本文介绍了在两种哺乳动物（一种食虫动物和一种食肉动物）中使用重水稀释技术测定总体水、瘦体重、体脂量以及水消耗量的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
体况评分系统和体况指数是评估物种健康状况或适应度的常用技术。体况评分系统依赖于评估者的主观判断，可能具有高度主观性。体况指数可能受到觅食行为、体重影响以及统计学和推断问题的干扰。一种替代体况评分系统和体况指数的方法是使用稳定同位素（如重水）来测定身体组成。重水稀释法是一种可重复、定量的技术，可用于估算人类、野生动物和家养动物的身体组成。此外，重水稀释技术还可用于测定单个动物的饮水量。本文中，我们描述了将重水稀释技术应用于大棕蝠（Eptesicus fuscus）身体组成的评估，以及用于家猫（Felis catus）饮水量测定的方法改良。
引言
体况评分系统和体况指数是用于评估物种健康状况或适应性的常用技术1,2。许多家养动物和动物园物种均有独特的体况评分（BCS）系统，用于评估动物的肌肉和皮下脂肪组织3。然而，BCS评估依赖于评估者的判断——这意味着当由经过培训的评估者进行评定时，BCS仍属于主观或半定量测量。在野生动物研究中，通常使用体况指数而非BCS，该指数基于体重与体长之比或体重与前臂长度之比2。体况指数常受到摄食活动的影响，同时也可能受到个体体型大小以及统计学和推断方法问题的干扰4。
一种替代体况评分系统和体况指数的方法是使用稳定同位素来测定身体组成。一种常用的稳定同位素是重水（D2O），它是水的一种非放射性形式，其中氢原子为氘同位素。本研究中描述的重水稀释法是一种客观、定量且可重复的技术，可用于估算人类5以及多种物种4,6,7的身体组成。该技术在野生动物身体组成研究中具有优势。例如，可用于评估管理措施实施前后身体组成的纵向变化。然而，在某些野生动物物种中，重水可能会高估实际的水分含量8。因此，在将该技术应用于某一物种时，应通过将重水法与非濒危物种的尸体分析进行比较，以验证该方法的准确性。对于受威胁或濒危物种，应考虑采用双能X射线吸收测定法（DXA）等非破坏性方法，作为与完整的尸体分析这一金标准破坏性方法相对比的替代方案。
除了体成分分析外，重水（D2O）稀释法还可用于测定单个动物的饮水量9。这种重水（D2O）的独特应用不仅可用于回答科研问题，还可用于评估在大型群居环境中饲养的单个或多个动物的饮水情况。
本文介绍了重水（D2O）稀释法的改进应用，用于评估食虫动物——大棕蝠（Eptesicus fuscus）的身体成分，以及用于评估食肉动物——家猫（Felis catus）的饮水量。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本文所述所有实验均经密苏里大学动物护理与使用委员会批准，并在密苏里州自然资源保护部（MDC）野生动物科学研究采集许可证（许可证号 #16409 和 #17649）下进行。
1. 无菌、等渗、含盐 D2O 储存液的制备
- 配制50 mL浓度为9.0 g/L的盐化D2O储备液。
- 称取450 mg药用级NaCl，并将全部NaCl转移至一个100 mL的无菌烧杯中。在实验记录本中精确记录NaCl的质量，保留至小数点后四位。
- 使用无菌量筒量取50 g、纯度≥99.8%的重水（氧化氘），并转移至含有NaCl的无菌烧杯中。在实验记录本或电子表格中精确记录重水的质量，保留至小数点后四位。
- 将10 mL等渗浓度的NaCl溶液（9.0 g/L）通过带有亚微米孔径（0.2 µm）的无热原无菌滤膜进行过滤。
- 将一支20 G针头连接至带有10 mL注射器筒的、具亚微米孔径（0.2 µm）的无热原无菌滤膜上。将针头插入一个100 mL无菌空瓶的隔膜中。
- 将真空管连接至一支22 G针头，并将该针头插入100 mL无菌空瓶的隔膜中。
- 将10 mL储备液倒入注射器筒中。缓慢开启真空，使D2O储备液开始缓慢滤入无菌瓶中。持续将D2O储备液倒入注射器筒，直至全部50 mL溶液完成过滤。
注：储备液可能需要根据所需剂量进行稀释或浓缩。D2O的剂量取决于物种及分析方法的灵敏度。对于猫，工作液用于给予0.7 g/kg的D2O剂量。上述储备液可最大限度减少皮下注射给动物时引入的NaCl溶液体积，同时仍能准确测量给药剂量。对于蝙蝠等小型哺乳动物，必须将该浓度稀释为如0.1600 g/mL的工作液。此浓度可确保在约100 µL或更少的NaCl溶液中准确测量并给予0.75 g/kg的D2O剂量。
2. 蝙蝠用无菌等渗盐化D2O储备工作溶液的制备
- 称取一个10 mL的空无菌瓶，记录重量至小数点后四位。将天平去皮归零。
- 使用1.0 mL注射器将0.65 mL的D2O储备液转移至已去皮的10 mL空无菌瓶中。记录D2O的重量至小数点后四位。将天平去皮归零。
- 计算10 mL空瓶中D2O的体积。使用以下公式：
其中 W 为记录的重量，D 为99.8% D2O的密度（1.107 g/mL）。 - 利用计算所得的D2O体积及其已知质量，确定配制约0.1600 g/mL工作液所需的等渗盐水体积。
- 将连接真空管的22 G针头插入10 mL无菌瓶的隔垫中；再将连接有0.22 µm注射式滤器（安装于10 mL注射器筒上）的20 G针头插入同一无菌瓶的隔垫中。
- 将计算所得质量/体积的等渗NaCl溶液倒入注射器筒中，开启真空，使其缓慢滴入10 mL无菌瓶中。
- 记录瓶的总重量，确保已配制成约0.1600 g/mL的工作液。
3. 利用D2O测定大棕蝠（Eptesicus fucsus）的身体成分
注意：本方案中使用的 D2O 储备溶液浓度为 0.1598 g/mL。采血前，需确保采集不超过 200 µL 的血液体积不超过蝙蝠总血容量的 10%，并符合机构动物护理与使用委员会（IACUC）规定的采血指南。所有动物均应禁食或通过腹部触诊确认胃部为空。近期进食可能改变动物体重，由于测定体脂率的计算依赖于动物体重，这将导致结果混淆。
- 麻醉一只大棕蝠。
- 使用5.0%异氟烷进行诱导，以0.5%−3.0%异氟烷维持稳定的麻醉深度。
- 通过测试足部回缩反射（捏压蝙蝠脚趾）判断麻醉深度是否合适。蝙蝠不应对此刺激产生反应，且呼吸频率应保持缓慢稳定。根据需要调整异氟烷浓度，以维持稳定的麻醉状态。
- 按照IACUC要求记录异氟烷浓度、心率、呼吸频率及其他相关信息。
- 称量大棕蝠体重，并将重量记录至小数点后四位。
- 使用酒精棉片清洁股间膜（尾膜）上覆盖股间静脉的区域，待其自然干燥。在股间静脉上方涂抹一层薄薄的凡士林。
- 使用29 G针头穿刺股间静脉的背侧部分，用塑料肝素钠毛细管采集100 µL血液。采集后轻轻滚动每根毛细管，确保全血与肝素钠充分混合，并对毛细管进行标记。
- 使用已校准用于小型哺乳动物的DXA仪器，对蝙蝠进行三次DXA扫描10。
- 通过将蝙蝠体重（kg）乘以D2O剂量0.75 g/kg，计算需注射的D2O质量（g）。将计算所得的D2O质量除以工作液浓度，得到所需D2O的体积（V）。
- 使用带29 G针头的胰岛素注射器抽取计算所得体积的D2O。称量D2O、胰岛素注射器及针头的总重量，并记录至小数点后四位。
- 将D2O注射至麻醉状态下蝙蝠背部髋部区域的皮下组织。
- 让蝙蝠从麻醉中恢复，并记录注射时间。
- 注射后立即称量已空的带29 G针头的胰岛素注射器，重量记录至小数点后四位。
- 通过从注射前含D2O的胰岛素注射器重量中减去注射后的空注射器重量，计算实际注射的D2O剂量，并记录至小数点后四位。
- 在采血后30分钟内，使用血细胞比容离心机以10,000 x g转速（若离心机支持多档转速）对每根毛细管离心5分钟。
- 使用锋利剪刀在全血与血浆交界处剪断塑料毛细管。使用200 µL移液器将血浆直接吹入已标记的500 µL储存管中。
- 经过平衡期后，再次从股间静脉采集100 µL血液。
注：平衡期因物种及蝙蝠是否进入蛰伏状态而异。对于大棕蝠，通常2小时足以完成平衡期。 - 通过重复步骤3.13，将血浆分离至第二个已标记的500 µL带螺帽微量离心管中。样品储存于-20 °C或更低温度，直至分析。
4. 傅里叶变换红外光谱分析
- 将沙浴温度设定为 60 °C，以促进蒸馏（使水和 D2O 与其他血液成分分离）。
- 用移液器将每份血浆样品和标准品各 50 µL 加至 1.5 mL 锥形微量离心管管盖内侧。标准品应包含已知浓度的 D2O，用于质量控制。
注：理想情况下，每只动物每个样品应设置三个重复，并报告三个重复的平均值。由于样品体积有限，以及作者所使用的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）设备所需的样品体积，蝙蝠样品未进行重复测定。若任一样品血浆体积少于 50 µL，则将全部样品体积加至锥形微量离心管管盖内侧，并记录实际体积。 - 将微量离心管盖倒置，拧上 1.5 mL 锥形微量离心管。将倒置（管盖朝下）的离心管放入沙浴中，使管盖与沙子接触，至少放置 12 小时（过夜）。
- 12 小时后，取下管盖并更换为新的洁净管盖。在离心机中瞬时离心 10 秒。
- 配制以下标准品：0 ppm（1 L 蒸馏水中含 0 mg D2O）、293 ppm（1 L 蒸馏水中含 293 mg D2O）、585 ppm（1 L 蒸馏水中含 585 mg D2O）、878 ppm（1 L 蒸馏水中含 878 mg D2O）和 1170 ppm D2O（1 L 蒸馏水中含 1170 mg D2O）。
注：上述数值建议用于标准曲线。也可使用其他数值，如 250 ppm、500 ppm、750 ppm 等。 - 将液体透射池安装至傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）中（材料表）。用甲醇填充透射池并连接进样口。在小心移除甲醇注射器的同时，缓慢注入背景水，以降低产生气泡的风险。在出口端连接管路，以便分析后排出样品。
- 设置 FTIR 光谱仪软件（材料表）以分析水中 D2O。本实验方案所用光谱仪软件的参数设置见表 1。
- 使用稀释液（0.22 µm 滤膜过滤的蒸馏水）采集背景光谱。该水应与配制标准品所用水相同。
- 注入 40 µL 的 0 ppm D2O 标准品并记录光谱。将光谱数据保存为逗号分隔值（CSV）文件。
- 继续依次注入并保存所有标准品的光谱，以建立标准曲线。
- 每 60−90 分钟重复一次背景和标准曲线测定。
- 将每份蒸馏后样品 40 µL 注入液体透射池，并保存光谱。
注：根据液体透射池的体积调整标准品和蒸馏样品的进样体积。若样品体积低于 40 µL，可使用更小体积的透射池，或用背景蒸馏水 1:1 稀释后进样。 - 使用电子表格软件（如 Jennings 等人11所述）或光谱分析软件，根据 FTIR 光谱确定各样品中 D2O 的浓度。若进行了重复测定，则采用平均浓度计算体成分。
5. 身体成分的计算
- 使用以下公式12将每个样品的氘富集度（ppm）转换为原子百分比浓度：
其中 x 为测得的样品氘富集度（ppm），0.0001557 为维也纳标准平均海水（VSMOW）中报道的氘的摩尔分数13。 - 使用以下公式4，12，14计算每个样品的总体水含量：
)
其中 E 为背景校正后测得的样品中氘的富集度（原子%），B 为注射质量（g），0.998 为注入的 D2O 的浓度。
注：氘与不稳定氢发生交换会导致总体水质量被高估约 2%。应通过将总体水质量估计值减少体重的 2% 来进行校正。 - 使用以下公式估算每只蝙蝠的无脂质量（瘦体重及其他所有非脂肪组分）：
注：对于健康、正常水合状态且未哺乳的蝙蝠，采用公认的瘦体重水分比例值 0.732。哺乳期大棕蝠的无脂质量水分比例会随产后周数而变化15。对于其他物种，应使用文献中已发表的数值，或在进行瘦体重计算前先行测定其瘦体重的水分比例。 - 使用以下公式估算体脂肪质量：
- 使用以下公式将体脂肪质量（g）转换为体脂百分比：
6. 食肉动物（Felis catus，家猫）体内水分组成的测定
- 按照第1节所述方法制备储备溶液。
- 将每只猫的体重称量至小数点后三位，并记录体重。根据步骤3.6所述方法，使用0.70 g/kg的D2O剂量计算每只猫的给药剂量。
- 按照步骤3.7–3.8所述方法准备每份剂量，使用3 mL或5 mL注射器配22 G针头，而非胰岛素注射器。
- 采集500 µL全血，随后皮下注射0.7 g/kg的D2O。将全血在2,000 × g下离心15分钟，将血浆储存于1.5 mL带螺口盖的微量离心管中，于-20°C保存直至分析。
- 在注射后4小时采集500 µL全血。将全血在2,000 × g下离心15分钟，将血浆储存于1.5 mL带螺口盖的微量离心管中，于-20 °C保存直至分析。
- 在注射后14天采集500 µL全血。将全血在2,000 × g下离心15分钟，将血浆储存于1.5 mL带螺口盖的微量离心管中，于-20 °C保存直至分析。
注：采血间隔的天数可根据实验需求以及D2O在背景水平以上可检测的时间范围确定。14天是Hooper等9研究中饮食处理阶段的持续时间。 - 根据本方案第4节进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析，并根据第5节计算身体成分。
- 使用以下公式计算每日水消耗量（mL/天）：
其中TBW为总体水含量，初始D2O和最终D2O为注射后D2O样品中测得的ppm浓度。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
氘氧化物稀释法可用于评估多种物种的身体成分。为展示该方法的适用性，本文报道了首次将氘氧化物稀释法应用于北美食虫蝙蝠物种——大棕蝠（Eptesicus fuscus）以获得代表性结果。通过采集注射氘氧化物（D2O）前和注射后的血液样本，确定了平衡时间平台期，此步骤应在所有平衡期未知的物种中进行。结果表明，在非蛰伏状态的蝙蝠中，注射后两小时足以完成平衡。在已知平衡时间后，测定了13只野生捕获的大棕蝠和8只圈养大棕蝠的总体水含量、瘦体重和体脂质量（表2）。另有2只野生捕获的大棕蝠和5只圈养大棕蝠被测定为体脂质量为负值。体脂质量为负值可能由以下一个或多个原因导致：未完全接受氘氧化物剂量、在平衡期间进入蛰伏状态、具有异常大的脂肪质量而瘦体重极小，或蝙蝠体脂含量低于通过DXA测定的3%−5%（表3）。
白鼻综合征已导致多种蝙蝠种群数量下降，因此该技术被与使用...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
自20世纪40年代以来，重水已被用于测定总身体水量（TBW）17 并用于人类以及多种家养和野生动物物种4,6,7其他非破坏性技术已被开发出来，包括生物电阻抗分析（BIA）、双能X线吸收测定法（DXA）和定量磁共振（QMR）。在选择用于评估体成分的特定方法之前，应充分考虑每种方法的优缺点。本方案选择DXA作为氘代氧化物法评估体成分的比较方法，原因是该设备为大学核心资源，使用成本低，每次扫描所需时间短（每只蝙蝠30秒），且不受体温和皮肤绝缘性等变量的影响。
在将重水稀释法应用于特定物种时，应首先开展预实验，以确定达到平衡所需的时间18。可通过采集基线样本，并在注射后每隔15分钟采集一次血液样本来实现。对于蝙蝠等小型物种，可在不同时间点分别采集多只个体的血液样本，而非仅使用单一个体
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了MDC合作协议（#416）、美国林务局合作协议（16-JV-11242311-118）、美国兽医营养学会与Waltham/Royal Canin资助项目（资助编号：00049049）、美国国立卫生研究院培训资助（资助编号：T32OS011126）以及密苏里大学兽医研究学者项目的资助。作者感谢Shannon Ehlers对本文稿的预审。我们感谢Robert Backus博士提供D2O标准品并允许使用他的实验室。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 微米无热原圆盘滤膜 | Argos Technologies | FN32S | 尼龙材质，直径 30 mm，0.22 µm，无菌 |
| 1.5 mL 锥形微量离心管 | USA Scientific | 1415-9701 | 1.5 mL 自立式微量离心管，本色带蓝色盖 |
| 10 mL 无菌玻璃注射用小瓶 | Mountainside 医疗设备公司 | MS-SEV10 | 透明、无菌玻璃注射单元 |
| 10 mL 注射器 | Becton Dickinson | 305219 | 无菌 10 mL 注射器，单个独立包装 |
| 100 mL 无菌玻璃注射用小瓶 | Mountainside 医疗设备公司 | AL-SV10020 | 透明、无菌玻璃注射单元 |
| 20 号针头 | Exel | 26417 | 一次性皮下注射针头 20g × 1" 塑料接口（黄色）/普通斜面 |
| 22 号针头 | Exel | 26411 | 一次性皮下注射针头 22g × 1" 塑料接口（黑色）/普通斜面 |
| 重水 | Sigma-Aldrich | 151882-25G | 氘原子含量 99.9% |
| 异氟烷 | Vetone | 3060 | Fluriso 异氟烷，符合美国药典标准 |
| OMNIC 光谱软件 | ThermoFisher Scientific | 833-036200 | 傅里叶变换红外光谱标准软件 |
| 凡士林 | Vaseline | 305212311006 | Vaseline，100% 纯凡士林，原味，皮肤保护剂 |
| 塑料毛细管 | Innovative Med Tech | 100050 | 含肝素钠抗凝剂，容量 50 μL，长度 30 mm |
| 密封液体傅里叶变换红外光谱仪 SL-3 FTIR CAF2 池 | International Crystal Laboratory | 0005D-875 | 光程 0.05 mm |
| 氯化钠 | EMD Millipore | 1.37017 | 适用于生物制药生产 |
| Thermo Electron Nicolet 380 傅里叶变换红外光谱仪 | ThermoFisher Scientific | 269-169400 | 已停产型号，有更新型号可供选择 |
参考文献
- Schiffmann, C., Clauss, M., Hoby, S., Hatt, J. M. Visual body condition scoring in zoo animals – composite, algorithm and overview approaches. Journal of Zoo Aquarium Research. 5 (1), (2017).
- Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
- Bissell, H. Body Condition Scoring Resource Center. , https://nagonline.net/3877/body-condition-scoring/ (2017).
- McWilliams, S. R., Whitman, M. Non-destructive techniques to assess body composition of birds: a review and validation study. Journal of Ornithology. 154 (3), 597-618 (2013).
- Lukaski, H. C., Johnson, P. E. A simple, inexpensive method of determining total body water using a tracer dose of D2O and infrared absorption of biological fluids. American Journal of Clinical Nutrition. 41 (2), 363-370 (1985).
- Chusyd, D. E., et al. Adiposity and Reproductive Cycling Status in Zoo African Elephants. Obesity (Silver Spring). 26 (1), 103-110 (2018).
- Kanchuk, M. L., Backus, R. C., Calvert, C. C., Morris, J. G., Rogers, Q. R. Neutering Induces Changes in Food Intake Body Weight, Plasma Insulin and Leptin Concentrations in Normal and Lipoprotein Lipase–Deficient Male Cats. The Journal of Nutrition. 132 (6), 1730S-1732S (2002).
- Eichhorn, G., Visser, G. H. Technical Comment: Evaluation of the Deuterium Dilution Method to Estimate Body Composition in the Barnacle Goose: Accuracy and Minimum Equilibration Time. Physiological and Biochemical Zoology. 81 (4), 508-518 (2008).
- Hooper, S. E., Backus, R., Amelon, S. Effects of dietary selenium and moisture on the physical activity and thyroid axis of cats. Journal of Animal Physiolgy and Animal Nutrition (Berl). 102 (2), 495-504 (2018).
- Stevenson, K. T., van Tets, I. G. Dual-Energy X-Ray Absorptiometry (DXA) Can Accurately and Nondestructively Measure the Body Composition of Small, Free-Living Rodents. Physiological and Biochemical Zoology. 81 (3), 373-382 (2008).
- Jennings, G., Bluck, L., Wright, A., Elia, M. The use of infrared spectrophotometry for measuring body water spaces. Clinical Chemistry. 45 (7), 1077-1081 (1999).
- Beuth, J. M. Body Composition, movemement phenology and habitat use of common eider along the southern new england coast. Master of Science in Biological and Environmental Sciences (MSBES) thesis. , University of Rhode Island. (2013).
- Coplen, T. B., Hopple, J., Peiser, H., Rieder, S. Compilation of minimum and maximum isotope ratios of selected elements in naturally occurring terrestrial materials and reagents. U.S. Geological Survey Water-Resources Investigations Report 01-4222. , (2002).
- Karasov, W. H., Pinshow, B. Changes in lean mass and in organs of nutrient assimilation in a long-distance passerine migrant at a springtime stopover site. Physiological Zoology. 71 (4), 435-448 (1998).
- Hood, W. R., Oftedal, O. T., Kunz, T. H. Variation in body composition of female big brown bats (Eptesicus fuscus.) during lactation. Journal of Comparative Physiology B. 176 (8), 807-819 (2006).
- Backus, R. C., Havel, P. J., Gingerich, R. L., Rogers, Q. R. Relationship between serum leptin immunoreactivity and body fat mass as estimated by use of a novel gas-phase Fourier transform infrared spectroscopy deuterium dilution method in cats. American Journal of Veterinary Research. 61 (7), 796-801 (2000).
- Moore, F. D. Determination of Total Body Water and Solids with Isotopes. Science. 104 (2694), 157-160 (1946).
- Voigt, C., Cruz-Neto, A. Ecological and Behavioral Methods in the Study of Bats. Parsons, S., Kunz, T. H. , John Hopkins University Press. Ch. 30 621-645 (2009).
- International Atomic Energy Agency. Assessment of Body Composition and Total Energy Expenditure in Humans Using Stable Isotope Techniques. , (2009).
- International Atomic Energy Agency. Introduction to Body Composition Assessment Using the Deuterium Dilution Technique with Analysis of Saliva Samples by Fourier Transform Infrared Spectrometry. , (2011).
- Shimamoto, H., Komiya, S. The Turnover of Body Water as an Indicator of Health. Journal of Physiological Anthropology and Applied Human Science. 19 (5), 207-212 (2000).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
