使用重水作为评估哺乳动物体成分和饮水量的非侵入性、非致死性工具

摘要

本文介绍了在两种哺乳动物（一种食虫动物和一种食肉动物）中使用重水稀释技术测定总体水、瘦体重、体脂量以及水消耗量的方法。

摘要

体况评分系统和体况指数是评估物种健康状况或适应度的常用技术。体况评分系统依赖于评估者的主观判断，可能具有高度主观性。体况指数可能受到觅食行为、体重影响以及统计学和推断问题的干扰。一种替代体况评分系统和体况指数的方法是使用稳定同位素（如重水）来测定身体组成。重水稀释法是一种可重复、定量的技术，可用于估算人类、野生动物和家养动物的身体组成。此外，重水稀释技术还可用于测定单个动物的饮水量。本文中，我们描述了将重水稀释技术应用于大棕蝠（Eptesicus fuscus）身体组成的评估，以及用于家猫（Felis catus）饮水量测定的方法改良。

引言

体况评分系统和体况指数是用于评估物种健康状况或适应性的常用技术^1,2。许多家养动物和动物园物种均有独特的体况评分（BCS）系统，用于评估动物的肌肉和皮下脂肪组织³。然而，BCS评估依赖于评估者的判断——这意味着当由经过培训的评估者进行评定时，BCS仍属于主观或半定量测量。在野生动物研究中，通常使用体况指数而非BCS，该指数基于体重与体长之比或体重与前臂长度之比²。体况指数常受到摄食活动的影响，同时也可能受到个体体型大小以及统计学和推断方法问题的干扰⁴。

一种替代体况评分系统和体况指数的方法是使用稳定同位素来测定身体组成。一种常用的稳定同位素是重水（D₂O），它是水的一种非放射性形式，其中氢原子为氘同位素。本研究中描述的重水稀释法是一种客观、定量且可重复的技术，可用于估算人类⁵以及多种物种^4,6,7的身体组成。该技术在野生动物身体组成研究中具有优势。例如，可用于评估管....

方案

本文所述所有实验均经密苏里大学动物护理与使用委员会批准，并在密苏里州自然资源保护部（MDC）野生动物科学研究采集许可证（许可证号 #16409 和 #17649）下进行。

1. 无菌等渗氯化钠D₂O储备液的制备

1. 配制50 mL浓度为9.0 g/L的盐化D₂O储备液。
   1. 称取450 mg药用级NaCl，并将全部NaCl转移至一个100 mL的无菌烧杯中。在实验记录本中精确记录NaCl的质量，保留四位小数。
   2. 使用无菌量筒量取50 g、纯度≥99.8%的重水（氧化氘），并转移至含有NaCl的无菌烧杯中。在实验记录本或电子表格中精确记录重水的质量，保留四位小数。
   3. 将10 mL等渗浓度的NaCl溶液（9.0 g/L）通过带有亚微米孔径（0.2 µm）的无热原无菌滤膜进行过滤。
   4. 将带有10 mL注射器筒的无热原无菌滤膜（孔径0.2 µm）连接20 G针头，并插入100 mL无菌空瓶的隔膜中。
   5. 将真空管连接至22 G针头，并将针头插入100 mL无菌空瓶的隔膜中。
   6. 将10 mL储备液倒入注射器筒中。缓慢开启真空，使D₂O储备液开始缓慢过滤进入无菌瓶中。持续将D₂O储备液倒入注射器筒，直至全部50 mL溶液完成过滤。
      注：储备液可能需要根据....

结果

氧化氘稀释法可用于评估多种物种的身体成分。为展示该方法的适用性，我们报告了首次在北美食虫性蝙蝠物种大棕蝠（Eptesicus fuscus）中应用氧化氘稀释法所获得的代表性结果。通过在注射D₂O前后采集血液样本，确定了达到平衡所需的时间平台期，此步骤在任何平衡时间未知的物种中均应执行。结果表明，在非蛰伏状态的蝙蝠中，注射后两小时即可达到充分平衡。在已知平衡时间的基础上，测定了13只野生捕获和8只圈养大棕蝠的总体水含量、瘦体重及体脂质量（表2）。另有2只野生捕获和5只圈养大棕蝠被测定为体脂质量为负值。体脂质量为负值可能由以下一个或多个原因导致：未完全接受氧化氘剂量、在平衡期间进入蛰伏状态、具有异常大的脂肪质量而瘦体重极小，或蝙蝠体脂含量低于DXA测定的3%−5%（表3）。

白鼻综合征已导致多种蝙蝠种群数量下降，因此该技术被与使用DXA测量的体脂含量.......

讨论

自20世纪40年代以来，重水已被用于测定总身体水量（TBW）¹⁷ 并用于人类以及多种家养和野生动物物种^4,6,7其他非破坏性技术已被开发出来，包括生物电阻抗分析（BIA）、双能X线吸收测定法（DXA）和定量磁共振（QMR）。在选择用于评估体成分的特定方法之前，应充分考虑每种方法的优缺点。本方案选择DXA作为氘代氧化物法评估体成分的比较方法，原因是该设备为大学核心资源，使用成本低，每次扫描所需时间短（每只蝙蝠30秒），且不受体温和皮肤绝缘性等变量的影响。

在将重水稀释法应用于特定物种时，应首先开展预实验，以确定达到平衡所需的时间¹⁸。可通过采集基线样本，并在注射后每隔15分钟采集一次血液样本来实现。对于蝙蝠等小型物种，可在不同时间点分别采集多只个体的血液样本，而非仅使用单一个体

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 微米无热原圆盘滤膜	Argos Technologies	FN32S	尼龙材质，直径 30 mm，0.22 µm，无菌
1.5 mL 锥形微量离心管	USA Scientific	1415-9701	1.5 mL 自立式微量离心管，本色带蓝色盖
10 mL 无菌玻璃注射用小瓶	Mountainside 医疗设备公司	MS-SEV10	透明、无菌玻璃注射单元
10 mL 注射器	Becton Dickinson	305219	无菌 10 mL 注射器，单个独立包装
100 mL 无菌玻璃注射用小瓶	Mountainside 医疗设备公司	AL-SV10020	透明、无菌玻璃注射单元
20 号针头	Exel	26417	一次性皮下注射针头 20g × 1" 塑料接口（黄色）/普通斜面
22 号针头	Exel	26411	一次性皮下注射针头 22g × 1" 塑料接口（黑色）/普通斜面
重水	Sigma-Aldrich	151882-25G	氘原子含量 99.9%
异氟烷	Vetone	3060	Fluriso 异氟烷，符合美国药典标准
OMNIC 光谱软件	ThermoFisher Scientific	833-036200	傅里叶变换红外光谱标准软件
凡士林	Vaseline	305212311006	Vaseline，100% 纯凡士林，原味，皮肤保护剂
塑料毛细管	Innovative Med Tech	100050	含肝素钠抗凝剂，容量 50 μL，长度 30 mm
密封液体傅里叶变换红外光谱仪 SL-3 FTIR CAF2 池	International Crystal Laboratory	0005D-875	光程 0.05 mm
氯化钠	EMD Millipore	1.37017	适用于生物制药生产
Thermo Electron Nicolet 380 傅里叶变换红外光谱仪	ThermoFisher Scientific	269-169400	已停产型号，有更新型号可供选择