非侵入性策略用于长期调控DREADD控制的神经元活动

摘要

本文介绍了两种利用化学遗传学在小鼠中长期无创调控神经元活性的方法。通过滴眼液每日递送氯氮平-N-氧化物（CNO）。我们还描述了两种在饮水中长期给予CNO的方法。这些实现慢性神经元调控的策略所需干预极少，可显著降低动物的应激反应。

摘要

化学遗传学策略已成为远程调控神经元活动的可靠工具。其中，仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）已成为现代神经科学中最常用的化学遗传学方法。大多数研究通过单次腹腔注射配体氯氮平-N-氧化物（CNO）来实现，适用于对目标神经元群体进行急性激活或抑制。然而，目前可用于长期调控DREADD控制神经元的策略较少，且多数依赖需要手术干预的递送系统。本文扩展了两种非侵入性向小鼠递送配体CNO以实现神经元群体长期操控的策略：CNO可通过重复（每日）滴眼给药，或通过动物的饮用水长期给予。这些非侵入性范式可导致设计受体的稳健激活，并在CNO处理期间持续存在。本文所述方法为DREADD介导的神经元活动长期调控提供了替代方案，可能适用于旨在评估自由活动动物行为的研究，尤其适用于探索更少侵入性的CNO递送方式。

引言

神经科学领域的技术进步使科学家能够精确定位并控制特定神经元群体的活动¹。这不仅有助于更深入地理解神经回路的基础及其对动物行为的影响，还推动了对已有理论的重新审视^2,3。在这些新兴工具中，光遗传学和化学遗传学策略不仅显著提升了科研发现的质量，也深刻改变了实验的设计思路与实施方式⁴。本文重点介绍通过工程化受体-配体策略调控神经元激活的化学遗传学方法。由Roth于2016年综述的“仅由设计药物激活的设计受体”（DREADDs）是目前最常用的远程调控神经元活动的化学遗传学工具之一⁵。DREADDs利用经过修饰的毒蕈碱型乙酰胆碱受体，该受体可被一种惰性配体——氯氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide, CNO）特异性激活⁶。

大多数研究采用腹腔（i.p.）注射的方式给予CNO，这种方法能够以急性方式有效控制工程受体激活的剂量和时间。然而，当需要重复或长期激活DREADD时，多次腹腔注射便变得不可行。为解决这一问题，已有多种用于长期递送CNO的策略被报道，包括植入式微泵⁷和颅内套管⁸

方案

所有动物实验均遵循国家精神卫生研究所（NIMH）动物护理与使用委员会的指导原则。所有努力均旨在尽量减少动物所受的痛苦及其使用数量。

1. 海马体内的腺相关病毒注射

注意： 混合背景的野生型雄性小鼠（B6/129 F1 杂交，3 月龄）接受立体定位注射 将编码M3毒蕈碱受体（hM3Dq）的腺相关病毒（AAV）注射至海马体。整个实验期间，小鼠均单只饲养，维持在12小时光照：12小时黑暗（T24）的常规光照周期下，并可自由获取食物和水 随意摄取.

1. 进行立体定位手术前，需清洁并灭菌立体定位仪及所有所需器械。
   注意：可使用手术巾以维持无菌区域，并减少小鼠的热量散失。
2. 使用异氟烷对小鼠进行深度麻醉。首先将氧气流量计调节至约 1.5 L/min，然后将异氟烷挥发罐调节至诱导阶段约 3–5%，维持阶段约 1–3%。
   1. 为确认动物已完全失去意识，可轻捏小鼠足爪；当捏压刺激不再引起肢体抽动反应时，表明麻醉效果充分。
3. 将小鼠置于加热垫上，以维持其体温稳定。
4. 剃除头部顶部毛发，并将小鼠头部固定于立体定位仪上。随后在眼部涂抹眼用保护润滑剂，使用聚维酮碘和 70% 乙醇擦拭清洁手术区域，并用无菌手术刀暴露颅骨。
5. 将仪器校准....

结果

我们观察到，使用眼药水重复递送CNO可在大多数感染的神经元中 robust 地诱导 c-Fos 表达（图1C），表明CNO递送的有效性在重复暴露期间得以维持。此外，与CNO暴露6小时后采集的样本相比，CNO处理2小时后采集的样本中c-Fos的诱导显著增加（图1D-E），表明CNO诱导的变化具有时间依赖性。

随后，我们检测了通过饮水给予的慢性CNO处理的效果。我们观察到，每日饮用的水+CNO的消耗量与常规水的总消耗量相比无显著差异（图2A）。同样，在夜间（6小时时间窗口）对水+1%蔗糖的摄取量也不受CNO添加的影响（图2B）。此外，在整个实验过程中（5天），所有动物对水+CNO（图2C）和水+蔗糖+CNO（图2D）的每日消耗量均未发现显著差异。

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讨论

DREADDs 已成为一种流行且有效的远程操控神经元活动的方法¹⁷。设计氯氮平-N-氧化物（CNO）递送的替代策略，将广泛拓展特定实验条件下可用的方法选择范围。此外，采用非侵入性方式递送 CNO 可减少可能直接影响动物健康的不良副作用，从而最大限度地避免实验结果的潜在误读。本文中，我们描述了两种用于递送 CNO 的非侵入性策略，这两种方法均可有效激活 DREADDs（hM3Dq），并提供广泛的应用可能性。我们还认为，本文所述的实验方案可能同样适用于其他类型的 DREADD 变体，用于神经元操控，包括基因工程改造的毒蕈碱型或阿片类受体。

通过重复滴眼给药的方式递送CNO，是一种无痛的替代方法，可取代重复的腹腔注射CNO，同时仍能精确控制CNO的剂量和给药时间。因此，当需要重复激活DREADD时，我们推荐使用本方案。滴眼给药也是成本最低的CNO递送方式，尤其相较于将CNO加入饮用水中的方案。另一方面，通过饮用水递送CNO可实现DREADD的慢性且持续的激活，并避免反复抓取小鼠操作。需要指出的是，该方案无法精确控制CNO给药的时间。第三种替.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BSA	Sigma生命科学	#A2153-100G	冻干粉末 ≥96%（琼脂糖凝胶电泳）
C57BL/6J小鼠	杰克逊实验室	#000664	雄性小鼠，3月龄
毛细管	Drummond科学公司	#3-000-203-G/X	外径：1.14英寸
氯氮平-N-氧化物	Sigma	#C0832	5 mg
异氟烷	Baxter	#NDC 10019-360-60	异氟烷，USP
Microinjector III	Drummond科学公司	#3-000-207	Nanoject III — 可编程纳升级注射器
封片介质	Invitrogen	#P36930	Prolong Gold抗荧光淬灭封片试剂
多聚甲醛	电子显微镜科学公司	#15710	16%水溶液（无甲醇），10 mL
一抗 c-Fos 抗体	细胞信号技术公司	#2250S	c-Fos (9F6) 兔单克隆抗体（100µL）
rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry	UNC病毒载体核心实验室		滴度：~3 × 1012 vg/mL
rAAV5/hSyn-mCherry	UNC病毒载体核心实验室		滴度：~3×10e12 vg/mL
二抗	Invitrogen	#A21206	Alexa Fluor TM 488 驴抗兔 IgG(H+L)，2 mg/mL
Triton X-100	americanbio.com	#AB02025-00100