激发扫描高光谱成像显微技术高效区分荧光信号

摘要

光谱成像已成为在同一份样本中识别和分离多种荧光信号的可靠方法，能够有效区分目标信号与背景或自发荧光。激发扫描高光谱成像在此基础上进一步优化，可在降低图像采集所需时间的同时，显著提高信噪比。

摘要

多种技术依赖于荧光信号的检测，以识别或研究现象，或阐明功能。在高光谱成像技术出现之前，分离这些荧光信号一直是一项繁琐的工作；而高光谱成像技术能够将不同荧光源彼此分离，并将其与背景信号及自发荧光区分开来（前提是已知其光谱特征）。然而，传统的发射光扫描高光谱成像由于需要对激发光和发射光均进行滤波，导致采集时间较长且信噪比较低。已有研究证明，激发光扫描高光谱成像可在减少必要采集时间的同时，显著提高所获取数据的信噪比。本实验方案利用市售设备，详细描述了如何构建、校准并使用激发光扫描高光谱成像显微系统，以实现对单个样品中多个荧光源信号的分离。该技术虽特别适用于细胞与组织的显微成像，但也可能广泛应用于任何可调节激发波长的荧光实验中，包括但不限于：化学成像、环境科学、眼科护理、食品科学、法医学、医学科学以及矿物学等领域。

引言

光谱成像可通过多种方式进行，并有多个相关术语^{1，2，3，4}。通常，光谱成像指在至少两个空间维度和一个光谱维度上获取的数据。多光谱成像与高光谱成像通常根据波长波段的数量或光谱波段是否连续来区分¹。在本应用中，高光谱数据定义为通过连续波长波段获取的光谱数据，其相邻波段中心波长的间隔不超过所用激发滤光片半高全宽（FWHM）的一半（即对于带宽为14–20 nm的滤光片，中心波长间隔不大于5 nm）。数据波段的连续性实现了数据集的过采样，从而确保在对光谱域进行采样时满足奈奎斯特准则。

高光谱成像技术由美国国家航空航天局（NASA）在20世纪70年代和80年代结合第一颗陆地卫星（Landsat）的发展而研发^5,6收集多个连续光谱波段的数据，可生成每个像素的辐射光谱。通过识别和定义各组分的特征辐射光谱，不仅能够根据其特有的光谱特征检测表面物质，还能消除干扰信号，例如由大气条件引起的信号变化。利用物质特征光谱进行检测的概念于1996年被应用于生物系统，Schröck 等人采用五种不同荧光染料及其已知光谱的组合，通过一种称为光谱核型分析（spectral karyotyping）的技术实现了对标记染色体的区分。⁷该技术由Tsurui等人于2000年进一步发展，用于组织样本的荧光成像，通过使用七种荧光染料及奇异值分解，将每个像素的光谱信号分解为参考光谱库中光谱的线性组合，从而实现光谱分离⁸. 与遥感技术中的相应方法类似，只要给定高光谱图像，即可计算出每种已知荧光团的贡献值， 先验的 每种荧光染料光谱的信息。

高光谱成像还已应用于农业⁹、天文学¹⁰、生物医学¹¹、化学成像¹²、环境应用¹³、眼科护理¹⁴、食品科学¹⁵、法医学^16，17、医学科学¹⁸、矿物学¹⁹以及监控领域²⁰。当前荧光显微镜高光谱成像系统的一个关键限制在于，标准的高光谱成像技术通过以下方式将荧光信号分离到窄波段中：1）首先对激发光进行滤波以控制样本激发，然后 2）进一步对发射光进行滤波，将荧光发射分离为窄波段，之后可通过数学方法进一步区分²¹。对激发照明光和发射荧光同时进行滤波会减少可用信号量，从而降低信噪比，并导致需要较长的采集时间。信号弱和采集时间长限制了高光谱成像作为诊断工具的应用性。

已开发出一种成像方式，该方式利用高光谱成像技术并增强可获取的信号，从而缩短所需的采集时间^21,22。这种被称为激发扫描高光谱成像的新方法，通过改变激发波长并收集宽范围的发射光来获取光谱图像数据。先前研究已表明，与发射扫描技术相比，该技术可使信噪比提高数个数量级^21,22。信噪比的提升主要归因于所检测的发射光具有较宽的通带（约600 nm），而特异性则通过仅对激发光进行滤波而非荧光发射光来实现。这使得所有发射光（对应每一个激发波长）均可到达探测器²¹。此外，该技术可用于区分自体荧光与外源性标记物。更重要的是，由于可检测信号的增强而缩短了采集时间，这不仅降低了光漂白的风险，还使得光谱扫描的采集速率能够满足光谱视频成像的实际应用需求。

本实验方案的目的是作为激发扫描高光谱成像显微镜的数据采集指南。此外，文中还包含有助于理解光路和硬件的说明。同时描述了如何在激发扫描高光谱成像显微镜上实现开源软件的应用。最后，提供了如何将系统校准至可溯源至美国国家标准与技术研究院（NIST）的标准、调整软硬件设置以获得准确结果，以及将检测到的信号解混为各个组分贡献的方法说明。

方案

1. 设备设置

1. 光源：选择具有高功率输出和高度准直性的宽带光谱光源（本研究使用了300 W氙弧灯）。
2. 快门（可选）：在光路中添加快门，以减少延时成像过程中的光漂白。
3. 可调滤光系统：集成机械调谐装置和薄膜可调滤光片（TFTF），以实现所需的可调激发波长范围（例如360–485 nm）。
4. 显微镜：使用倒置荧光显微镜，配备电动多孔位二向色镜转轮及控制器。
   1. 荧光滤光块：组装一个长通荧光滤光块。为获得最佳效果，应选择相同波长的二向色镜和长通发射滤光片，以实现激发光与发射光的最佳分离（例如495 nm）。
   2. 物镜：使用合适的复消色差物镜，确保在实验所用波长范围内焦点均匀一致（本研究使用了60倍水镜）。
   3. 自动载物台（可选）：使用自动载物台，可快速采集多个视野，或通过图像拼接获得极大视野。需使用物镜和相机对载物台进行校准。
5. 相机：选择合适的相机，以满足实验对空间分辨率、灵敏度和噪声的要求（本系统采用了一款高灵敏度sCMOS相机）。

2. 采集软件

1. 选择一种能够独立控制每个硬件组件的软件包，例如 Micro-Manager。
   1. 创建配置文件：配置文件是一组已保存的仪器和指令，Micro-Manager 将加载该文件以控制系统的硬件。要创建配置文件，请单击 工具 > 硬件配置向导.
      1. 在步骤1中，单击 创建新配置 > 下一步 继续。请注意，用户可选择 修改或探索现有配置 如果已有可用的。
      2. 在步骤2中，浏览 可用设备 列表以查找可通过 Micro-Manager 控制的设备，例如显微镜、光源、载物台、快门和相机。当设备被高亮显示时，单击 添加… 单击按钮以将设备添加到已安装设备列表中。这将打开一个新窗口。
         1. 在设备标签上注明 标记 箱体。（例如，sCMOS 相机）
         2. 下 值，为每个设备选择相应的COM端口。这将在窗口底部显示设备属性列表。
         3. 将设备属性保持在默认设置。请注意，可根据需要为每个设备属性输入自定义值。
         4. 每次添加设备时，单击 下一步 单击按钮继续下一步。请注意，如果有任何设备被遗漏或需要更改，可按照步骤 2.1.1.1 中所述方法在后续修改配置文件。
      3. 在步骤3中，使用下拉菜单选择默认的相机、快门和对焦平台。如果需要自动快门，请点击 检查 聚焦阶段下拉列表下方的框。如果已知Z轴阶段的聚焦方向，请从下拉列表中选择 聚焦方向调节（高级）。否则，保留默认设置 未知.
      4. 在第4步中，双击下方的方框 延迟 [ms] 设置与自动化设备相关的延迟，例如为光源、载物台和快门设置100毫秒的延迟，为机械调谐组件的指令设置250毫秒的延迟，以补偿滤光片之间机械切换所需的时间。
      5. 在步骤5中，为状态设备分配标签。激发扫描显微镜系统的配置在滤光片盒中使用标签来识别每个荧光滤光片组（例如，状态0对应标签 明亮，用于明场成像的空滤光立方体；而状态3对应于标签 495 nm 以及定制的495 nm二向色滤光片组，用于在495 nm处分离激发光和发射光。机械调谐组件中还使用标签来存储每个激发波长的切换指令（例如，状态0对应机械调谐组件的340 nm激发波长调谐指令）。
      6. 在第6步中，单击 浏览 按钮旁边的下一个 配置文件 选择配置文件的保存位置和文件名。单击“完成”以保存配置文件。
   2. 启动组和预设：Micro-Manager 可在每个配置文件中存储不同的组，以激活或更改部分硬件。例如，“系统启动”组与预设组合将存储相机的默认设置，如 binning 尺寸和读出速率。
      1. 创建一个组（例如， 系统) 通过点击 + 主窗口中 组 小节
      2. 检查任何 是否用于分组？ 组内需要设置默认值的框（例如，关联的默认相机中的像素合并）。
      3. 在主窗口中点击 + 创建一个新预设（例如，“Startup”） 预设 小节
      4. 步骤2中勾选的每个复选框将在此处显示为预设选项。为每个已勾选的复选框选择一个默认值以加载。
   3. 激发波长的分组与预设：Micro-Manager 将每个激发波长视为独立的通道，并具有独立的波长切换指令；因此，每个波长必须保存为独立的预设。
      1. 创建一个新组以包含一组所需的激发波长（例如，“495 nm 二向色镜”）
      2. 检查 是否用于分组？ 名为盒子 标记 对应于 VF-5 装置。
      3. 为每个激发波长创建一个新预设（例如，“340 nm”）。
      4. 为每个预设分配相应的属性名称和预设值（例如，属性名称：“标签”；预设值：“340 nm”）。
   4. 多维采集工具：点击 多维采集 在 Micro-Manager 窗口的左上方附近，点击可打开一个可自定义的工具，通过单击一个按钮即可依次在各激发波长下捕获样品的图像。该工具提供多种自定义选项，可精确构建所需的采集流程。
      1. 时间点（本示例中未使用）：对于无延时成像成分的研究，请保持该复选框未选中。若需进行延时成像研究，请选中此框。若已选中，请在该框中输入重复执行其余采集设置的次数 数量 盒中。通过输入持续时间来设置连续采集之间的时间间隔 间隔 选择适当的单位（毫秒、秒或分钟；通常使用秒）。
      2. 多个位置（XY；本示例中未使用）：若仅研究单个 XY 位置，请保持该选项未勾选。如需设置多个 XY 位置，勾选该框并点击 编辑位置列表 按钮以打开一个独立窗口。将载物台移至每个目标位置，然后单击 马克 单击按钮以在软件中保存该位置。重复此操作，直至所有目标XY位置均被标记。关闭此窗口以继续。
      3. Z-堆栈（切片；本示例中未使用）：若仅研究单个Z位置，请保持该选项框未勾选。若需采集多个Z位置，勾选该选项框。将载物台移至所需的起始Z位置，然后点击 设置 按钮旁边的下一个 Z轴起始位置 盒。将载物台移动至目标终止Z位置，然后单击 设置 按钮旁边的下一个 Z端 盒中输入所需的步长（单位：微米） Z步进 盒子
      4. 通道：确保 通道 勾选该框。此处，通道是指各个激发波长的名称。可用的“通道”对应于步骤 2.1.2 和 2.1.3 中描述的“组”。
         1. 分组：单击下拉列表，从可用的激发波长组中选择一个组（例如，495 nm 二向色镜）。
         2. 点击 保持快门开启 勾选此框可在每个通道采集之间保持快门打开。请注意，如果同时在主窗口中选择了自动快门选项，则即使勾选此框，连续的光谱扫描之间快门仍会关闭。
      5. 点击 新 按钮以将通道添加到采集列表中。请注意 移除 按钮可用于移除不再需要的通道 向上 和 向下 可用于重新排列任何选定的通道。
         1. 确保 使用？ 在光谱扫描中，为每个所需的波长选择复选框。
         2. 配置：点击下方的下拉列表 配置 并选择所需光谱范围内的第一个波长（例如，340 nm）。
         3. 曝光：双击下方的框 暴露 输入所选波长的期望曝光时间（例如，“100”表示100 ms）。有关选择合适曝光时间的建议，请参见第5节“数据采集”。
         4. Z偏移（光谱扫描时不适用）：进行光谱扫描时，请将此框留空（设为0）。
         5. Z轴堆叠：如果进行Z轴堆叠，请确保在光谱范围内的每个波长均勾选此选项框。
         6. 跳过帧（在光谱扫描中不适用）：进行光谱扫描时，请将此框留空（设为0）。需要注意的是，当某些激发波长的强度明显高于其他波长，或某些激发波长表现出显著光毒性时，选择性跳过帧可能具有实际意义。
         7. 颜色：进行光谱扫描时，请将此框留空。注意，出于数据可视化目的，可为单个波长段选择颜色，但颜色不适用于后续的光谱解混。
         8. 重复这些步骤，直至将给定光谱扫描范围内每个所需的激发波长均添加完毕。
      6. 采集顺序：点击下拉列表，选择上述选项（2.1.4.1–2.1.4.5）的执行顺序。对于此类光谱扫描，采集顺序仅为 通道请注意，当在多维采集工具中选中更多选项（如时间点、多个位置（XY）和Z轴层切片（slices））时，会显示更多设置项，允许选择先进行位置或时间序列采集，随后选择层切片或通道。
      7. 自动对焦（本示例中未使用）：如果 多个位置（XY） 选定后，可使用多种不同的自动对焦模式。单击 选项 按钮，并从其旁边的下拉列表中选择一种自动对焦方法 关闭 按钮
      8. 摘要：查看此窗口，核对时间点数量、XY位置、Z层切片、通道、图像总数、总内存、扫描时长及采集顺序，确保所列信息与预期的采集参数一致。
      9. 保存图像：确保勾选此选项，以保存通过多维采集工具收集的数据。
         1. 点击旁边的 … 按钮 目录根目录 选择一个用于保存文件的目录根路径。目录根的命名应能描述实验的相关细节（例如，GCaMP 气道平滑肌细胞）。
         2. 在旁边的框中输入名称 名称前缀 用于描述当前图像采集的命名方式（例如 FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter）。建议创建一个名称前缀，以标识视野、曝光时间，以及其他相关信息，如所用样品和二向色滤光片。请注意，使用这些设置采集的第一组图像堆栈将以前缀名称后加“_1”的形式保存。在相同目录根路径下，若使用相同的名称前缀再次采集图像堆栈，则后续文件将按该名称在目录中被使用的次数依次以“_n”形式保存，其中“n”表示该名称前缀在该目录中已采集堆栈的次数。
         3. 点击 独立的图像文件 确保在每个激发波长下生成的图像均被保存。
      10. 保存为：点击 另存为… 位于多维采集工具右上角的按钮，用于保存这些采集设置，以便日后方便使用。请注意，目录根路径和文件名前缀也将一并保存。
      11. 获取：最后，单击 获取！ 单击按钮，根据上述选择的采集设置开始获取图像。

3. 光谱响应校正（可选）：

1. 可通过光谱输出校正来校准系统对已知标准的光谱响应，例如可溯源至美国国家标准与技术研究院（NIST）的标准灯或其他可溯源至NIST的标准或仪器。如果要将结果与其他光谱成像仪器、光谱仪或不同实验室之间的数据进行比较，此步骤尤为重要。该过程此前已有详细报道^21,23。
   1. 使用经可溯源至NIST的光源（如LS-1-CAL-INT，Ocean Optics）或其他可溯源至NIST的标准校准的光谱仪，获取在样品台位置测得的照明光源的光谱辐射功率。针对每一种光源设置、二向色镜和物镜的组合，需分别进行独立的校正。将积分球与光谱仪耦合，以准确测量显微镜物镜发出的大角度照明光。
   2. 采用积分方法（如梯形法则），对所照明波长范围内的光谱辐射数据进行积分。对于大多数半高全宽（FWHM）在14–20 nm范围内的滤光片，以中心波长为中心、带宽为40 nm的积分区间已足够。积分值代表每个激发波长波段的光谱照明强度。
   3. 将每个波长波段的积分强度作为激发中心波长的函数进行绘图，以直观显示光谱照明强度分布曲线。
   4. 确定积分强度最低的波长波段。
   5. 通过将最低积分强度除以各波长波段的积分强度，对光谱照明强度分布曲线进行归一化处理，从而生成与波长相关的校正因子。

4. 样品制备

1. 准备一个“空白”样品（例如，将一块玻璃盖玻片放入细胞室中，并加入 1 mL 缓冲液）。该缓冲液此前已有描述²⁴。
2. 准备一个未标记的样品，以确定样品是否存在自发荧光（例如，将含有未标记气道平滑肌细胞^25,26的玻璃盖玻片放入细胞室中，并加入 1 mL 缓冲液）。
3. 为实验中使用的每种荧光标记物分别准备单独的单标记样品，步骤如下：
   1. 将线粒体标记物稀释后加入缓冲液中，使其终浓度为 100 nM。将此缓冲液加入含有气道平滑肌细胞的盖玻片中，在 20–25 ˚C 下孵育 20 分钟。然后将盖玻片转移至细胞室，并加入 1 mL 缓冲液。注意，线粒体标记物的最佳浓度可能因生产厂家、所关联的荧光颜色以及期望的特异性等因素而异。
   2. 将转染了 GCaMP 探针²⁷的气道平滑肌细胞所在的盖玻片转移至细胞室，并加入 1 mL 缓冲液。
4. 准备一个或多个实验样品，其中包含所需的各种荧光标记物的混合物。
   1. 向含有转染了 GCaMP 探针的气道平滑肌细胞的盖玻片中加入 1 mL 缓冲液（含 100 nM 浓度的线粒体标记物），在 20–25 ˚C 下孵育 20 分钟。然后将盖玻片转移至细胞室，并加入 1 mL 缓冲液。

5. 数据采集：

1. 检查是否已选择合适的二向色镜（例如，495 nm 二向色滤光片组）、物镜（例如，60倍水镜）和相机（sCMOS 相机）。
2. 将样品加载到载物台上。
3. 双击曝光时间 [ms]旁边的框，输入“100”，将曝光时间设置为 100 ms。请注意，曝光时间可能需要根据样品的荧光强度进行增加或减少。
4. 在 Micro-Manager 主窗口的下拉菜单中选择 475 nm，用于初始样品观察。请注意，475 nm 可能并非用于样品观察或判断在整个图像堆栈中是否会发生过饱和的最佳波长。
5. 点击实时以查看样品。
   1. 点击窗口底部直方图旁边的自动强度显示范围按钮自动，使最小值和最大值进入有意义的视觉范围。
6. 使用显微镜的调焦旋钮对样品进行调焦。通常，找到样品的边缘有助于调焦。当图像中的边缘特征变得清晰时，即表示样品已聚焦。请注意，在调焦过程中可能需要多次点击自动按钮，以帮助观察荧光图像。此外，某些用户可能会发现，如果显微镜处于透射光模式下，调焦会更加容易。
   1. 如果在透射光模式下调焦，出于安全考虑，在调整光路以进行透射成像之前，应首先确保光谱光源未向目镜传输光线。还需注意，透射图像与荧光图像的焦点之间可能存在微小偏差。当达到可接受的焦点后，重新配置光路以进行光谱荧光成像。
7. 点击窗口左上角附近的多维采集按钮，打开多维采集工具（在第 2 节中描述并配置）。
8. 通过点击多维采集工具窗口右上角的加载…按钮，并导航至先前保存的激发设置（步骤 2.1.4.10），选择适合光谱采集的适当光谱范围（例如，对于 495 nm 二向色滤光片，选择 360–485 nm）。有关适当光谱范围的信息，请参见讨论部分。
9. 采集一幅不含荧光数据的背景/空白图像，用于背景和噪声扣除。可通过使用空白样品（步骤 4.1）或导航至实验样品中的空白区域来完成。如步骤 5.6 所述，最简便的方法是先找到样品边缘，然后将其移动至视场中心。
   1. 确认采集设置后，当背景区域可见时，点击采集！按钮，获取包含背景和噪声的光谱图像堆栈，供后续扣除使用。需注意，样品在远离边缘的区域荧光通常更强。建议在样品上移动，寻找“最亮”区域，并进行多次测试图像堆栈采集，以确定合适的采集时间并避免过曝。
10. 在样品中荧光较强的区域采集一幅单次图像堆栈，以确保任何波长组合和曝光时间均不会导致过曝。
11. 使用 ImageJ 确认没有任何波长包含过曝像素。
    1. 在 ImageJ 中，点击文件 > 导入 > 图像序列，并导航至包含步骤 5.10 所采集光谱图像的文件夹。这将打开一个新窗口。勾选图像数量旁边的框，并输入光谱扫描中包含的波长数量（例如，26）。将起始图像和增量保持为“1”。点击确定继续。
    2. 按下键盘上的M键，使用 ImageJ 的测量功能。确保最大值下方列出的数值未达到相机的最高检测限（例如，65,535）。对光谱扫描中的每幅图像重复此操作。请注意，相机的检测限取决于相机本身。该上限值显示在 MicroManager 主窗口直方图的右上部分。或者，可通过在 ImageJ 中打开一幅图像，然后导航至图像 > 调整 > 亮度/对比度来确定上限。在弹出窗口中点击设置按钮，在最大显示值旁边的空白处输入一个过大的数值（例如，999,999），然后点击确定继续。新直方图中显示的最大值即为相机的最高检测限。
    3. 如果任何图像包含相机的最高检测限（例如，65,535），请调整光谱扫描的曝光时间，以确保在整个光谱范围内的最大信号不超过相机的动态范围。
12. 从未标记的样品中采集光谱图像数据，以确定任何自发荧光。使用与实验其余部分相同的波长范围和相机设置对未标记样品进行扫描（例如，360–485 nm，每个波长 100 ms）。
13. 从单标记样品中采集光谱图像数据，作为光谱对照，用于构建光谱库。对每种标记物使用相同的波长范围、曝光时间和相机设置进行扫描。请注意，某些样品可能需要更长的采集时间，以便在噪声贡献最小的情况下准确检测标记物光谱。
14. 在实验样品上进行测量（例如，含 GCaMP 探针和线粒体标记的人气道平滑肌细胞）。
    1. 将含有实验样品的载玻片或盖玻片放置在显微镜上。
    2. 选择一个含有适当标记的细胞或组织的视野。
    3. 按照上述方法，使用所需的采集设置采集光谱图像数据。

6. 图像分析

1. 将图像校正为平坦的光谱响应。
   1. 减去第5.9节中获得的背景光谱，并乘以第3.1.5节中确定的校正系数。此操作可通过简单的MATLAB脚本或ImageJ程序完成。本示例中使用的减法/校正MATLAB代码可在南阿拉巴马大学生物成像资源网站获取。
      1. 在MATLAB中加载减法/校正代码。
      2. 在“编辑器”选项卡中，点击运行。这将打开一个包含“Bsq校正”按钮的新窗口。点击“Bsq校正”按钮，将打开另一个窗口，其中包含工作目录、背景文件、校正因子文件和未校正tiff文件夹的选择项。
         1. 使用工作目录旁边的浏览…按钮，选择后续窗口将打开的文件路径。导航至包含保存的背景光谱（.dat格式）的文件夹。
         2. 使用背景文件(.dat)旁边的浏览…按钮，打开步骤6.1.1.2.1中选择的目录，并选择所需的背景文件（.dat格式）。点击“打开”按钮继续。
         3. 使用校正因子(.dat)旁边的浏览…按钮选择一个校正因子。校正因子的默认目录为父级MATLAB代码所在位置。如有必要，导航至包含校正因子文件（.dat格式）的子文件夹。选中正确的校正因子文件后，点击“打开”按钮继续。
         4. 使用未校正Tiff文件夹旁边的浏览…按钮，打开步骤6.1.1.2.1中选择的目录，并选择用于背景减除和图像校正的文件夹（通常为直接包含原始光谱图像的Pos0文件夹）。点击打开按钮继续。
         5. 点击点击进行光谱校正按钮。处理完成后，将弹出一个显示“Bsq校正完成”的窗口。点击确定按钮继续。校正后的图像将存储在一个新文件夹中，该文件夹名称为原始原始光谱图像文件夹名加上“_Corrected”后缀（例如，Pos0_Corrected）。
2. 生成光谱库。可使用多种软件包从图像中提取光谱数据，包括ImageJ。为获得最佳结果，应通过确定哪个波长通道的强度最大，将每个端元归一化至该最强波长通道，即用各波长通道的测量值除以该最大值。还需注意，在自发荧光样本中生成的单标记对照需要额外的调整^{28,29,30,31,32}。详见步骤6.2.4及讨论部分。
   1. 在ImageJ中，点击文件 > 导入 > 图像序列。这将打开一个新窗口。导航至包含已校正光谱图像的文件夹。双击文件夹中的任意图像文件，将打开一个新窗口。勾选图像数量旁边的复选框，并输入光谱扫描中包含的波长数量（例如，26）。将起始图像和增量保持为“1”。点击确定按钮继续。
   2. 在ImageJ主窗口中，点击多边形选择图标，然后使用鼠标指针在图像上点击以围绕包含荧光数据的区域绘制多边形。注意：初始波长通道中可能几乎没有荧光数据。可切换至其他波长图像，和/或使用亮度/对比度工具（图像 > 调整 > 亮度/对比度 > 自动）以更清晰地观察感兴趣的荧光区域。
   3. 绘制多边形后，通过点击图像 > 堆栈 > 绘制Z轴剖面图生成Z轴剖面。这将打开一个新窗口。点击“保存”以将光谱数据保存为.csv文件。
   4. 进行减法运算，以确保获得不含自发荧光污染的纯标记光谱库。使用以下公式²⁹从单标记与荧光的混合物中分离出纯光谱：
       (1)
      其中：S_pure为标记物的纯光谱，S_mixed为受自发荧光污染的样本测量光谱，S_autoFL为测量的自发荧光光谱，“a”为自发荧光光谱的标量乘数（介于0和1之间，例如0.4），“offset”为偏移量（通常为0）。调整“a”项，使自发荧光的表观贡献接近于零。更多详细信息可参考多篇文献^{28,29,30,31,32}。
3. 解混光谱图像数据。解混步骤将为每个荧光标记生成一幅丰度图像，其中丰度表示图像中来自相应标记的相对荧光信号量。ImageJ支持多种解混算法^33,34,35。此外，本示例中使用的光谱解混MATLAB代码可在南阿拉巴马大学生物成像资源网站获取。有关光谱解混的更全面概述可参见文献³⁶。
   1. 在MATLAB中加载光谱解混代码。
   2. 编辑Wavelength.mat和Library.mat文件，使其对应实验条件（例如，“Wavelength”为360-485，间隔为5）。
      注意：各波长对应的数值应加载至“Library”中，对应每个荧光标记（及自发荧光）。“Endmember_Name”应按“Library”中列值的相同顺序列出各标记。注意，Library.mat文件应同时包含“Library”和“Endmember_Name”变量。
   3. 在“编辑器”选项卡中，点击运行。这将打开一个新窗口，允许用户选择目录。导航至包含待解混光谱图像的文件夹。选择后，将打开一个新窗口。
   4. 在出现的空白字段中，分别输入图像名称（例如，HASMC with GCaMP and Mito FOV1）、波长通道数（例如，26）、时间点数（例如，1）以及是否需要FRET测量（例如，n）。若FRET选择“n”，则两个端元空白字段均留空。按确定继续，将打开一个新窗口。
   5. 导航至包含Wavelength.mat文件的文件夹。选择后，点击打开继续，将打开一个新窗口。
   6. 导航至包含Library.mat文件的文件夹。选择后，点击打开继续，解混后的图像将保存在光谱图像所在目录内的一个新“Unmixed”文件夹中。
4. 检查解混光谱图像的质量。
   1. 打开每幅解混图像，目视检查纯组分的分布情况。
      1. 将误差图像的幅值与解混图像的幅值进行比较（类似于步骤5.11，可通过ImageJ的测量功能完成）。若误差图像的幅值与解混丰度图像的幅值相近，则表明光谱图像数据中存在未被光谱库和线性光谱解混过程准确描述的信号。
      2. 将误差图像与解混图像进行比较，查看是否存在未识别的残余结构。

结果

该方案中的若干关键步骤对于获取准确且无成像与光谱伪影的数据至关重要。若省略这些步骤，可能导致数据看似显著，但无法通过其他任何光谱成像系统进行验证或重复，从而实质性地使基于这些数据得出的结论无效。其中最重要的步骤是正确的光谱输出校正（第3节）。校正因子用于补偿可调谐激发系统光谱输出随波长变化的差异。该过程通过调整高激发功率的波长，使其光学照明功率与低激发功率波长下的照明功率相当，从而实现平坦的光谱激发轮廓。不恰当的校正因子的一个示例是在一个或多个波长处具有极低的数值（例如，<0.001），这表明在这些波长下测得的强度值必须被大幅衰减才能获得平坦的光谱响应。

将系统校准至可追溯至美国国家标准与技术研究院（NIST）的标准，可确保使用激发扫描光谱成像系统所采集的数据，与其他同样校准至NIST可追溯标准的系统之间具有可比性。因此，必须确保任何校正因子均能适当地调整所采集的数据。校正因子的准确性可通过使用荧光标准物质（例如可追溯至NIST的荧光素）进行验证...

讨论

激发扫描高光谱成像系统的最佳使用始于光路的构建。具体而言，光源、滤光片（可调谐和二向色性滤光片）、滤光片切换方式以及相机的选择，决定了可用的光谱范围、可能的扫描速度、探测器灵敏度和空间采样能力。汞弧灯提供多个激发波长峰，但其光谱输出不平坦，因此在输出峰处需要显著降低信号强度，以将光谱图像数据校正至可追溯至美国国家标准与技术研究院（NIST）的响应值³⁸。其他替代光源，如氙弧灯和白光超连续谱激光器，可能提供更均匀的光谱输出，更适合用于激发扫描高光谱成像^38,39,40。光源、可调谐滤光片和二向色性滤光片的选择共同决定了可用的光谱范围。该范围应根据实验样品所需的光谱信息进行慎重选择。

此外，在选择可调谐滤光片的切换机制时，还应考虑各种相机参数，例如量子效率、像素尺寸和可用的帧率，因为这些因素会影响潜在的采样速率⁴¹

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
气道平滑肌细胞	国家疾病研究互换组织（NDRI）	从美国神经疾病与中风研究所（NDRI）获取的人肺组织中分离得到	高度自发荧光的钙敏感细胞
自动快门	Thorlabs 公司	SHB1	可远程控制的快门以最小化光漂白
自动载物台	Prior Scientific	H177P1T4	用于自动采集多视野或拼接图像的远程可控载物台
自动载物台控制器（XY）	Prior Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	用于连接自动载物台与计算机及操纵杆
缓冲液	自制	自制	145 mM NaCl，4 mM KCl，20 mM HEPES，10 mM D-葡萄糖，1 mM MgCl2，以及 1 mM CaCl2，pH 7.3
细胞培养室	赛默飞世尔科技	Attofluor 细胞培养皿，A7816	由外科级不锈钢和橡胶O型圈组成的盖玻片支架，用于密封培养基并防止样本和/或物镜污染
激发滤光片	Semrock 公司	TBP01-378/16	中心波长范围（340–378 nm），带宽（最小 16 nm，标称 FWHM 20 nm），折射率（1.88）
	Semrock 公司	TBP01-402/16	中心波长范围（360–400 nm），带宽（最小16 nm，标称FWHM 20 nm），折射率（1.8）
	Semrock 公司	TBP01-449/15	中心波长范围（400–448.8 nm），带宽（最小15 nm，标称FWHM 20 nm），折射率（1.8）
	Semrock 公司	TBP01-501/15	中心波长范围（448.8–501.5 nm），带宽（最小15 nm，标称FWHM 20 nm），折射率（1.84）
	Semrock 公司	TBP01-561/14	中心波长范围（501.5–561 nm），带宽（最小 14 nm，标称 FWHM 20 nm），折射率（1.83）
荧光滤光片组 二向色镜分光器	Semrock 公司	FF495-Di03	在495 nm处分离激发光和发射光（>350–488 nm 范围内反射率高达 98% >502-950 nm 范围内透射率为 93%，滤光片有效折射率（1.78）
荧光滤光片组 长通滤光片	Semrock Inc.	FF01 496/LP-25	允许波长大于496 nm的光通过（ >503.2–1100 nm 范围内的平均透射率为 93%，折射率为 1.86
GCaMP探针	Addgene	G-CaMP3；质粒编号 #22692	基于单波长GCaMP2的基因编码钙离子指示剂
积分球	海洋光学	FOIS-1	用于宽角度照明的精确测量
倒置荧光显微镜	尼康仪器公司	TE2000	倒置显微镜可直接激发样品，无需穿透培养基和/或组织的多层结构。
Mitotracker Green FM	赛默飞世尔科技	M7514	标记线粒体
可溯源至美国国家标准与技术研究院（NIST）的校准光源	海洋光学	LS-1-CAL-INT	具有已知光谱、用作标准的光源
可溯源至美国国家标准与技术研究院的荧光素	赛默飞世尔科技	F36915	用于验证系统的适当光谱响应
NucBlue	赛默飞世尔科技	R37605	标记细胞核
目标（10X）	尼康仪器公司	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	适用于大视野观察
目标（20倍）	尼康仪器公司	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	最常用于组织样本
目标（60倍物镜）	尼康仪器公司	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	最常用于细胞样本
sCMOS相机	Photometrics	Prime 95B（版本 A8-062802018）	用于获取高灵敏度数字图像
光谱仪	海洋光学	QE65000	用于测量激发扫描光谱系统的光谱输出
可调滤光片转换器	Sutter Instrument	Lambda VF-5	用于自动激发滤光片调谐/切换的电动装置
氙弧灯	Sunoptic Technologies	Titan 300HP 光源	光谱输出相对均匀的光源