非随机小鼠模型在非活性 X 染色体上对 Mcp2 的药理再激活

X 染色体失活 (XCI) 是一个剂量补偿的过程, 通过沉默 x 染色体的一个副本 x 染色体在女性¹平衡 x 连锁基因表达。因此, 非活性 X 染色体 (Xi) 积累了异染色质的特征特征, 包括 DNA 甲基化和抑制组蛋白修饰, 如组蛋白 H3-lysine 27 三甲基化 (H3K27me3) 和组蛋白 H2A 泛性 (H2Aub)². x 染色体沉默的主调节器是 x 失活中心 (xic) 区域, 约 100-500kb, 控制 x 染色体的计数和配对, 随机选择 x 染色体的失活, 以及启动和启动和沿 X 染色体^3号的沉默传播。X 失活的过程是由 X 不活跃的特异性转录 (xist) 启动的, 它覆盖了西在cis中, 介导全染色体的沉默, 并重新建模 x 染色体⁴的三维结构。最近, 一些蛋白质组和基因屏幕已经确定了 xci 的其他调节剂,如xist相互作用的蛋白质^{5,6,7, 8,9 ,10,11,12}. 例如, 以前一项使用无偏见的全基因组 rna 干扰屏幕的研究确定了 13个反作用Xci 因素 (xcif)¹²。在机械上, Xcif 调节Xist 表达,因此, 干扰 xcif 功能会导致有缺陷的 xci¹²。该领域最近的进展共同为启动和维护 XCI 所需的分子机制提供了重要的见解。

Xci 调节剂的识别和对其在 xci 中的机制的了解与 x 连锁人类疾病直接相关, 例如 rett 综合征 (rtt)^13、14。RTT 是一种罕见的神经发育障碍, 由 x 连锁甲基 cpg 结合蛋白 2 (mecp2) 中的杂合突变引起, 主要影响15岁的女孩^.由于Mecp2位于 x 染色体上, RTT 女孩对Mecp2缺乏症具有杂合, 其中约50% 的细胞表达野生类型, ~ 50% 表达突变mecp2。值得注意的是, RTT 突变细胞在习近平上有一个休眠但野性的Mcp2副本, 提供了功能基因的来源, 如果重新激活, 可能会缓解这种疾病的症状。除了 RTT, 还有其他几种 x 连锁人类疾病, 其中习近平的再激活代表了一种潜在的治疗方法, 如 DDX3X 综合征。

通过短发夹 Rna (SHRNA) 或小分子抑制剂对 Xcif、3-磷酸苷依赖蛋白激酶-1 (PDPK1) 和激活蛋白 A 受体类型 1 (ACVR1) 的抑制作用, 使氧连接基因¹²重新激活。在各种体外模型中观察到了与氧相关基因的药理再激活, 这些模型包括小鼠成纤维细胞系、成年小鼠皮质神经元、小鼠胚胎成纤维细胞和来自 RTT 患者¹²的成纤维细胞系。然而, 与西有关的基因在体内的药理再激活是否可行还有待证明。一个限制因素是缺乏有效的动物模型来准确测量反应新激活后的基因表达。为了实现这个目标, 一个Xisti:mcmp2-g夫 p小鼠模型已经生成, 由于在母亲 x 染色体¹⁶上的 xist 中的杂合缺失, 在所有细胞中携带一个基因标记的 mcp2 在 xi 上. 利用该模型, 在活鼠大脑中使用Xcif 抑制剂治疗后, 对习近平 mecp2 的表达进行了定量处理。在这里, 介绍了基于免疫荧光的检测方法, 对皮质神经元中 xi 再激活进行定量的模型和方法。

涉及老鼠的工作得到了弗吉尼亚大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC; #4112) 的批准。

1. 在 Xi 上生成具有基因标记Mecp2的非随机 Xci 鼠标模型

请注意:研究中使用的小鼠株如下: mcmp-2 tm3.1 bird 和xist/ xist (B6;129^-Xist 由 antonio bedalov、 fred 提供)西雅图哈钦森癌症中心)。在各自菌株之间的育种策略被设计为扩大每个菌株的老鼠菌落。

1. 使用表 1中列出的基因特异性引物对所有小鼠菌株和育种后获得的各自后代进行 pcr 基因分型。

2. 设计小鼠育种策略, 生成: Mecp2·exit:mecp2-g夫发

1. 通过将一个 Mcp2-gfpy 雄性和一个-Mcp2/mcgp2 雌性放在一起建立一个繁殖对 (12h12 小时/黑暗周期) (图 1a)。理想情况下, 使用可行和肥沃的老鼠一次至少建立5个繁殖对。怀孕的女性分娩后, 让她与男性一起抚养第一个垃圾。
   请注意:由于父亲Xist淘汰赛损害了印迹 xci、剂量补偿和分化途径¹⁷, 在育种中使用-mecp2·y小鼠将无法产生具有所需基因型的雌性幼崽。
2. 在产后第21天 (P21) 断奶后, 使用基于 pcr 的基因分型方法对 "": Mcp2-gfp雌性幼崽进行鉴定和标记 (图 1 b)。
   请注意:就每组所需的动物数量而言 , 根据下文报告的结果 , 建立了 5 对繁殖对 , 产生了大约 10 只雌性 : Mcgp2 - g 夫 p小鼠.
3. 使用雌性鼠标模型的所有建议的实验。
   请注意:性是 XCI 研究的一个重要生物学变量, 男性模型没有解释随机 XCI 的混淆效应。
4. 为了在整个动物研究过程中保持一致 , 排除动物年龄的任何影响 , 在 5 - 8 周大的雌性中进行所有实验 : mcp2 Xist : mcp2 - g 夫p 小鼠。

3. 隔离女性: Mcp2is:mcp2-g夫 p小鼠胚胎成纤维细胞 (mef)

1. 在Mcp2-gfpy雄性和 "建立至少3-4 个交配笼, 以增加怀孕的可能性。
2. 在确认交配后的早晨阴道堵塞后, 分离雌性, 这一天被认为是胚胎日 0.5 (E0.5)。监测准孕妇的体重增加情况, 并对小鼠腹部进行目视检查, 以确认怀孕情况。在 E14.5−15.5 上, 通过宫颈脱位对怀孕的雌性小鼠进行安乐死。
3. 在层流罩下, 用70% 的乙醇擦拭孕妇的腹部。使用无菌剪刀, 解剖腹腔, 取出含有胚胎的子宫角。使用钳子, 轻轻地取出胚胎, 同时切断剩余的腹部组织 (通常是6-12 胚胎是预期)。
4. 将含有胚胎的子宫角放入10毫米组织培养盘中。使用无菌剪刀和钳子, 沿着子宫角做一个切口, 以分离携带胚胎的单个囊。小心地将含有其余胚胎的子宫角放入冰上, 放入30毫升的无菌 hanks 平衡盐溶液 (HBSS) 中。
5. 轻轻切开囊, 用无菌剪刀和钳子分离胚胎。通过切割脐带取出胎盘。
6. 斩首胚胎。
   请注意:虽然胚胎组织的其余部分将被进一步处理, 但胚胎头的组织将被用来分离 DNA 进行基因分型。
7. 用无菌剪刀和钳子切割胚胎的中线, 打开腹部。取出内脏, 如心脏、肝脏和肺。
8. 将剩余的胚胎组织转移到60毫米的无菌组织培养板中, 用剪刀或剃须刀片切割成小块。要打开细胞团块, 请添加3毫升的胰蛋白酶 edta (0.05%)在37°c 孵育15分钟。
9. 中和胰蛋白酶 edta, 加入5毫升的杜尔贝科改良鹰培养基 (DMEM) 与10% 的胎牛血清 (FBS) 和10μg 将青霉素链霉素 (pen/tchp) 分解成板材, 并通过重复移液分离组织 (约 20-30倍)。
10. 将细胞向下旋转 5分钟, 并在 DMEM 的 4 ml 中重新悬浮细胞颗粒, 用10% 的 fbs 和 10μgml pen 链路。将细胞贴在60毫米培养皿上, 在5°c 的情况下培养细胞, 并在5% 的 CO2 的情况下进行培养。
11. 对每个胚胎执行 3.5-3.10 步。
12. 在第3.11 步中获得的培养系数至少3-4天。
    请注意:在这一阶段, Mef 也可以被冷冻保存用于未来的实验。
13. 要确定每个胚胎的性别和基因型, 请使用表 1所列引物和 PCR 条件, 使用从胚胎头部分离出的 dna 进行基因分型 pcr。

4. 使用 Faufaustare®活化细胞排序法检测证实绿色荧光蛋白 (GFP ) 在 Xisti:mecp2™小鼠大脑中缺乏表达

1. 使用剪刀, 将大脑皮层与大脑半球的其他部分分离, 并将其放置在1毫升的冷核隔离介质 (NIM) 缓冲液中, 其中含有 250 mM 蔗糖、25 mM 氯化钾 (KCl)、5 mM 氯化镁 (MgCl 2)、10mm Tris-Cl,补充2% 的甲醛 (PFA) 和0.1% 的非离子表面活性剂 (材料表)。
2. 使用冰凉玻璃均质机进行均质。
3. 在 600 x g、4°c 下旋转均质组织5分钟。
4. 在 NIM 溶液中去除上清液并重新悬浮颗粒, 在25% 碘化醇的1毫升中重新悬浮颗粒。
5. 在 NIM 溶液中添加1毫升29% 的 lodixanol, 加入 4 mL 超离心管 (储存在冰上, 直到样品准备好), 并小心地分层样品的1毫升 (在25% 的 lodixanol 中)。
6. 离心机在 9, 000 x克, 4°c, 10分钟在超离心机中进行。
7. 在500μl 荧光活化细胞分选 (FACS) 缓冲液 (磷酸盐缓冲盐水 [PBS] 补充 1 mM EDTA、0.05% 氮化钠和2% 的牛血清白蛋白 [BSA]) 中的螺状体上清液和再悬浮颗粒。
   请注意:样品可以在4°c 或最多1周的温度下存储。
8. 在室温下加入5Μl 的 7-氨基-放线菌素 D (7-AAD; 50 Mg/ml) 5分钟, 对 DNA 进行染色。
9. 采用流式细胞仪分析 7-aad 和绿色荧光蛋白 (GFP) 信号的样品。

5. 确定Xisti:micp2is:micp2-g夫p 小鼠模型的可行性, 用于 Xi 再激活

1. 种子 1 x 10 5 细胞/女性: mcp2-gfp mof 、 Micp2-gfp和xist-micp2/y米能在步骤3.12 中以6井格式和室内幻灯片获得, 在 dmem 中有10% 的 fbs 和 10μgml pen 链球菌, 在37°c 的温度下。5% 的 CO 2 的存在。
   请注意:实验中采用 mcmp2/gfp和Xist-Mecp2/Y 2/mof 作为正负对照。
2. 24小时后在细胞中添加新鲜培养基。对于Xisti:mc泌尿-Xits:mcemp2-g夫 mef, 添加中补充 xcif 抑制剂 (例如, 0.5ΜM ldn193189 和 2.5ΜM GSK650394), 或单独使用车辆。每2天更换一次补充新鲜抑制剂或单独车辆的介质。对于Mcmp2-gfp 和 Xist-Mecp2/Y mef, 每2天添加新鲜培养基。
3. 术后1周的抑制剂处理, 收获 Mof 用于 RNA 分离 (6 孔板) 或固定细胞进行免疫荧光 (腔内切片)。使用从Mcmcmep2-g夫胚胎中分离出的 mof 分别作为阳性胚胎和xist-mchop/y胚胎作为阴性对照。
   1. 对于 RNA 分离, 通过基于 guanidinium 硫代纳米的 RNA 提取试剂分离总 RNA, 并使用逆转录酶进行逆转录酶逆转录酶。如前¹²所述, 用定量逆转录酶pcr (qrt-pcr) 测量mep2-gfp 的表达, 并使用表 1中列出的引物。
   2. 如前面^所述, 对于免疫荧光, 用抗 gfp 原代抗体 (1: 100⁾染色 mof。用定量免疫荧光法测定药物中 GFP 强度的方法: Mistp2·xit:metp2-gfp mef, 如前¹⁸所述。

6. 展示了西姆斯基的脑组织中的药理作用--Micp2is:micp2-g夫p 小鼠模型

1. 准备药物和车辆控制。
   1. 准备一种新鲜的无菌的车辆溶液 (0.9% 氯化钠、0.5% 的甲基纤维素、4.5% 的二甲基亚硫醚 [DMSO]) 用于脑注射。
   2. 制备化学抑制剂, 包括 1.5 mM LDN193189 (ACVR1 的小分子抑制剂) 和 1.6 mM GSK650394 (PDPK1 的下游效应因子 SGK1 的小分子抑制剂) 重新悬浮在车辆 (0.9% 氯化钠, 0.5% 甲基纤维素, 4.5% DMSO), 或车辆独自。化学抑制剂或车辆注射的总量为每种动物每剂10Μl。
2. 准备动物的大脑注射。
   1. 用消毒剂擦拭工作台和加热垫 (10% 次氯酸钠溶液), 准备手术区域。
   2. 用腹腔注射的酮胺/木糖混合物, 分别为 140 mg/kg 和 10mgskg, 对4周大的小鼠进行麻醉。使用踏板退出反射, 以确定麻醉的水平。
   3. 麻醉诱导后将眼药膏涂在眼睛上, 以防止角膜干燥。
   4. 把从脖子上的毛擦掉到老鼠头顶。
   5. 将鼠标放置在立体定向平台上, 方法是将鼠标的门牙挂在鼻子约束器的咬合杆上, 并拧紧鼻子夹子在鼻子上, 同时确保鼠标的头部处于水平平面上。
   6. 根据需要调整耳条的高度, 以达到耳道的尾端部分, 将其固定, 使鼠标的头部处于水平平面, 并在手指触摸时固定。
   7. 用交替擦拭的外用防腐剂 (如聚维酮碘和70% 乙醇) 对小鼠头部进行消毒。
3. 管理毒品。
   1. 使用无菌手术刀, 在头皮中部做一个0.75 厘米的水平切口。
   2. 使用0.45 毫米毛刺, 在左右皮质半球上方钻两个对称孔 (从矢状缝合线2毫米, 从小叶缝合线2毫米, 大约在顶骨中部)。
   3. 将10Μl 注射器牢固地连接到立体定向平台上。
   4. 将化学抑制剂的溶液混合, 并将10Μl 溶液放入注射器中。避免注射器中的任何气泡。
   5. 将注射器针推进到毛刺孔, 保持针头垂直 (90°) 至头骨。当针头穿过头骨时, 将立体定向数字显示屏上的坐标清零, 然后将针头尖端推进到2.5 毫米的深度。
   6. 将针头拉到0.5 毫米的深度, 为2毫米。
   7. 慢慢注入10Μl 溶液 (~ 1分钟)。注射完成后, 将针头留在大脑中约 1分钟, 然后取出针头。
   8. 重复注入第二个半球 (车辆只控制)。
   9. 使用缝合线或 "皮肤胶" 关闭小鼠的皮肤 (如果伤口 > 0.5 厘米的缝合线和 "皮肤胶水" 应使用)。
   10. 松开耳条, 并从立体定向装置中取出鼠标。
   11. 管理镇痛药 (丁丙诺非 sr 0.5 mg/kg IP), 并将鼠标放在设置为37°c 的加热垫上, 直到动物恢复意识。
   12. 一旦老鼠保持警觉和反应, 将动物转移回原来的笼子。
   13. 每2天重复此过程, 为期20天。在随后的注射中不需要重复钻取该区域。
4. 隔离老鼠的大脑。
   1. 一旦剂量方案完成, 在二氧化碳_室中对鼠标进行安乐死。
   2. 用针头将鼠标固定在表面上。
   3. 用剪刀和钳子在肋骨下的内侧壁上做一个外侧切口。小心地将肝脏与横隔膜分开。
   4. 使用剪刀, 切割隔膜, 并继续沿着整个长度的肋骨笼, 以暴露胸膜腔。
   5. 用剪刀, 在左心室后端做一个切口。
   6. 立即开始注射右心腔 ~ 15 毫升的 PBS ~ 2分钟. 肝色由红色变为浅粉色, 说明灌注良好。
   7. 在 PBS 中注入约10毫升的4% 甲醛的右室 ~ 2分钟。
   8. 斩首小鼠, 并使用剪刀做头皮的中线切口, 以暴露头骨。
   9. 将剪刀的一个尖端放入大孔, 并向肉眼侧向切割到头骨中。对另一侧重复此操作。尽量保持剪刀的末端表面, 以避免大脑受伤。
   10. 用剪刀剪断鼠标眼睛之间和鼻子上方的区域。
   11. 使用钳子轻轻地剥去大脑半球的颅骨。
   12. 用铲子抬起大脑, 用剪刀仔细解剖将其固定在头骨上的颅神经纤维。
   13. 将大脑放在塑料盘上, 切掉小脑和嗅觉灯泡, 并将大脑放入一个充满 4% PFA 的15毫升管中, 是 PBS。
5. 冷冻分割老鼠的大脑。
   1. 在4°c 的 PBS 中, 在4°c 过夜时修复4% 的甲醛脑。
   2. 在4°c 下用 PBS 冲洗大脑, 每次至少 3倍, 每次5分钟。
   3. 为一次性模具贴上标签, 以冷冻保存组织。
   4. 用剪刀和钳子切掉大脑的前部 (开始从注射部位制作 ~ 5 毫米的部分)。
   5. 将大脑转移到冷冻体, 大脑前部朝下, 获得日冕切片。将包含大脑的霉菌浸入最佳的切割温度化合物 (OCT) 中。
   6. 将液氮倒进10毫米的塑料培养皿中, 并将大脑放入低温模具中。
      请注意:重要的是要按照步骤6.5.5 中描述的方向来引导大脑的切片。
   7. 当 OCT 为纯白色时, 将冷冻大脑放入-80°c 的冰柜中存放。
   8. 在用低温恒温器和冷冻 (5-6μm 厚度) 切割大脑之前, 将大脑平衡到-20°c 至少 30分钟, 每张幻灯片安装2-3 节。幻灯片可以存储在-80°c, 供以后使用。
6. 使用基于免疫荧光的方法确定 Xi 重新激活。
   1. 在开始染色程序之前, 在4°C 下将大脑部分干燥过夜。
   2. 将幻灯片浸入抗原回收溶液 (0.1 m 柠檬酸, 0.1 m Tris-base, pH = 6.0) 100°c 的热块上5分钟。
   3. 用 1x PBS 清洗幻灯片 4x, 每次在室温下清洗5分钟。
   4. 将滑块浸入阻隔溶液中 (0.1 mnh₄Cl/pbs 0.2% 明胶-0.05% 非离子表面活性剂) 在室温下浸泡20分钟。
   5. 在室温下用洗涤缓冲液 (PBS.2% 明胶) 清洗幻灯片 3x, 每次5分钟。
   6. 在培养培养基 (pbs/2. 0.2% 明胶-Bsa) 中使用抗 gfp-alxaufl647 (1: 100) 和抗 MAP2 (1:1000) 抗体的污渍脑切片, 并在4°c 下孵育。
   7. 收集原代抗体 (可重复使用)。用洗涤缓冲液清洗幻灯片 4倍, 在室温下总共30分钟。
   8. 用山羊荧光素异硫氰酸酯 (FITC) 标记的二级抗体 (1:1000) 在培养培养基中孵育大脑切片, 并在室温下孵育1-2小时。
   9. 用洗涤缓冲液清洗幻灯片 4倍, 在室温下总共30分钟。
   10. 将 4 '、6-二胺-2-苯丁酮 (DAPI) 的安装介质滴在22毫米 x 50 毫米的盖板上, 然后将盖板倒置到幻灯片上, 覆盖所有组织部分。
   11. 显微镜上的图像, 并调整图像的对比度和亮度。捕获图像并量化药物治疗和车辆治疗的 gfp 阳性细胞的数量.

为了证明Mésti:mcgp2-g夫小鼠模型在 xi 再激活研究中的可行性, 在小鼠胚胎成纤维细胞 (mef) 中测试了 xcif 抑制剂介导的西联Mcp-2-gfp 再激活。如第3节 (图 1a) 所述, 从 15.5天开始分离女性 mef: mcp2·xit:mcp2-g夫胚胎。女性水族的基因型: Micp2/xite:mc常见-gfp 多元醇通过基因型 pcr 证实, 如前面所述的 19 (图 1b) 和基于 Fsa 的分析 (图 1B)。用 DMSO 或 ldn19189 和 GSK650394 (分别为0.5ΜM 和 2.5ΜM) 对 Mof 进行了7天的处理。药物治疗后, 用 qRT-PCR 监测Micp2-gfp的表达。如图 1D所示, 药物治疗, 但不是 DMSO, 重新激活表达的西-梅克普2-g夫 p.其次, 进行定量免疫荧光, 以确定在单个多元气体中的西-梅克 P2-gfp 表达的程度, 如步骤5.3.2 所述。以从男性胚胎中分离出的负对照 Mof信号为背景, ~ 66% 的阳性对照 Mep2-gfpmeg2 mdf 有核 gfp 信号. 正如预期的那样, Mcisti:micp2/xit:micp2-gfp处理后, 经 DMSO 处理的核 GFP 水平非常低 (~ 3%)。相比之下 , 约 31% 的药物治疗 : mep2xit : mcep2mef 对核 gfp 呈阳性 (图 1e) 。这些结果表明, XCIF 抑制剂在 Mef 中重新激活了与氧连锁Mcp2的活性, 但在细胞群中, xi 再激活的程度各不相同。

为评价药物学西反应在体内的可行性, 研究药物治疗是否重新激活了西蒂斯特的大脑中的氧连锁Micp2 : micp2/xite:mcip2-g夫 p 雌性小鼠。在4周龄的 xececp2-g解脑注射使用立体定向手术的脑内注射中, 使用10μl 的车辆或10μl 的 xcif 抑制剂 (1.5 mM ldn193189 和 1.6 mm GSK650394) 在大脑对半球进行注射。图 2 a, B)。这个过程每两天重复一次 (图 2c), 三个星期后, 动物被安乐死, 大脑被隔离。一个子集用于 qRT-PCR, 另一个子集采用免疫组织化学方法进行分析。利用 qRT-PCR (表 1所列引物序列) 测定了野生型metp2和 xi-metp2-g夫普在汽车和药物注入半球中的表达。如图2D 所示, 药物治疗在大约30% 的药物注入大脑半球细胞中重新激活了 Xe-metp2-g夫 p, 而在注入药物的半球没有发现 Xi-metp2-g峰. 大量的 MAP2 (神经元标记) 阳性神经元也呈 GFP 阳性 (~ 45%)在药物治疗半球, 表明西-梅格普2-gfp 的表达。约20% 的 MAP2 阴性脑细胞表达了 GFP, 证实了Xi-mcp2-gfp在非神经元细胞中的再激活 (图 2e)。

图 1: 生成和验证Xe-mcp2鼠标模型。(A) 生成xisti:mcp2·xite:micp2-gfp小鼠的繁殖策略示意图。(B) 对xist:mcp2-Gfpy、xisti:me/exit:me/exist:me/xis:me/gepy:me/g夫普小鼠的 pcr 基因分型. 对小鼠的 Mcp2-gfp、 micp2和性别决定区 y (sry) 的存在进行了监测。(C) 流式细胞仪分析从小鼠皮层分离的细胞核。Mcmp2-g夫p 小鼠皮层显示 ~ 50% 的 gfp 阳性核, 而micp2·gfp 则显示为无 gfp 阳性核。(D) Qrt-pcr 分析监测micp2-gfp和野生型Micp2转录物在女性xisti:micp2™: micp2-gfp mef 治疗后使用 DMSO 或药物 (LDN1918189 和 gsk650394)。Gapdh作为负载控制进行了监测。(E) 定量免疫荧光监测 gfp 强度在女性中的 gfp 强度: Micp2is:metp2-gfp MEF 在使用 DMSO 或 LDN193189 和 gsk650394 药物治疗后。分别用从 micp应从或me/mcp2/gfp小鼠身上分离的 mof 作为阴性和阳性对照。每个点表示一个 MEF, 虚线表示在Mecpma/y中获得的最大背景信号, 该信号设置为1。下面的面板显示了代表性的原子核图片。这一数字已从 Przanowski 等人等人的第16份报告中修改。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 在活着的小鼠的脑皮质神经元中 x-连锁Micp2的药理再激活.(A) 显示在大脑左半球或右半球注射车辆或药物的部位的老鼠头骨和 (b) 大脑示意图。(C) 药物治疗方案示意图。(D) 具有代表性的免疫荧光图像, 显示来自车辆或药物处理半球的日冕脑切片中的内源性 gfp 信号 (绿色)。DAPI 染色显示为蓝色。(E) 典型的免疫荧光图像, 用于监测药物治疗半球 gfp (抗 gfp; 红色) 和 map2 (绿色) 表达的冠状脑切片。DAPI 染色显示为蓝色。这一数字已从 Przanowski 等人等人的第16份报告中修改。请点击这里查看此图的较大版本.

表 1: 用于基因分型和定量实时 RT-PCR 的引物清单。

作者没有什么可透露的。