生理上，气味受体由气相吸入的气味分子激活。然而，大多数体外系统采用液相气味刺激。本文介绍一种方法，可在气相气味刺激条件下实现对气味受体激活的实时体外监测。
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本文内容
摘要
摘要
嗅觉感知始于气味分子与嗅觉感觉神经元（OSN）所表达的气味受体（OR）之间的相互作用。气味识别遵循一种组合编码机制，即一种OR可被一组气味分子激活，而一种气味分子也可激活多种OR的组合。通过这种组合编码方式，生物体能够检测并区分大量挥发性气味分子。因此，特定浓度下的气味可用一组特定的OR激活模式来描述，该模式对每种气味具有特异性。从这一角度而言，破解大脑感知气味的机制，关键在于理解气味分子与OR之间的相互作用。这正是嗅觉研究领域致力于将这些受体“去孤儿化”的原因。"目前用于鉴定气味分子-OR相互作用的传统体外系统，通常采用将气味分子直接加入细胞培养基中的方式，这与体内自然嗅觉过程中气味分子以气相形式溶解于鼻黏膜后才与OR结合的方式存在差异。本文介绍一种新方法，可实现对气相气味分子激活OR过程的实时监测。该方法基于Glosensor检测技术，通过检测cAMP释放引起的发光信号进行测定。该技术弥合了现有体内与体外研究方法之间的差距，为构建仿生型挥发性化学传感器提供了基础。
引言
嗅觉使陆生动物能够与其挥发性化学环境相互作用，从而驱动行为和情绪反应。从根本上说，气味检测过程始于气味分子与嗅觉系统在气味受体（ORs）水平上的最初相互作用1。在哺乳动物中，ORs 在位于嗅上皮的嗅觉感觉神经元（OSNs）中单独表达2。它们属于G蛋白偶联受体（GPCR）家族，更确切地说是视紫红质样亚家族（也称为A类）。ORs 与刺激性G蛋白 Golf 偶联，其激活可导致cAMP生成，随后打开环核苷酸门控通道并产生动作电位。目前公认，气味感知依赖于特定模式的激活ORs3,4，因此气味识别遵循一种组合编码机制，即一个OR可被一组气味分子激活，而一种气味分子也可激活一组特定的ORs。通过这种组合编码机制，推测生物体能够检测并区分大量不同的挥发性气味分子。理解气味如何被感知的关键之一，就在于阐明特定气味分子如何以及激活哪些ORs。
为了阐明气味分子与嗅觉受体（OR）之间的相互作用，体外功能检测方法发挥了至关重要的作用。通过多种体外、离体和体内功能检测技术，针对孤儿嗅觉受体（orphan ORs）的激动性气味配体的鉴定（即嗅觉受体去孤儿化）在过去二十年中成为一个非常活跃的研究领域5,<....
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方案
1. Hana3A 细胞培养
- 配制 M10（最低必需培养基（MEM）加 10% v/v 胎牛血清（FBS））和 M10PSF（M10 加 100 µg/mL 青霉素-链霉素和 1.25 µg/mL 两性霉素 B）。
- 在 37 °C、5% 二氧化碳（CO2）的培养箱中，将细胞培养于 100 mm 细胞培养皿中的 10 mL M10PSF 培养基中。
- 每 2 天以 20% 的比例传代一次：在相差显微镜下观察到细胞达到 100% 汇合度（约 1.1 × 107 个细胞）时，吸除培养基，并用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞。
- 吸除 PBS，加入 3 mL 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA，0.48 mM），作用约 1 分钟，直至细胞从培养皿表面解离。
- 加入 5 mL M10 以中和胰蛋白酶活性，并通过反复吹打使仍附着在培养皿上的细胞完全脱落。
- 将全部液体（8 mL）转移至 15 mL 离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，用 5 mL M10PSF 通过吹打重悬细胞，以分散任何细胞团块。操作过程中避免产生气泡。
- 取 1 mL 重悬的细胞悬液转移至新的 100 mm 细胞培养皿中，加入 9 mL 新鲜 M10PSF 培养基，于 37 °C、5% CO2 条件下继续....
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结果
我们利用肉桂醛蒸气刺激筛选了三种小鼠嗅觉受体（OR）Olfr746、Olfr124和Olfr1093的反应（图3）。同时，我们使用空载体对照（Rho-pCI）以确保被测ORs的气味分子诱导活性具有特异性（图3A）。在20个测量循环中，实时监测了ORs对蒸气气味刺激的激活情况。每个孔的数据首先归一化为每个循环中空载体对照的平均值（图3B）。需要注意的是，ORs在此类检测中可能表现出不同水平的基础活性，且该活性依赖于具体的OR，因此将它们的反应也对此参数进行归一化可能十分重要（图3C）。可通过将每个OR的平均值除以其在t = 0 s时的响应值，实现不同OR之间的比较。此外，还可通过计算每种OR在所有测量循环值之和的曲线下面积（AUC），获得各OR的单一激活值（图3.......
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讨论
气味感知从根本上依赖于嗅觉受体（ORs）的激活。因此，要解析大脑感知其挥发性化学环境的复杂机制，就必须深入了解这些受体的功能特性。然而，由于难以建立一种可靠的方法在体外对嗅觉受体库与气味分子之间的功能响应进行筛选，这一过程的研究进展一直受到阻碍。. 通过构建带标签的受体，部分解决了嗅觉受体在细胞表面表达及异源表达的问题13,19 以及通过发现和优化嗅觉神经元（OSNs）中表达的受体转运蛋白（RTPs）22,23首次筛选研究随后出现，为我们理解嗅觉受体功能带来了新的见解，例如其气味分子识别模式6,7,26,33，激活机制
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披露
Y.F.、H.K 和 H.M. 于2016年10月27日就本研究提交了专利申请。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号DC014423和DC016224）以及美国国防高级研究计划局RealNose项目的支持。 YF在杜克大学期间获得了日本学术振兴会（JSPS）“推进战略性国际网络加速优秀研究人员流动计划”（R2801）的经费支持。我们感谢Sahar Kaleem对稿件的编辑工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05 % 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% 胰蛋白酶 - EDTA (1×)，酚红 - 4 ℃保存°C |
| 100 mm 细胞培养皿 | BD Falcon | 353003 | 100 mm × 20 mm 细胞培养皿 |
| 15 mL 离心管 | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm 圆锥形管 |
| 96孔板 | 康宁 | 3843 | 96孔板，LE型白色盖，透明底部，聚-D-赖氨酸包被的聚苯乙烯 |
| 两性霉素 | Gibco | 15290-018 | 两性霉素 B 250 µg/mL - 4℃保存 °C |
| 离心机 | Jouan | C312 | 带有15 mL摆动桶转子的离心机 |
| II类A/B3型生物安全柜 | NUAIRE | NU-407-500 | 细胞培养用通风橱 |
| FBS | Gibco | 16000-044 | 胎牛血清 - 储存于 -20 °C |
| GloSensor cAMP 试剂 | Promega | E1290 | GloSensor cAMP 试剂 发光蛋白底物 - 储存于 -20 °C |
| 37℃培养箱 °C；5% CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | 细胞培养用孵育箱 |
| Lipofectamine 2000 试剂 | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 试剂 1 mg/ml 转染试剂 - 4℃保存 °C |
| Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | 已停止 | 用于发光检测的96孔板读板仪 |
| 矿物油 | Sigma | M8410 | 气味剂溶剂——室温保存 |
| 最低必需培养基（MEM） | Corning Cellgro | 10-010-CV | Earle's平衡盐溶液的最低必需培养基’盐 & L-谷氨酰胺 - 4℃保存 °C |
| 青霉素/链霉素 | Sigma Aldrich | P4333 | 青霉素-链霉素溶液，含10,000 U青霉素和10 mg链霉素稳定保存——于-20℃保存 °C |
| pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP 发光蛋白质粒 - 4℃保存 °C |
| 相差显微镜 | Leica | 090-131.001 | 配备 x4、x10、x20 物镜的相差显微镜 |
| RTP1S | H. Matsunami 实验室 | - | 100 ng/µL 质粒 - 4℃保存 °C |
参考文献
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Gene....
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重印与许可
