使用重水作为评估哺乳动物体成分和饮水量的非侵入性、非致死性工具

摘要

本文介绍了在两种哺乳动物（一种食虫动物和一种食肉动物）中使用重水稀释技术测定总体水、瘦体重、体脂量以及水消耗量的方法。

摘要

体况评分系统和体况指数是评估物种健康状况或适应度的常用技术。体况评分系统依赖于评估者的主观判断，可能具有高度主观性。体况指数可能受到觅食行为、体重影响以及统计学和推断问题的干扰。一种替代体况评分系统和体况指数的方法是使用稳定同位素（如重水）来测定身体组成。重水稀释法是一种可重复、定量的技术，可用于估算人类、野生动物和家养动物的身体组成。此外，重水稀释技术还可用于测定单个动物的饮水量。本文中，我们描述了将重水稀释技术应用于大棕蝠（Eptesicus fuscus）身体组成的评估，以及用于家猫（Felis catus）饮水量测定的方法改良。

引言

体况评分系统和体况指数是用于评估物种健康状况或适应性的常用技术^1,2。许多家养动物和动物园物种均有独特的体况评分（BCS）系统，用于评估动物的肌肉和皮下脂肪组织³。然而，BCS评估依赖于评估者的判断——这意味着当由经过培训的评估者进行评定时，BCS仍属于主观或半定量测量。在野生动物研究中，通常使用体况指数而非BCS，该指数基于体重与体长之比或体重与前臂长度之比²。体况指数常受到摄食活动的影响，同时也可能受到个体体型大小以及统计学和推断方法问题的干扰⁴。

一种替代体况评分系统和体况指数的方法是使用稳定同位素来测定身体组成。一种常用的稳定同位素是重水（D₂O），它是水的一种非放射性形式，其中氢原子为氘同位素。本研究中描述的重水稀释法是一种客观、定量且可重复的技术，可用于估算人类⁵以及多种物种^4,6,7的身体组成。该技术在野生动物身体组成研究中具有优势。例如，可用于评估管理措施实施前后身体组成的纵向变化。然而，在某些野生动物物种中，重水可能会高估实际的水分含量⁸。因此，在将该技术应用于某一物种时，应通过将重水法与非濒危物种的尸体分析进行比较，以验证该方法的准确性。对于受威胁或濒危物种，应考虑采用双能X射线吸收测定法（DXA）等非破坏性方法，作为与完整的尸体分析这一金标准破坏性方法相对比的替代方案。

除了体成分分析外，重水（D₂O）稀释法还可用于测定单个动物的饮水量⁹。这种重水（D₂O）的独特应用不仅可用于回答科研问题，还可用于评估在大型群居环境中饲养的单个或多个动物的饮水情况。

本文介绍了重水（D₂O）稀释法的改进应用，用于评估食虫动物——大棕蝠（Eptesicus fuscus）的身体成分，以及用于评估食肉动物——家猫（Felis catus）的饮水量。

方案

本文所述所有实验均经密苏里大学动物护理与使用委员会批准，并在密苏里州自然资源保护部（MDC）野生动物科学研究采集许可证（许可证号 #16409 和 #17649）下进行。

1. 无菌等渗氯化钠D₂O储备液的制备

1. 配制50 mL浓度为9.0 g/L的盐化D₂O储备液。
   1. 称取450 mg药用级NaCl，并将全部NaCl转移至一个100 mL的无菌烧杯中。在实验记录本中精确记录NaCl的质量，保留四位小数。
   2. 使用无菌量筒量取50 g、纯度≥99.8%的重水（氧化氘），并转移至含有NaCl的无菌烧杯中。在实验记录本或电子表格中精确记录重水的质量，保留四位小数。
   3. 将10 mL等渗浓度的NaCl溶液（9.0 g/L）通过带有亚微米孔径（0.2 µm）的无热原无菌滤膜进行过滤。
   4. 将带有10 mL注射器筒的无热原无菌滤膜（孔径0.2 µm）连接20 G针头，并插入100 mL无菌空瓶的隔膜中。
   5. 将真空管连接至22 G针头，并将针头插入100 mL无菌空瓶的隔膜中。
   6. 将10 mL储备液倒入注射器筒中。缓慢开启真空，使D₂O储备液开始缓慢过滤进入无菌瓶中。持续将D₂O储备液倒入注射器筒，直至全部50 mL溶液完成过滤。
      注：储备液可能需要根据所需剂量进行稀释或浓缩。D₂O的剂量因物种及分析方法的灵敏度而异。对于猫，工作液用于给予0.7 g/kg的D₂O剂量。上述储备液可最大限度减少皮下注射给动物时引入的NaCl溶液体积，同时仍能准确测量剂量。对于蝙蝠等小型哺乳动物，必须将该浓度稀释为如0.1600 g/mL的工作液。此浓度可确保在约100 µL或更少的NaCl溶液中准确测量并给予0.75 g/kg的D₂O剂量。

2. 蝙蝠用无菌等渗盐化D₂O储备工作溶液的制备

1. 称量一个10 mL的空无菌小瓶，记录至小数点后四位。将天平归零。
2. 使用1.0 mL注射器将0.65 mL D₂O储备液转移至已去皮重的10 mL空无菌小瓶中。记录D₂O的质量至小数点后四位。将天平归零。
3. 计算10 mL空小瓶中D₂O的体积。使用以下公式：
   
   其中 W 为记录的质量，D 为99.8% D₂O的密度（1.107 g/mL）。
4. 利用计算出的D₂O体积及其已知质量，确定配制约0.1600 g/mL工作溶液所需的等渗盐水体积。
5. 将连接真空管的22 G针头插入10 mL无菌小瓶的隔垫中；再将连接有装有10 mL注射器筒的0.22 µm注射式滤器的20 G针头插入同一小瓶的隔垫中。
6. 将计算所得质量/体积的等渗NaCl溶液倒入注射器筒中，开启真空，使液体缓慢滴入无菌10 mL小瓶中。
7. 记录小瓶的总质量，确保已配制成约0.1600 g/mL的工作溶液。

3. 使用D₂O测定大棕蝠（Eptesicus fucsus）的身体成分

注意：本方案中使用的 D₂O 储备液浓度为 0.1598 g/mL。采血前，需确保采集的血量不超过 200 µL，且不超过蝙蝠总血容量的 10%，符合机构动物护理和使用委员会（IACUC）规定的采血指南。所有动物均应禁食或通过腹部触诊确认胃部排空。近期进食可能改变动物体重，进而干扰实验结果，因为测定体脂率的计算依赖于动物的体重数据。

1. 麻醉一只大棕蝠。
   1. 使用5.0%异氟烷进行诱导，以0.5%−3.0%异氟烷维持稳定的麻醉深度。
   2. 通过测试足部回缩反射（捏压蝙蝠脚趾）判断麻醉深度是否合适。蝙蝠不应对此刺激产生反应，且呼吸频率应保持缓慢而稳定。根据需要调整异氟烷浓度，以维持稳定的麻醉状态。
   3. 按照IACUC要求，记录异氟烷浓度、心率、呼吸频率及其他相关信息。
2. 称量大棕蝠体重，并记录至小数点后四位。
3. 使用酒精棉片清洁股间膜（尾膜）上覆盖股间静脉的区域，待其自然干燥后，在股间静脉表面涂抹一层薄薄的凡士林。
4. 使用29 G针头穿刺股间静脉的背侧部分，用塑料肝素钠毛细管采集100 µL血液。采集后轻轻滚动每根毛细管，确保全血与肝素钠充分混合，并对毛细管进行标记。
5. 使用已针对小型哺乳动物校准的双能X线吸收测定仪（DXA），对蝙蝠进行三次DXA扫描¹⁰。
6. 通过将蝙蝠体重（kg）乘以D₂O剂量0.75 g/kg，计算所需注射的D₂O质量（g）。将计算所得的D₂O质量除以工作液浓度，得到所需D₂O的体积（V）。
   
   
7. 使用带29 G针头的胰岛素注射器抽取计算所得体积的D₂O。称量D₂O、胰岛素注射器及针头的总重量，记录至小数点后四位。
8. 将D₂O注射至麻醉状态下蝙蝠背部臀部区域的皮下组织。
9. 让蝙蝠从麻醉中恢复，并记录注射时间。
10. 注射后立即称量已空的带29 G针头的胰岛素注射器，记录重量至小数点后四位。
11. 通过从注射前含D₂O的胰岛素注射器重量中减去注射后的重量，计算实际注射的D₂O剂量，并记录至小数点后四位。
12. 在采血后30分钟内，使用血细胞比容离心机将每根毛细管离心5分钟。若血细胞比容离心机支持多种转速，应设置为10,000 x g。
13. 使用锋利的剪刀在全血与血浆交界处剪断塑料毛细管，使用200 µL移液器将血浆直接吹入已标记的500 µL储存管中。
14. 经过平衡期后，再次从股间静脉采集100 µL血液。
    注意：平衡期因物种及蝙蝠是否进入蛰伏状态而异。对于大棕蝠，通常2小时的平衡期已足够。
15. 通过重复步骤3.13，将血浆分离至第二个已标记的500 µL带螺口盖的微量离心管中。样品应储存于-20 °C或更低温度，直至分析。

4. 傅里叶变换红外光谱分析

1. 将沙浴锅温度设定为 60 °C，以促进蒸馏（使水和 D₂O 与其他血液成分分离）。
2. 用移液器将每份血浆样品和标准品各 50 µL 加入 1.5 mL 锥形微量离心管盖内侧。包括已知 D₂O 浓度的标准品作为质量控制。
   注：理想情况下，每只动物每个样品应设置三个重复，并报告三个重复的平均值。由于样品体积有限，以及作者所使用的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）设备所需的样品体积较大，蝙蝠样品未进行重复测定。若任何样品血浆体积少于 50 µL，则将实际样品体积加入锥形微量离心管盖内，并记录该体积。
3. 将微量离心管盖倒置，将 1.5 mL 锥形微量离心管旋紧在盖子上。将倒置（ upside-down）的管子放入沙浴锅中，使管盖接触沙子，至少放置 12 小时（过夜）。
4. 12 小时后，取下管盖并更换为新的洁净管盖。在离心机中短暂离心 10 秒。
5. 配制以下标准品：0 ppm（1 L 蒸馏水中含 0 mg D₂O）、293 ppm（1 L 蒸馏水中含 293 mg D₂O）、585 ppm（1 L 蒸馏水中含 585 mg D₂O）、878 ppm（1 L 蒸馏水中含 878 mg D₂O）和 1170 ppm D₂O（1 L 蒸馏水中含 1170 mg D₂O）。
   注：上述数值建议用于标准曲线。也可使用其他数值，如 250 ppm、500 ppm、750 ppm 等。
6. 将液体透射池安装至傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）中（材料表）。用甲醇填充透射池，并连接进样口。在小心移除甲醇注射器的同时缓慢注入背景水，以降低产生气泡的风险。在出口端连接管路，以便分析后排出样品。
7. 准备傅里叶变换红外光谱仪软件（材料表）以分析水中 D₂O。本方案所用光谱仪软件的参数设置见表 1。
8. 使用稀释液（0.22 µm 滤膜过滤的蒸馏水）采集背景光谱。该水应与配制标准品所用水相同。
9. 注入 40 µL 的 0 ppm D₂O 标准品并记录光谱。将光谱数据保存为逗号分隔值（CSV）文件。
10. 继续注入并保存所有标准品的光谱，以建立标准曲线。
11. 每 60−90 分钟重复一次背景和标准曲线测定。
12. 将每份蒸馏后的样品各 40 µL 注入液体透射池，并保存光谱。
    注：根据液体透射池的进样体积调整标准品和蒸馏样品的进样量。若样品体积低于 40 µL，可选用更小体积的液体透射池，或将样品与背景蒸馏水按 1:1 稀释。
13. 使用电子表格程序（如 Jennings 等人¹¹所述）或光谱分析软件，根据 FTIR 光谱确定各样品中 D₂O 的浓度。若进行了重复测定，则采用平均浓度计算身体成分。

5. 身体成分的计算

1. 使用以下公式将每个样品的氘富集度（ppm）转换为原子百分比浓度¹²：
   
   其中 x 为样品测得的氘富集度（ppm），0.0001557 为维也纳标准平均海水（VSMOW）中氘的摩尔分数¹³。
2. 使用以下公式计算每个样品的总体水含量^4,12,14：
   )
   其中 E 为背景校正后样品中氘的测量富集度（原子%），B 为注射质量（g），0.998 为注入 D₂O 的浓度。
   注：氘与不稳定氢发生交换会导致总体水质量被高估约 2%。应通过将总体水质量估计值减少体重的 2% 来进行校正。
3. 使用以下公式估算每只蝙蝠的无脂质量（瘦体重及其他所有非脂肪成分）：
   
   注：对于健康、正常水合状态且非哺乳期的蝙蝠，采用公认的瘦体重水分分数值 0.732。哺乳期大棕蝠的无脂质量水分分数会随产后周数而变化¹⁵。对于其他物种，请使用文献中已发表的数值，或在计算瘦体重之前确定其瘦体重的水分分数。
4. 使用以下公式估算体脂质量：
   
5. 使用以下公式将体脂质量（g）换算为体脂百分比：
   

6. 食肉动物（Felis catus，家猫）体内水成分的测定

1. 按照第1节所述方法制备储备溶液。
2. 将每只猫的体重称量至小数点后三位，并记录体重。根据步骤3.6所述方法计算每只猫的给药剂量，使用D₂O剂量为0.70 g/kg。
3. 按照步骤3.7–3.8所述方法配制每份剂量，使用3 mL或5 mL注射器配22 G针头，而非胰岛素注射器。
4. 采集500 µL全血，随后皮下注射0.7 g/kg的D₂O。将全血在2,000 × g条件下离心15分钟，将血浆储存于1.5 mL带螺口盖的微量离心管中，于-20°C保存直至分析。
5. 在注射后4小时采集500 µL全血。将全血在2,000 × g条件下离心15分钟，将血浆储存于1.5 mL带螺口盖的微量离心管中，于-20 °C保存直至分析。
6. 在注射后14天采集500 µL全血。将全血在2,000 × g条件下离心15分钟，将血浆储存于1.5 mL带螺口盖的微量离心管中，于-20 °C保存直至分析。
   注：采血间隔天数可根据实验需求以及D₂O浓度高于背景水平的检测时间窗口确定。14天为Hooper等⁹研究中饮食处理阶段的持续时间。
7. 按照本方案第4节进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析，并根据第5节计算身体成分。
8. 使用以下公式计算每日水消耗量（mL/天）：
   
   
   
   其中TBW为总体水含量，初始D₂O和最终D₂O为注射后D₂O样本中测得的ppm浓度。

结果

氧化氘稀释法可用于评估多种物种的身体成分。为展示该方法的适用性，我们报告了首次在北美食虫性蝙蝠物种大棕蝠（Eptesicus fuscus）中应用氧化氘稀释法所获得的代表性结果。通过在注射D₂O前后采集血液样本，确定了达到平衡所需的时间平台期，此步骤在任何平衡时间未知的物种中均应执行。结果表明，在非蛰伏状态的蝙蝠中，注射后两小时即可达到充分平衡。在已知平衡时间的基础上，测定了13只野生捕获和8只圈养大棕蝠的总体水含量、瘦体重及体脂质量（表2）。另有2只野生捕获和5只圈养大棕蝠被测定为体脂质量为负值。体脂质量为负值可能由以下一个或多个原因导致：未完全接受氧化氘剂量、在平衡期间进入蛰伏状态、具有异常大的脂肪质量而瘦体重极小，或蝙蝠体脂含量低于DXA测定的3%−5%（表3）。

白鼻综合征已导致多种蝙蝠种群数量下降，因此该技术被与使用DXA测量的体脂含量...

讨论

自20世纪40年代以来，重水已被用于测定总身体水量（TBW）¹⁷ 并用于人类以及多种家养和野生动物物种^4,6,7其他非破坏性技术已被开发出来，包括生物电阻抗分析（BIA）、双能X线吸收测定法（DXA）和定量磁共振（QMR）。在选择用于评估体成分的特定方法之前，应充分考虑每种方法的优缺点。本方案选择DXA作为氘代氧化物法评估体成分的比较方法，原因是该设备为大学核心资源，使用成本低，每次扫描所需时间短（每只蝙蝠30秒），且不受体温和皮肤绝缘性等变量的影响。

在将重水稀释法应用于特定物种时，应首先开展预实验，以确定达到平衡所需的时间¹⁸。可通过采集基线样本，并在注射后每隔15分钟采集一次血液样本来实现。对于蝙蝠等小型物种，可在不同时间点分别采集多只个体的血液样本，而非仅使用单一个体

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 微米无热原圆盘滤膜	Argos Technologies	FN32S	尼龙材质，直径 30 mm，0.22 µm，无菌
1.5 mL 锥形微量离心管	USA Scientific	1415-9701	1.5 mL 自立式微量离心管，本色带蓝色盖
10 mL 无菌玻璃注射用小瓶	Mountainside 医疗设备公司	MS-SEV10	透明、无菌玻璃注射单元
10 mL 注射器	Becton Dickinson	305219	无菌 10 mL 注射器，单个独立包装
100 mL 无菌玻璃注射用小瓶	Mountainside 医疗设备公司	AL-SV10020	透明、无菌玻璃注射单元
20 号针头	Exel	26417	一次性皮下注射针头 20g × 1" 塑料接口（黄色）/普通斜面
22 号针头	Exel	26411	一次性皮下注射针头 22g × 1" 塑料接口（黑色）/普通斜面
重水	Sigma-Aldrich	151882-25G	氘原子含量 99.9%
异氟烷	Vetone	3060	Fluriso 异氟烷，符合美国药典标准
OMNIC 光谱软件	ThermoFisher Scientific	833-036200	傅里叶变换红外光谱标准软件
凡士林	Vaseline	305212311006	Vaseline，100% 纯凡士林，原味，皮肤保护剂
塑料毛细管	Innovative Med Tech	100050	含肝素钠抗凝剂，容量 50 μL，长度 30 mm
密封液体傅里叶变换红外光谱仪 SL-3 FTIR CAF2 池	International Crystal Laboratory	0005D-875	光程 0.05 mm
氯化钠	EMD Millipore	1.37017	适用于生物制药生产
Thermo Electron Nicolet 380 傅里叶变换红外光谱仪	ThermoFisher Scientific	269-169400	已停产型号，有更新型号可供选择