本文介绍了两种利用化学遗传学在小鼠中长期无创调控神经元活性的方法。通过滴眼液每日递送氯氮平-N-氧化物（CNO）。我们还描述了两种在饮水中长期给予CNO的方法。这些实现慢性神经元调控的策略所需干预极少，可显著降低动物的应激反应。
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本文内容
摘要
摘要
化学遗传学策略已成为远程调控神经元活动的可靠工具。其中，仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）已成为现代神经科学中最常用的化学遗传学方法。大多数研究通过单次腹腔注射配体氯氮平-N-氧化物（CNO）来实现，适用于对目标神经元群体进行急性激活或抑制。然而，目前可用于长期调控DREADD控制神经元的策略较少，且多数依赖需要手术干预的递送系统。本文扩展了两种非侵入性向小鼠递送配体CNO以实现神经元群体长期操控的策略：CNO可通过重复（每日）滴眼给药，或通过动物的饮用水长期给予。这些非侵入性范式可导致设计受体的稳健激活，并在CNO处理期间持续存在。本文所述方法为DREADD介导的神经元活动长期调控提供了替代方案，可能适用于旨在评估自由活动动物行为的研究，尤其适用于探索更少侵入性的CNO递送方式。
引言
神经科学领域的技术进步使科学家能够精确定位并控制特定神经元群体的活动1。这不仅有助于更深入地理解神经回路的基础及其对动物行为的影响，还推动了对已有理论的重新审视2,3。在这些新兴工具中，光遗传学和化学遗传学策略不仅显著提升了科研发现的质量，也深刻改变了实验的设计思路与实施方式4。本文重点介绍通过工程化受体-配体策略调控神经元激活的化学遗传学方法。由Roth于2016年综述的“仅由设计药物激活的设计受体”（DREADDs）是目前最常用的远程调控神经元活动的化学遗传学工具之一5。DREADDs利用经过修饰的毒蕈碱型乙酰胆碱受体，该受体可被一种惰性配体——氯氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide, CNO）特异性激活6。
大多数研究采用腹腔（i.p.）注射的方式给予CNO，这种方法能够以急性方式有效控制工程受体激活的剂量和时间。然而，当需要重复或长期激活DREADD时，多次腹腔注射便变得不可行。为解决这一问题，已有多种用于长期递送CNO的策略被报道，包括植入式微泵7和颅内套管8,9。这些策略在不同程度上均会引起动物的应激和疼痛10，并且需要外科手术干预，而手术本身也可能直接影响待测的行为反应11。本文中，我们描述了三种用于长期递送CNO的非侵入性策略。
为此，将编码兴奋性M3毒蕈碱受体（hM3Dq）工程化版本的腺相关病毒（AAV）通过立体定位注射至小鼠海马区；当该受体被配体CNO激活时，可导致神经元呈爆发样放电6。先前研究表明，单次滴眼给予含CNO的眼药水即可有效引发表达DREADD的神经元产生强烈激活12。本文中，我们描述了一种改进的重复滴眼给药方法。为了实现对设计受体的长期且持续的调控，我们进一步介绍了一种通过饮水非侵入性递送CNO至小鼠体内的策略。最后，我们描述了另一种在限定时间段内通过饮水递送CNO的替代方案。小鼠的运动活动、饮水行为以及对甜味高热量溶液的摄取主要集中在明暗循环的暗期13,14。因此，我们采用了一种基于小鼠对蔗糖偏好的给药方案。通过检测AAV感染细胞中即早基因c-Fos的表达水平作为神经元激活的指标12,15，我们发现这些CNO递送策略可在较长时间内有效激活由DREADD控制的神经元。
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方案
所有动物实验均遵循国家精神卫生研究所（NIMH）动物护理与使用委员会的指导原则。所有努力均旨在尽量减少动物所受的痛苦及其使用数量。
1. 海马体内的腺相关病毒注射
注意： 混合背景的野生型雄性小鼠（B6/129 F1 杂交，3 月龄）接受立体定位注射 将编码M3毒蕈碱受体（hM3Dq）的腺相关病毒（AAV）注射至海马体。整个实验期间，小鼠均单只饲养，维持在12小时光照：12小时黑暗（T24）的常规光照周期下，并可自由获取食物和水 随意摄取.
- 进行立体定位手术前，需清洁并灭菌立体定位仪及所有所需器械。
注意：可使用手术巾以维持无菌区域，并减少小鼠的热量散失。 - 使用异氟烷对小鼠进行深度麻醉。首先将氧气流量计调节至约 1.5 L/min，然后将异氟烷挥发罐调节至诱导阶段约 3–5%，维持阶段约 1–3%。
- 为确认动物已完全失去意识，可轻捏小鼠足爪；当捏压刺激不再引起肢体抽动反应时，表明麻醉效果充分。
- 将小鼠置于加热垫上，以维持其体温稳定。
- 剃除头部顶部毛发，并将小鼠头部固定于立体定位仪上。随后在眼部涂抹眼用保护润滑剂，使用聚维酮碘和 70% 乙醇擦拭清洁手术区域，并用无菌手术刀暴露颅骨。
- 将仪器校准至前囟点，然后在内侧-外侧坐标 2.9 mm、前脑-后脑坐标 -2.7 mm 处钻孔，以定位海马体。
注意：若需注射其他脑区，应参考 Paxinos 与 Franklin 小鼠脑图谱16确定相应的注射坐标。 - 暴露脑组织后，使用微量注射器和拉制的微毛细玻璃管，在背侧-腹侧深度 -3.0 mm 处向海马体单侧注射 90 nL 的 AAV（图 1A）。
注意：本实验所用 AAV 滴度详见材料表。针对其他脑区，可根据需要调整 AAV 注射体积。 - 手术结束后，使用尼龙缝线缝合切口，并在伤口局部涂抹抗生素。
- 术后立即以及术后 4–6 小时，系统性给予镇痛药物（丁丙诺啡，0.1 mg/kg）。
- 自注射后第 4 周开始，对小鼠实施下文所述任一实验范式，以长期调控表达设计型兴奋性受体的神经元。
2. 使用眼药水重复给予CNO
- 在给予眼药水前3-4天，每天对小鼠进行3分钟的抓颈适应训练，使其适应操作。
- 将氯氮平-N-氧化物（Clozapine-N-oxide, CNO，5 mg）溶解于1 mL无菌0.9%生理盐水中（储备液浓度：5 mg CNO/mL）。将溶液置于4 °C冰箱中保存。
- 实验开始前称量每只小鼠的体重，以确定所需给予的CNO剂量。每眼使用1-3 μL滴液，使CNO剂量达到1.0 mg/kg体重。
注：例如，一只20 g的小鼠应接受双侧（每眼2 μL）眼药水。 - 在小鼠的非活动期（光照期），于关灯前2小时（zeitgeber time (ZT) 10）给予眼药水。若需在小鼠活动期（黑暗期）给予CNO，操作时应确保使用微弱红光，以便安全处理动物。
注：应注意避免干扰实验动物的昼夜节律（及光/暗周期）。- 使用P10微量移液器吸取所需体积（1-3 μL）的CNO溶液，以达到1.0 mg CNO/kg剂量。
注：每次滴眼应使用新的无菌枪头。本实验中采用双侧滴眼；但若需较低CNO浓度，也可采用单侧滴眼。 - 通过抓颈法固定小鼠。
- 缓慢排出溶液，直至移液器尖端形成稳定的液滴。
- 小心将液滴靠近小鼠角膜，直至溶液被吸收。移液器尖端不得接触小鼠眼部。
- 释放小鼠，并将其放回原笼具中。
- 使用P10微量移液器吸取所需体积（1-3 μL）的CNO溶液，以达到1.0 mg CNO/kg剂量。
- 每日重复该操作，持续5天。
注：此持续时间可根据实验需求进行调整。 - 对照实验中，使用注射AAV/DREADD并接受假处理（仅含生理盐水的眼药水）的小鼠，以及注射空载体（如AAV/mCherry）并接受上述CNO眼药水处理方案的小鼠。
3. 通过饮水给予慢性CNO处理
- 使用50 mL（塑料）锥形管和橡胶塞导嘴制作小瓶，并用铝箔包裹以避免光照对CNO稳定性产生影响。
- 在开始CNO处理前3天，将普通水瓶更换为含有10 mL普通水的小瓶，以使小鼠适应。使用胶带将小瓶固定在笼子上。
- 测量每只小鼠的每日饮水量。
- 实验开始前称量每只小鼠的体重。
- 将氯氮平-N-氧化物（CNO，5 mg）溶解于1 mL 0.9%无菌生理盐水中。将储备液于4 °C冷藏保存。
- 根据体重和平均饮水量确定CNO溶液的浓度，以达到每千克体重给予1.0 mg CNO。
注意：成年雄性小鼠（体重约20 g）每天饮水量约为5 mL（图 2A因此，为达到1 mg CNO/kg的浓度，应将6.4 μL的CNO储备液加入最终体积为8 mL的水中（终浓度：4 μg CNO/mL）。因此，对于每日饮水量为5 mL的20 g动物，其CNO剂量为1 mg CNO/kg。 - 通过测试一系列浓度，确定在最低CNO浓度下显示最大有效性的最佳CNO剂量。进行剂量反应分析，以确定饮水法的最佳CNO剂量。
注意：本实验测试了以下CNO剂量：1.0 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.1 mg/mL以及生理盐水。首次测试剂量为1.0 mg CNO/kg，依据腹腔注射和滴眼液给药方案确定。 - 第1天，用8 mL普通水填充瓶子，并加入所需量的CNO。
注意：此水量足以维持 24 小时 随意摄取 成年雄性小鼠的饮水获取。若使用其他啮齿类动物，则需先测量其每日饮水消耗量，以确定所需体积。 - 在整个实验过程中监测动物的健康状况，以确保饮水加CNO摄入未引起任何不良副作用。
- 24小时后，更换为新鲜水+ CNO溶液。记录前一天消耗的体积。
- 将未使用完的水+CNO溶液弃置于废液容器中。丢弃塑料瓶，并根据动物实验设施指南对橡胶塞进行消毒后每日更换。
注意：请勿将水性废液与有机溶剂混合。有关储存和回收的具体指示，请联系化学品处理服务中心。 - 每天同一时间更换瓶子，持续5天。
注意：此持续时间可根据实验要求进行调整。 - 如步骤 2.6 所述，设置对照组。
4. 利用小鼠对蔗糖的偏好进行受限的CNO处理
- 开始CNO处理前3天，在笼子中放置一个装有10 mL水+1%蔗糖的小瓶，最好远离原有的水瓶。
注意：使用步骤3.1中所述的相同类型小瓶。 - 在动物活跃期的最后阶段（ZT 18 – 24）让其接触水+1%蔗糖。暴露结束后，将含有水+1%蔗糖的小瓶从笼中移除。
注意：可采用不同的CNO给药时间段。此外，可将小鼠置于倒置的光/暗循环条件下，即光照在傍晚开始，以方便CNO给药。 - 测量每只小鼠每日对水+1%蔗糖的消耗量。
- 实验开始前称量每只小鼠的体重。
- 根据小鼠体重及平均消耗的水+1%蔗糖量，确定CNO溶液的给药剂量，以达到1.0 mg CNO/kg（体重）的目标剂量。
注意：应测试显示最大效果且CNO浓度最低的最佳CNO剂量，具体方法见步骤3.6。 - 第1天，在小瓶中加入5 mL水+1%蔗糖+CNO（1 mg CNO/kg），并在预定的时间段内将其放置于笼中（始终放在相同位置）。
- 在限定时间窗口结束时，移除小瓶并测量水+蔗糖+CNO的消耗量。
注意：材料和溶液按照步骤3.11中所述方法进行消毒或丢弃。 - 每天重复此操作，持续5天。
注意：此持续时间可根据实验需求进行调整。 - 设置对照组，具体方法见步骤2.6。
5. 数据分析
- 在最后一次重复给予CNO滴眼液（第5天）后的2小时或6小时，对小鼠进行4%多聚甲醛（PFA）经心脏灌注。若通过饮水给予CNO，则在小鼠活跃期结束时将CNO+水替换为纯水，随后在停止接触CNO后的2小时或6小时进行灌注。
注意：如果光照可能影响目标区域c-Fos的诱导，请在实验最后一天及灌注前将小鼠置于持续黑暗环境中。 - 小心取出脑组织，并浸入4% PFA溶液中固定9–12小时。
- 经PFA固定后，使用30%蔗糖溶液对脑组织进行冷冻保护（待脑组织沉底后），再使用冷冻切片机进行切片。
- 将冠状面脑切片（35 μm）转移至含1×PBS、10%牛血清白蛋白和0.3% Triton X-100的溶液中，在室温下孵育1小时。
- 在4 °C条件下，将脑切片与抗c-Fos一抗（1:2500）溶液共同孵育过夜，并持续震荡。
- 用含1×PBS和0.3% Triton X-100的溶液洗涤3次，每次5分钟；随后在避光、室温条件下，将样本与Alexa荧光标记的二抗（1:500）溶液共同孵育1小时，并持续震荡。
- 使用共聚焦显微镜获取数字图像，并利用图像编辑与分析软件（例如Adobe Photoshop）对采集的图像进行拼接和处理。
- 数据分析时，使用ImageJ软件勾画并测量AAV感染区域（mCherry(+)细胞），统计该区域内c-Fos(+)细胞的数量，以获得单位面积内的激活细胞数。合并每只动物3张独立切片的结果进行分析。
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结果
我们观察到，使用滴眼液重复递送CNO可在大多数感染的神经元中 robust 地诱导 c-Fos 表达（图1C），表明CNO递送的有效性在重复暴露期间得以维持。此外，与CNO暴露后6 h采集的样本相比，CNO处理后2 h采集的样本中c-Fos的诱导显著增强（图1D-E），表明CNO诱导的变化具有时间依赖性。
随后，我们检测了通过饮水给予的慢性CNO处理的效果。我们观察到，水+ CNO的每日消耗量与常规水的总消耗量相比无显著差异（图 2A）。同样，在夜间（6小时时间窗）摄入的水+1%蔗糖溶液的量也未因添加CNO而受到影响图2B）。此外，在5天内对水+CNO的每日消耗量未见差异（图2C）以及水 + 蔗糖 + CNO（图 2D在整个实验过程中，所有动物均发现了上...
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讨论
DREADDs 已成为一种流行且有效的远程操控神经元活动的方法17。设计氯氮平-N-氧化物（CNO）递送的替代策略，将广泛拓展特定实验条件下可用的方法选择范围。此外，采用非侵入性方式递送 CNO 可减少可能直接影响动物健康的不良副作用，从而最大限度地避免实验结果的潜在误读。本文中，我们描述了两种用于递送 CNO 的非侵入性策略，这两种方法均可有效激活 DREADDs（hM3Dq），并提供广泛的应用可能性。我们还认为，本文所述的实验方案可能同样适用于其他类型的 DREADD 变体，用于神经元操控，包括基因工程改造的毒蕈碱型或阿片类受体。
通过重复滴眼给药的方式递送CNO，是一种无痛的替代方法，可取代重复的腹腔注射CNO，同时仍能精确控制CNO的剂量和给药时间。因此，当需要重复激活DREADD时，我们推荐使用本方案。滴眼给药也是成本最低的CNO递送方式，尤其相较于将CNO加入饮用水中的方案。另一方面，通过饮用水递送CNO可实现DREADD的慢性且持续的激活，并避免反复抓取小鼠操作。需要指出的是，该方案无法精确控制CNO给药的时间。第三种替...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了美国国家精神卫生研究所内部研究计划（ZIA MH002964-02）的资助。我们感谢NIMH IRP啮齿类动物行为核心（ZIC MH002952）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BSA | Sigma生命科学 | #A2153-100G | 冻干粉末 ≥96%（琼脂糖凝胶电泳） |
| C57BL/6J小鼠 | 杰克逊实验室 | #000664 | 雄性小鼠，3月龄 |
| 毛细管 | Drummond科学公司 | #3-000-203-G/X | 外径：1.14英寸 |
| 氯氮平-N-氧化物 | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| 异氟烷 | Baxter | #NDC 10019-360-60 | 异氟烷，USP |
| Microinjector III | Drummond科学公司 | #3-000-207 | Nanoject III — 可编程纳升级注射器 |
| 封片介质 | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold抗荧光淬灭封片试剂 |
| 多聚甲醛 | 电子显微镜科学公司 | #15710 | 16%水溶液（无甲醇），10 mL |
| 一抗 c-Fos 抗体 | 细胞信号技术公司 | #2250S | c-Fos (9F6) 兔单克隆抗体（100µL） |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC病毒载体核心实验室 | 滴度：~3 × 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC病毒载体核心实验室 | 滴度：~3×10e12 vg/mL | |
| 二抗 | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 驴抗兔 IgG(H+L)，2 mg/mL |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
参考文献
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