使用标准化定量 Western Blotting 在不同组织及发育过程中对蛋白质水平进行稳健比较

摘要

本方法介绍了一种采用标准化定量蛋白质印迹技术，对不同组织及不同发育阶段的蛋白质水平进行可靠且可重复比较的实验方案。

摘要

Western blotting 是一种常用于检测和定量蛋白质表达的技术。多年来，该技术在基础研究和临床研究中均推动了诸多进展。然而，与许多类似的实验技术一样，Western blot 分析的结果极易受到实验设计和操作过程中各种选择的影响。传统上，研究中常使用特定的看家蛋白来对蛋白质水平进行归一化定量，但这种方法存在诸多局限性，因此近年来受到越来越多的批评。本文中，我们描述了一种详细的实验方案，该方案由我们开发，可用于在不同组织、小鼠模型（包括疾病模型）以及不同发育时间点之间进行复杂的蛋白质表达差异比较。通过使用荧光总蛋白染色并引入内参上样标准，可以克服传统方法在单次实验中可比较样本数量上的限制，从而系统性地比较多种实验条件下的蛋白质水平。该方法拓展了传统 Western blot 技术的应用范围，使研究人员能够更深入地探究不同组织和样本间的蛋白质表达情况。

引言

Western blotting 是一种常用于检测和定量蛋白质表达的技术，包括在组织匀浆或提取物中的蛋白质。多年来，该技术推动了基础研究和临床研究的许多进展，在临床中可用作诊断工具，以识别疾病的存在^1,2。Western blotting 于1979年首次被描述，其方法是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜上，随后使用标记有放射性物质或与荧光素或过氧化物酶偶联的二抗来可视化蛋白质³。随着商业化试剂盒和设备的发展，Western blotting 方法在近年来已日益标准化和简化。事实上，如今不同背景和经验水平的科研人员均可轻松开展该技术。然而，与许多类似的实验技术一样，Western blot 分析的结果极易受到实验设计和操作过程中各项选择的影响。因此，尽管标准化的 Western blotting 方法易于获取，但仍必须认识到精心的实验规划与设计不可或缺。实验中需考虑的因素包括但不限于样品的制备与处理、用于蛋白质检测的抗体的选择与验证，以及特别小或大（<10 或 >140 kDa）蛋白质从凝胶向膜转移的效率^4,5,6,

方案

本实验所用组织样本来自经爱丁堡大学内部伦理委员会批准的动物研究，并在相关个人和项目许可证的授权下，依照机构及英国国内事务部的规定进行操作。

注意：本实验方案已采用标准化的市售试剂盒和试剂进行优化，以提高可重复性（见材料表）。

1. 样品制备

1. 蛋白质提取
   1. 将速冻的细胞或组织样本从 -80 °C 环境中转移至干冰上，置于冰上解冻，并根据需要使用预冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤（有关组织和 PBS 洗涤的详细信息，请参见表 1）。避免不必要的冻融循环，以免影响蛋白质质量。
   2. 向每个样本中加入含有 1× 蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（25 mM Tris-HCl（pH 7.6）、150 mM NaCl、1% NP-40、1% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS），并根据组织重量加入最适体积（具体推荐用量见表 1）。
      注：根据具体应用，匀浆缓冲液的类型和用量可能需要进一步优化。
   3. 使用带有聚丙烯杵头的手持式电动匀浆器匀浆组织样本。每次使用后，用双蒸水清洗杵头，并用洁净纸巾擦干。在不同实验条件或不同组织之间应更换杵头。
   4. 匀浆后将样本置于冰上静置 10....

结果

我们提供了使用 TPS 和内参标准的示例，以促进不同组织和时间点之间蛋白质水平的比较。图1展示了从新生小鼠（出生后第5天）和成年小鼠（10周龄）获取的组织中提取的蛋白质进行 Western 印迹分析的结果。TPS 和 Smn 的免疫印迹结果见图1A、C。通过测量每条泳道矩形框内的荧光强度，对 TPS 的荧光强度进行定量，结果列于图1B和1D的表格中。需要注意的是，来自不同组织的样品具有不同的 TPS 蛋白条带模式，因此有必要使用整条泳道进行归一化。事实上，当对整条泳道进行分析时，各样品间的荧光强度相对接近，表明 TPS 适合作为归一化的参照。此外，实验中还包含了一个由 P5 小鼠脑组织裂解液混合物组成的内参标准，以说明其在不同印迹膜之间进一步比较中的应用。此外，在图2中.......

讨论

通过适当的实验设计、对照措施和统计分析，Western blotting 可用于对各种生物样本内及样本间的蛋白质表达水平进行可靠的定量估计。本文所述方案旨在为研究人员提供一个指南，帮助其利用荧光检测方法、总蛋白上样归一化以及内参标准，对更大规模且更复杂的样本组进行定量分析。尽管本文重点在于测定并比较不同小鼠组织及不同年龄阶段的蛋白质表达水平，但该方法也可拓展应用于其他实验条件下蛋白质表达的比较研究。

当前实验方案中的一个关键步骤是通过定量荧光总蛋白染色，将目标蛋白归一化到所加载的总蛋白量。总蛋白染色（TPS）归一化可校正样品上样差异以及蛋白定量方法中的误差。然而，由于单张膜上可分析的蛋白样品数量通常有限，因此在比较多张膜时可能需要进一步归一化。实际上，不同膜之间蛋白检测的差异（例如由于抗体孵育时间或温度波动所致）可能导致超出上样和定量步骤所引入的变异。为此，我们使用一种内部标准品，该标准品由单一蛋白裂解液混合物组成，并在每块凝胶上以三复孔形式上样，从而实现凝胶/膜之间的比较与归一化。理论上，该标准品可以是任何蛋白样品，只要其能够制备出足够量，以确保所有实验中使用完全相同的样品。在我.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细尖端凝胶上样吸头	Alpha Laboratories	GL20057SNTL
Halt 蛋白酶抑制剂混合物（无 EDTA），100 倍浓缩液，5 mL	ThermoFisher Scientific	78437
手持式匀浆器	VWR Collection	431-0100
iBlot 2 蛋白转膜仪	ThermoFisher Scientific	IB21001
iBlot 转膜套装，PVDF 膜，标准尺寸	ThermoFisher Scientific	IB401031
Image Studio Lite	Licor	N/A	可从 https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ 免费下载
IRDye 800CW 二抗	Licor	--	选择针对一抗宿主物种的合适二抗。
Micro BCA 蛋白定量检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	23235
Novex Sharp 预染蛋白标准品	ThermoFisher Scientific	LC5800
NuPAGE 4–12% Bis-Tris 蛋白凝胶，1.0 mm 厚，15 孔	ThermoFisher Scientific	NP0323BOX
NuPAGE LDS 上样缓冲液（4×）	ThermoFisher Scientific	NP0007
NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液（20×）	ThermoFisher Scientific	NP0001
Odyssey 封闭缓冲液	Licor	927-40000
纯化小鼠抗 SMN（运动神经元存活蛋白）单克隆抗体	BD Transduction Laboratories	610646	在 SMN/SMA 相关文献中被广泛使用，不同批次均能获得稳定一致的结果
REVERT 全蛋白染色液，250 mL	Licor	926-11021
REVERT 洗涤液	Licor	926-11012
RIPA 裂解与提取缓冲液	ThermoFisher Scientific	89900
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher Scientific	EI0001