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方法文章

气相气味分子实时体外监测气味受体激活

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DOI：

10.3791/59446

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2019年4月23日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

本文内容

摘要

生理上，气味受体由气相吸入的气味分子激活。然而，大多数体外系统采用液相气味刺激。本文介绍一种方法，可在气相气味刺激条件下实现对气味受体激活的实时体外监测。

摘要

嗅觉感知始于气味分子与嗅觉感觉神经元（OSN）所表达的气味受体（OR）之间的相互作用。气味识别遵循一种组合编码机制，即一种OR可被一组气味分子激活，而一种气味分子也可激活多种OR的组合。通过这种组合编码方式，生物体能够检测并区分大量挥发性气味分子。因此，特定浓度下的气味可用一组特定的OR激活模式来描述，该模式对每种气味具有特异性。从这一角度而言，破解大脑感知气味的机制，关键在于理解气味分子与OR之间的相互作用。这正是嗅觉研究领域致力于将这些受体“去孤儿化”的原因。"目前用于鉴定气味分子-OR相互作用的传统体外系统，通常采用将气味分子直接加入细胞培养基中的方式，这与体内自然嗅觉过程中气味分子以气相形式溶解于鼻黏膜后才与OR结合的方式存在差异。本文介绍一种新方法，可实现对气相气味分子激活OR过程的实时监测。该方法基于Glosensor检测技术，通过检测cAMP释放引起的发光信号进行测定。该技术弥合了现有体内与体外研究方法之间的差距，为构建仿生型挥发性化学传感器提供了基础。

引言

嗅觉使陆生动物能够与其挥发性化学环境相互作用，从而驱动行为和情绪反应。从根本上说，气味检测过程始于气味分子与嗅觉系统在气味受体（ORs）水平上的最初相互作用1。在哺乳动物中，ORs 在位于嗅上皮的嗅觉感觉神经元（OSNs）中单独表达2。它们属于G蛋白偶联受体（GPCR）家族，更确切地说是视紫红质样亚家族（也称为A类）。ORs 与刺激性G蛋白 Golf 偶联，其激活可导致cAMP生成，随后打开环核苷酸门控通道并产生动作电位。目前公认，气味感知依赖于特定模式的激活ORs3,4，因此气味识别遵循一种组合编码机制，即一个OR可被一组气味分子激活，而一种气味分子也可激活一组特定的ORs。通过这种组合编码机制，推测生物体能够检测并区分大量不同的挥发性气味分子。理解气味如何被感知的关键之一，就在于阐明特定气味分子如何以及激活哪些ORs。

为了阐明气味分子与嗅觉受体（OR）之间的相互作用，体外功能检测方法发挥了至关重要的作用。通过多种体外、离体和体内功能检测技术，针对孤儿嗅觉受体（orphan ORs）的激动性气味配体的鉴定（即嗅觉受体去孤儿化）在过去二十年中成为一个非常活跃的研究领域5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17。

体外检测系统最适合对嗅觉受体（ORs）进行详细的功能表征，包括鉴定ORs的功能结构域和关键残基，以及潜在的工程应用。然而，构建有价值的ORs体外系统仍面临挑战，部分原因在于难以培养嗅觉神经元（OSNs）以及在异源细胞中实现ORs的功能性表达。早期的主要挑战是建立能够实现功能性ORs在细胞表面表达的实验方案，以用于绘制气味分子与ORs相互作用图谱。多个独立研究团队已采用不同策略5,6,7,8,9,10,11,12,14,18,19,20。其中最早的一项突破由Krautwurst等人实现，他们在ORs的N端连接了一段简化的视紫红质序列（Rho-tag），并在人胚肾（HEK）细胞中观察到细胞表面表达显著增强13。对连接在OR序列上的标签进行改造，仍是当前提升OR表达水平和功能活性的研究路径之一19,21。随后，Saito等. 鉴定出受体转运蛋白1（RTP1）和RTP2，它们可促进OR的转运过程22。RTP1的一个较短亚型RTP1S也被证明比全长蛋白更有效23。一种稳定表达Golf、REEP1、RTP1和RTP2的细胞系（Hana3A）的建立，结合环磷酸腺苷（cAMP）报告系统，使得气味分子与ORs相互作用的鉴定成为可能24。然而，RTP蛋白家族促进ORs在细胞表面表达的具体机制仍有待阐明。

这些既定方法的一个局限性在于，它们依赖于液相中的气味分子刺激，即气味分子预先溶解在刺激介质中，并通过更换培养基来刺激细胞。这与生理条件有显著差异，在生理条件下，气味分子以气相形式到达嗅上皮，并通过溶解于鼻黏膜中来激活嗅觉受体（ORs）。为了更接近生理相关的刺激暴露条件，Sanz 等人20提出了一种基于气相刺激的检测方法，该方法将一滴气味溶液悬挂在覆盖于细胞孔板上方的塑料膜内侧下方。他们通过监测荧光强度记录钙信号反应。该方法首次采用了气相气味刺激，但无法实现对嗅觉受体激活的大规模筛选。

本文中，我们开发了一种新方法，可通过Glosensor检测法对体外嗅觉受体（OR）的激活进行实时监测，该方法采用气相气味分子刺激（图1）。此前，该检测法已用于液体气味分子刺激的研究18,19,25,26,27,28,29,30,31。在读板前，首先使发光检测仪的监测室与挥发性气味分子达到平衡（图1A）。随后，气味分子溶解于缓冲液中，作用于表达目标OR、RTP1S及Glosensor蛋白的Hana3A细胞（图1B）。若该气味分子为OR的激动剂，则OR将转变为激活构象，并与Golf结合，从而激活腺苷酸环化酶（AC），最终导致细胞内cAMP水平升高。升高的cAMP将结合并激活Glosensor蛋白，催化荧光素产生发光信号。该发光信号由发光检测仪记录，从而实现对OR激活状态的监测。该方法在OR去孤儿化研究中具有重要意义，因其使体外系统更接近于气味的自然感知过程。

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方案

1. Hana3A 细胞培养

  1. 配制 M10（最低必需培养基（MEM）加 10% v/v 胎牛血清（FBS））和 M10PSF（M10 加 100 µg/mL 青霉素-链霉素和 1.25 µg/mL 两性霉素 B）。
  2. 在 37 °C、5% 二氧化碳（CO2）的培养箱中，将细胞培养于 100 mm 细胞培养皿中的 10 mL M10PSF 培养基中。
  3. 每 2 天以 20% 的比例传代一次：在相差显微镜下观察到细胞达到 100% 汇合度（约 1.1 × 107 个细胞）时，吸除培养基，并用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞。
  4. 吸除 PBS，加入 3 mL 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA，0.48 mM），作用约 1 分钟，直至细胞从培养皿表面解离。
  5. 加入 5 mL M10 以中和胰蛋白酶活性，并通过反复吹打使仍附着在培养皿上的细胞完全脱落。
  6. 将全部液体（8 mL）转移至 15 mL 离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，用 5 mL M10PSF 通过吹打重悬细胞，以分散任何细胞团块。操作过程中避免产生气泡。
  7. 取 1 mL 重悬的细胞悬液转移至新的 100 mm 细胞培养皿中，加入 9 mL 新鲜 M10PSF 培养基，于 37 °C、5% CO2 条件下继续培养。

2. 转染前细胞的准备

  1. 在相差显微镜下观察细胞，评估细胞汇合度或细胞数量。每个培养板至少需要10%的汇合度（约1.1 × 106个细胞）。
  2. 吸除培养基，用10 mL PBS轻柔洗涤细胞。吸除PBS后加入3 mL EDTA，在室温下作用约1分钟，直至细胞从培养板上解离。
  3. 加入5 mL M10以中和胰蛋白酶活性，并通过上下吹打使仍附着在培养板上的细胞完全脱落。将全部液体（8 mL）转移至15 mL离心管中，在200 × g 条件下离心5分钟。
  4. 吸除上清液，用移液器上下吹打，将细胞重悬于5 mL M10PSF中，以分散任何细胞团块。操作过程中避免在管内产生气泡。
  5. 根据需转染的培养板数量，将适量细胞转移至储液槽中，并加入相应体积的M10PSF。一个96孔板应接种来自100%汇合度的100 mm培养皿的1/10量细胞（约1.1 × 106个细胞），用M10PSF稀释至总体积为6 mL。若从一个100%汇合度的100 mm培养皿开始制备一个96孔板，则取5 mL重悬细胞中的500 µL，加入5.5 mL新鲜M10PSF中。混匀细胞与M10PSF时避免产生气泡。
  6. 使用多通道移液器将50 µL细胞悬液加入96孔板的每个孔中。于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。

3. 质粒转染

  1. 在相差显微镜下观察96孔板，确保细胞融合度在30%至50%之间。
  2. 根据表1中的体积，配制第一种转染混合液，其中包含整个96孔板共用的质粒（RTP1S、OR和Glosensor蛋白，参见材料表）。注意：若存在多个OR，则Rho标记的OR的用量应除以OR的数量。
    注意：我们强烈建议在实验设计中加入空载体阴性对照（此处为Rho-pCI）以及任何阳性对照（已知对所测试气味分子有响应的OR）。
  3. 配制第二种转染混合液，包含500 µL MEM和20 µL Lipofectamine 2000试剂（适用于一个96孔板，参见材料表）。将第二种混合液加入第一种混合液中，轻轻吹打混匀，室温孵育15分钟。然后加入5 mL M10，轻轻混匀。
  4. 将先前接种细胞的96孔板中的M10PSF更换为50 µL最终转染培养基。置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育，并按照步骤6所述程序，对化学发光仪的检测腔室进行过夜抽真空处理。

4. 底物孵育

  1. 在相差显微镜下观察96孔板，确保细胞融合度在60%至100%之间。配制含有10 mM羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和5 mM D-葡萄糖的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）刺激液。
  2. 将75 µL cAMP试剂（见材料表）溶液用2.75 mL刺激液稀释。移除96孔板中的转染培养基，并向每孔加入50 µL新鲜刺激液以洗涤细胞。
  3. 吸除刺激液，向每孔加入25 µL在步骤4.2中配制的cAMP试剂溶液。将96孔板置于室温、避光且无气味的环境中（例如远离化学品或其他气味源的干净空抽屉）孵育2小时。

5. 气味刺激

  1. 首先，用挥发性气味分子平衡化学发光仪的检测室。将气味物质用10 mL矿物油稀释至所需浓度（图2A）。在cAMP试剂孵育结束前，取25 µL气味溶液加入一个新的96孔板中（非含细胞的孔板）。将该气味溶液孔板于室温下在化学发光仪检测室内孵育5分钟（图2B）（此处无需进行化学发光记录）。
  2. 设置化学发光仪在20个循环的孔板检测过程中记录发光信号，每个循环持续90秒，循环间间隔0.7秒，延迟时间为0秒。
  3. 在开始读取孔板前，立即从检测室中取出气味溶液孔板。将25 µL气味溶液加至含细胞的96孔板各孔之间的空隙中（切勿将气味溶液加入含细胞的孔内），并在30分钟内迅速启动对所有孔的发光检测，持续20个循环（图2C）。

6. 去除 化学发光仪内残留的气味物质

  1. 打开发光检测仪的门，插入连接至真空泵的管子。
  2. 在两种气味物质之间，需对读取室中的气味物质进行充分抽真空处理（至少2小时，建议过夜），以避免不同实验间气味挥发物的交叉污染。在孵育下一种气味物质前，通过通入压缩空气5分钟，以新鲜空气替换腔内气体。

7. 数据分析

  1. 从发光仪软件中导出数据。
  2. 对每个记录时间点的相同嗅觉受体（OR）的重复实验结果取平均值。通过将每个时间点的OR平均值除以对照组的平均值，计算相对于对照组（例如空载体对照，见图3A及代表性结果部分）归一化的OR响应（见图3B及代表性结果部分）。
  3. 将每个OR的响应相对于其基础活性进行归一化处理，方法是将各记录时间点的OR响应值除以0秒时的平均OR响应值（见图3C及代表性结果部分）。
  4. 计算每个OR响应曲线下的面积，以获得单一的OR响应值。具体操作为：对每个OR在各记录时间点的所有发光值求和。

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结果

我们利用肉桂醛蒸气刺激筛选了三种小鼠嗅觉受体（OR）Olfr746、Olfr124和Olfr1093的反应（图3）。同时，我们使用空载体对照（Rho-pCI）以确保被测ORs的气味分子诱导活性具有特异性（图3A）。在20个测量循环中，实时监测了ORs对蒸气气味刺激的激活情况。每个孔的数据首先归一化为每个循环中空载体对照的平均值（图3B）。需要注意的是，ORs在此类检测中可能表现出不同水平的基础活性，且该活性依赖于具体的OR，因此将它们的反应也对此参数进行归一化可能十分重要（图3C）。可通过将每个OR的平均值除以其在t = 0 s时的响应值，实现不同OR之间的比较。此外，还可通过计算每种OR在所有测量循环值之和的曲线下面积（AUC），获得各OR的单一激活值（图3...

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讨论

气味感知从根本上依赖于嗅觉受体（ORs）的激活。因此，要解析大脑感知其挥发性化学环境的复杂机制，就必须深入了解这些受体的功能特性。然而，由于难以建立一种可靠的方法在体外对嗅觉受体库与气味分子之间的功能响应进行筛选，这一过程的研究进展一直受到阻碍。. 通过构建带标签的受体，部分解决了嗅觉受体在细胞表面表达及异源表达的问题13,19 以及通过发现和优化嗅觉神经元（OSNs）中表达的受体转运蛋白（RTPs）22,23首次筛选研究随后出现，为我们理解嗅觉受体功能带来了新的见解，例如其气味分子识别模式6,7,26,33，激活机制

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披露

Y.F.、H.K 和 H.M. 于2016年10月27日就本研究提交了专利申请。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号DC014423和DC016224）以及美国国防高级研究计划局RealNose项目的支持。 YF在杜克大学期间获得了日本学术振兴会（JSPS）“推进战略性国际网络加速优秀研究人员流动计划”（R2801）的经费支持。我们感谢Sahar Kaleem对稿件的编辑工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05 % 胰蛋白酶-EDTAGibco25300-0540.05% 胰蛋白酶 - EDTA (1×)，酚红 - 4 ℃保存°C
100 mm 细胞培养皿 BD Falcon353003100 mm × 20 mm 细胞培养皿 
15 mL 离心管BD Falcon35209917 mm x 120 mm 圆锥形管
96孔板康宁384396孔板，LE型白色盖，透明底部，聚-D-赖氨酸包被的聚苯乙烯
两性霉素Gibco15290-018两性霉素 B 250 µg/mL - 4℃保存 °C
离心机JouanC312带有15 mL摆动桶转子的离心机
II类A/B3型生物安全柜NUAIRENU-407-500细胞培养用通风橱
FBSGibco16000-044胎牛血清 - 储存于 -20 °C
GloSensor cAMP 试剂PromegaE1290GloSensor cAMP 试剂 发光蛋白底物 - 储存于 -20 °C
37℃培养箱 °C；5% CO2Fisher Scientific11-676-604细胞培养用孵育箱
Lipofectamine 2000 试剂Invitrogen11668-019Lipofectamine 2000 试剂 1 mg/ml 转染试剂 - 4℃保存 °C
Luminometer POLARstar OPTIMABMG LABTECH已停止用于发光检测的96孔板读板仪
矿物油SigmaM8410气味剂溶剂——室温保存
最低必需培养基（MEM）Corning Cellgro10-010-CVEarle's平衡盐溶液的最低必需培养基’盐 & L-谷氨酰胺 - 4℃保存 °C
青霉素/链霉素Sigma AldrichP4333青霉素-链霉素溶液，含10,000 U青霉素和10 mg链霉素稳定保存——于-20℃保存 °C
pGlosensorPromegaE2301pGloSensor-22F cAMP 发光蛋白质粒 - 4℃保存 °C
相差显微镜Leica090-131.001配备 x4、x10、x20 物镜的相差显微镜
RTP1SH. Matsunami 实验室-100 ng/µL 质粒 - 4℃保存 °C

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