质表达差异比较¹⁹。通过将荧光总蛋白染色（TPS）与内参上样标准相结合，我们克服了单次实验中可比较的样本数量和实验条件的现有局限性。该方法拓展了传统蛋白质印迹技术的应用，使研究人员能够更深入地探究不同组织和样本间的蛋白质表达情况。

方案

本实验所用组织样本来自经爱丁堡大学内部伦理委员会批准的动物研究，并在相关个人和项目许可证的授权下，依照机构及英国国内事务部的规定进行操作。

注意：本实验方案已采用标准化的市售试剂盒和试剂进行优化，以提高可重复性（见材料表）。

1. 样品制备

1. 蛋白质提取
   1. 将速冻的细胞或组织样本从 -80 °C 环境中转移至干冰上，置于冰上解冻，并根据需要使用预冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤（有关组织和 PBS 洗涤的详细信息，请参见表 1）。避免不必要的冻融循环，以免影响蛋白质质量。
   2. 向每个样本中加入含有 1× 蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（25 mM Tris-HCl（pH 7.6）、150 mM NaCl、1% NP-40、1% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS），并根据组织重量加入最适体积（具体推荐用量见表 1）。
      注：根据具体应用，匀浆缓冲液的类型和用量可能需要进一步优化。
   3. 使用带有聚丙烯杵头的手持式电动匀浆器匀浆组织样本。每次使用后，用双蒸水清洗杵头，并用洁净纸巾擦干。在不同实验条件或不同组织之间应更换杵头。
   4. 匀浆后将样本置于冰上静置 10 分钟。在 4 °C 下以>10,000 × g 离心 10 分钟。
   5. 将上清液转移至新的预冷离心管中，注意不要扰动沉淀。上清液即为蛋白质样本。提取的蛋白质可保存于 -80 °C，或直接用于测定蛋白质浓度。
2. 蛋白质浓度的定量与归一化
   1. 使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度。按照试剂盒说明书在 96 孔光学板中配制 BCA 工作液，每孔加入 200 µL BCA 混合液。
      注：其他定量方法如 Lowry 法和 Bradford 法也可用于测定蛋白质浓度，前提是实验间蛋白质浓度测定方法保持一致。
   2. 制备浓度梯度的牛血清白蛋白（BSA）标准品，每个浓度设三个复孔；每个蛋白质样本取 1 µL，设两个复孔。将 96 孔板置于预热至 60 °C 的金属浴中孵育 10 分钟，若预期蛋白浓度较低，可适当延长孵育时间。
   3. 孵育结束后，使用酶标仪在 560 nm 波长下测定吸光度。
   4. 导出酶标仪读数，并通过与标准品曲线比较各样本的平均吸光度值来计算蛋白质浓度。标准曲线的 R² 值应大于或等于 0.98，以确保样本蛋白质浓度的准确估算。
   5. 通过在样品缓冲液和超纯水中稀释蛋白质样本，对蛋白量进行归一化处理。总体积可根据所用凝胶类型进行调整。建议每泳道上样 30 µg 蛋白作为起始量。根据需要向各样本中加入还原剂，如二硫苏糖醇（DTT；终浓度 5 mM）或β-巯基乙醇（终浓度 200 mM）。操作β-巯基乙醇时应在通风橱中进行，且应使用未稀释原液加样。
   6. 将样本在 70 °C 金属浴中孵育 10 分钟。孵育后立即置于冰上，短暂涡旋混匀并离心收集。保持样本在冰上直至上样至凝胶。

2. 蛋白质样品的凝胶电泳

1. 设备与凝胶准备
   1. 在电泳装置系统中安装预制的 4–12% Bis-Tris 梯度凝胶（参见材料表）。使用前用双蒸水冲洗凝胶。
      注意：根据目标蛋白的大小、相互作用及丰度，可选用不同梯度、缓冲剂或不同孔径大小和数量的凝胶。
   2. 每槽加入 500 mL 用双蒸水稀释的 1x MES SDS 电泳缓冲液。加入运行缓冲液后，小心移除凝胶中的梳子，避免破坏浓缩胶中的加样孔。
2. 蛋白上样
   1. 将 3.5 µL 蛋白标准品加入加样孔中。根据样品排布情况，在凝胶两侧均加载蛋白 Marker 有助于更准确地估计蛋白大小。使用细尖端的上样吸头以提高上样准确性。
   2. 若使用内参标准品进行膜间归一化（见下文步骤 5 及讨论部分），请在蛋白 Marker 旁的前 3 个加样孔中加入与其他样品等量的标准品。
   3. 在其余加样孔中各加入 30 µg 样品。所有空孔中加入 1x 上样缓冲液。
3. 电泳
   1. 加样完成后组装电泳槽。先以 80 V 恒压运行 10 分钟通过浓缩胶，随后以 150 V 恒压继续电泳 45–60 分钟。

3. 蛋白质转移

注意：本实验方案中的蛋白质转印采用市售的半干式转印系统（参见材料表），以实现快速且稳定的结果。

1. 通过将滤纸预先浸泡在双蒸水中，并确保凝胶刀、塑料巴斯德吸管、压膜滚轮和镊子已准备好使用，来准备蛋白转膜。
2. 小心移除所有包装铝箔以打开转膜夹层装置。取下底部支架并放置一旁。用几滴电泳运行缓冲液（2–3 mL）迅速润湿底部支架上的膜。一旦打开转膜夹层装置，必须防止PVDF膜干燥。
3. 停止电泳后，使用凝胶刀打开预制胶，并切去浓缩胶。沿凝胶边缘切割，使其脱离塑料模具。保持凝胶刀湿润，以防止损伤凝胶。
4. 从下至上组装转膜夹层：底部支架（含PVDF膜）、蛋白凝胶、滤纸。使用压膜滚轮去除所有气泡。将顶部支架置于滤纸上，并再次滚压以去除气泡。切勿用力过猛，以免导致凝胶在蛋白转膜过程中变形。
5. 将整个夹层装置放入转膜仪中，电极置于仪器左侧，并将凝胶海绵放置在夹层顶部，使其与仪器上的相应电极接触点对齐。盖上盖子，选择并启动合适的程序（建议起始条件为20 V持续7分钟）。
6. 转膜完成后，保持盖子关闭2分钟，使夹层装置冷却并防止膜干燥。取出转膜夹层装置，将膜裁剪至与凝胶相同大小。在进行总蛋白染色前，用双蒸水快速清洗裁剪好的膜。

4. 总蛋白染色

注意：与更传统的检测方法（如化学发光检测）相比，使用荧光检测具有显著优势，因为其线性范围和灵敏度可以得到更好的控制⁴。因此，在步骤4和5中使用荧光TPS和荧光二抗（参见材料表）。

1. 将膜卷成筒状放入50 mL离心管中，使蛋白质面朝内。由于荧光TPS和二抗对光敏感，后续所有步骤均需在避光条件下进行。
2. 加入5 mL蛋白染色液（见材料表），于室温在摇床上孵育5分钟。由于TPS和洗涤缓冲液含有甲醇，这些步骤应在通风橱中操作。
3. 弃去染色液，用5 mL洗涤液（含6.3%乙酸的30%甲醇溶液）快速洗涤两次。每次洗涤间隔将离心管短暂放回摇床上。继续实验前，用超纯水短暂冲洗膜。

5. 封闭、抗体孵育与检测

1. 封闭膜：向含有膜的50 mL离心管中加入3 mL封闭缓冲液（参见材料表）。在室温下于摇床上孵育30分钟。根据所选抗体的不同，可能需要优化封闭缓冲液的类型。
2. 一抗孵育
   1. 弃去封闭缓冲液，加入适当且已优化浓度的一抗（图1 和 图2：小鼠抗SMN抗体，1:1,000稀释于封闭缓冲液中）。
      注意：对一抗进行充分优化时，应确认该抗体可检测到正确大小的蛋白产物，同时对其他非特异性蛋白产物无结合或结合极少。如有可能，应测试并比较多种针对目标蛋白的抗体。
   2. 在4 °C下于摇床上孵育过夜。次日，移除抗体溶液，并在室温下用1× PBS在摇床上洗涤6次，每次5分钟。
3. 二抗孵育
   1. 将特异性二抗按1:5,000的比例溶于5 mL封闭缓冲液中，用于识别一抗的宿主来源。其他二抗可能需要不同的稀释比例或使用不同的封闭缓冲液。
   2. 在室温下于摇床上用二抗溶液孵育膜1小时。孵育后，在摇床上用1× PBS洗涤3次，每次30分钟。
   3. 将膜干燥，并用铝箔包裹避光保存，直至进行检测。膜可长期保存于4 °C。
4. 图像采集
   1. 登录连接扫描仪的计算机。将膜放置在扫描仪上，使蛋白面朝下，并在软件中选择扫描区域。
   2. 通过确认无信号饱和，优化两个通道（700 nm和800 nm）的激光强度。采集两个通道的图像，并导出用于后续分析（步骤6）。

6. 蛋白质印迹分析与定量

注意：这些建议基于免费提供的 Image Studio 软件。然而，也可使用其他软件包（如 ImageJ）进行类似的分析。

1. 导入文件：在用于分析的计算机上创建一个本地工作区。这将生成一个包含所获取的 Western 印迹图像文件的数据库。导入扫描仪获得的文件，并选择用于分析的图像。
2. TPS 分析
   1. 显示 700 nm 通道以展示总蛋白染色结果。图 1 中提供了 TPS 图像的示例，其中直接比较了新生（P5）小鼠（图 1A-B）和 10 周龄小鼠（图 1C-D）的不同组织。类似地，图 2 展示了不同年龄小鼠脑组织直接比较的示例。
   2. 从右上角选择 分析 选项卡，然后选择 添加矩形 以定义用于归一化的感兴趣区域（图 1B、D）。将第一个矩形区域复制并粘贴到每个单独的样本上，以确保所有分析泳道中定义的区域大小一致。
   3. 复制软件左下角 形状 选项卡中的结果。
3. 定量分析
   注意：定量样本的最佳方法取决于实验设计。此处我们将提供一个示例，说明如何检测运动神经元存活蛋白（Smn；一种参与神经肌肉疾病脊髓性肌萎缩症的关键蛋白^20,21），该蛋白已知会随时间推移而减少¹⁹，并通过将 Smn 信号强度归一化至 TPS 来获得可靠的蛋白表达变化估计。
   1. 图 2 显示了以 TPS 作为蛋白上样对照时，Smn 表达随动物年龄增长而下降的情况。重复步骤 6.2.1–6.2.3 以定量蛋白上样量（图 2B）。在 800 nm 通道中重复步骤 6.2.1–6.2.3（图 2A）以分析目标蛋白。
   2. 将 TPS 和目标蛋白的结果复制到电子表格程序中。在电子表格中，首先通过确定最高的 TPS 信号，并将每个 TPS 信号值除以该值，从而获得归一化的蛋白上样量。
   3. 将每个样本的 800 nm 信号值除以其对应的归一化蛋白上样量值，以计算不同样本中的相对蛋白表达比值。
   4. 完成首次归一化后，将不同时间点或组织与内参标准的平均值进行比较，从而实现不同印迹膜和不同实验之间的直接比较。

7. 统计学

1. 为了确定在复杂且大样本组间蛋白质表达的任何统计学显著差异，需要采用适当的统计学方法。尽管对统计学背景的详细讨论超出了本文的范围，但我们希望强调若干注意事项，并详细介绍我们此前已成功使用过的一种方法¹⁹。
2. 与许多实验类似，蛋白质定量测量结果并不代表完全独立的数据。例如，在单个时间点检测多个器官中的蛋白质水平时，通常从同一只动物获取多种组织样本。因此，我们采用混合效应模型来分析蛋白质表达在不同时间点以及不同组织间的差异。  通常情况下，混合效应模型能够有效处理数据非独立性问题，从而避免伪重复^22,23。在本研究中，混合效应模型通过考虑个体内部不同组织的重复测量，提高了统计效能。我们使用统计软件包 R 进行这些分析，因其免费且功能灵活。然而，其他商业软件包也可能实现类似的分析。 
3. 当前实验设计属于“裂区设计”，因为每只小鼠仅归属于一个年龄组。因此，我们将个体小鼠（小鼠编号）建模为具有唯一标识符的随机效应；同时将组织、年龄及其交互作用作为固定效应纳入模型。我们使用 R 软件包 lme4 中的 lmer 函数对数据进行建模。作为质量控制步骤，我们对残差进行可视化，以评估方差齐性和正态分布的假设，并在必要时对数据进行转换以满足这些假设。为了检验组织与年龄之间是否存在显著交互作用，我们拟合了一个不包含该交互项的相同模型，并通过参数自助法（使用 pbkrtest 软件包中的 R 函数 PBmodcomp）比较两个模型。  当发现显著交互作用时，我们使用 emmeans 函数（emmeans R 软件包）来确定交互作用的具体来源。  例如，我们在每种组织内比较不同年龄组之间的平均表达水平；若在某一组织中两个特定年龄组之间存在显著差异，而在另一组织中无此差异，则可能产生年龄与组织间的显著交互作用。总之，这些方法可通过为 Western blot 实验结果提供统计支持，从而增强结论的稳健性。

结果

我们提供了使用 TPS 和内参标准的示例，以促进不同组织和时间点之间蛋白质水平的比较。图1展示了从新生小鼠（出生后第5天）和成年小鼠（10周龄）获取的组织中提取的蛋白质进行 Western 印迹分析的结果。TPS 和 Smn 的免疫印迹结果见图1A、C。通过测量每条泳道矩形框内的荧光强度，对 TPS 的荧光强度进行定量，结果列于图1B和1D的表格中。需要注意的是，来自不同组织的样品具有不同的 TPS 蛋白条带模式，因此有必要使用整条泳道进行归一化。事实上，当对整条泳道进行分析时，各样品间的荧光强度相对接近，表明 TPS 适合作为归一化的参照。此外，实验中还包含了一个由 P5 小鼠脑组织裂解液混合物组成的内参标准，以说明其在不同印迹膜之间进一步比较中的应用。此外，在图2中...

讨论

通过适当的实验设计、对照措施和统计分析，Western blotting 可用于对各种生物样本内及样本间的蛋白质表达水平进行可靠的定量估计。本文所述方案旨在为研究人员提供一个指南，帮助其利用荧光检测方法、总蛋白上样归一化以及内参标准，对更大规模且更复杂的样本组进行定量分析。尽管本文重点在于测定并比较不同小鼠组织及不同年龄阶段的蛋白质表达水平，但该方法也可拓展应用于其他实验条件下蛋白质表达的比较研究。

当前实验方案中的一个关键步骤是通过定量荧光总蛋白染色，将目标蛋白归一化到所加载的总蛋白量。总蛋白染色（TPS）归一化可校正样品上样差异以及蛋白定量方法中的误差。然而，由于单张膜上可分析的蛋白样品数量通常有限，因此在比较多张膜时可能需要进一步归一化。实际上，不同膜之间蛋白检测的差异（例如由于抗体孵育时间或温度波动所致）可能导致超出上样和定量步骤所引入的变异。为此，我们使用一种内部标准品，该标准品由单一蛋白裂解液混合物组成，并在每块凝胶上以三复孔形式上样，从而实现凝胶/膜之间的比较与归一化。理论上，该标准品可以是任何蛋白样品，只要其能够制备出足够量，以确保所有实验中使用完全相同的样品。在我...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细尖端凝胶上样吸头	Alpha Laboratories	GL20057SNTL
Halt 蛋白酶抑制剂混合物（无 EDTA），100 倍浓缩液，5 mL	ThermoFisher Scientific	78437
手持式匀浆器	VWR Collection	431-0100
iBlot 2 蛋白转膜仪	ThermoFisher Scientific	IB21001
iBlot 转膜套装，PVDF 膜，标准尺寸	ThermoFisher Scientific	IB401031
Image Studio Lite	Licor	N/A	可从 https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ 免费下载
IRDye 800CW 二抗	Licor	--	选择针对一抗宿主物种的合适二抗。
Micro BCA 蛋白定量检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	23235
Novex Sharp 预染蛋白标准品	ThermoFisher Scientific	LC5800
NuPAGE 4–12% Bis-Tris 蛋白凝胶，1.0 mm 厚，15 孔	ThermoFisher Scientific	NP0323BOX
NuPAGE LDS 上样缓冲液（4×）	ThermoFisher Scientific	NP0007
NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液（20×）	ThermoFisher Scientific	NP0001
Odyssey 封闭缓冲液	Licor	927-40000
纯化小鼠抗 SMN（运动神经元存活蛋白）单克隆抗体	BD Transduction Laboratories	610646	在 SMN/SMA 相关文献中被广泛使用，不同批次均能获得稳定一致的结果
REVERT 全蛋白染色液，250 mL	Licor	926-11021
REVERT 洗涤液	Licor	926-11012
RIPA 裂解与提取缓冲液	ThermoFisher Scientific	89900
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher Scientific	EI0001