本文介绍了一种建立具有非随机X染色体失活的可存活雌性小鼠模型的方案，即在100%的细胞中母源遗传的X染色体处于失活状态。我们还介绍了一种在体内检测药物诱导失活X染色体重新激活的可行性、耐受性和安全性的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
X染色体失活（XCI）是指雌性个体中一条X染色体随机沉默，以实现两性之间的基因剂量平衡。因此，所有雌性个体在X连锁基因表达上均为杂合状态。XCI的关键调控因子之一是Xist，它对XCI的启动和维持至关重要。先前的研究通过大规模的功能缺失遗传筛选，已鉴定出13种反式作用的X染色体失活因子（XCIFs）。使用短发夹RNA或小分子抑制剂抑制XCIFs（如ACVR1和PDPK1）可在培养细胞中重新激活X染色体连锁基因。然而，在活体动物中重新激活失活X染色体的可行性和耐受性仍有待确定。为实现这一目标，研究人员构建了一种XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠模型，该模型由于其中一条X染色体上的Xist被删除，导致X染色体失活不再随机。利用该模型，可在小鼠大脑中定量评估XCIF抑制剂处理后失活X染色体再激活的程度。最近发表的研究结果首次表明，通过药物抑制XCIFs可在活体小鼠大脑的皮层神经元中重新激活失活X染色体上的Mecp2基因。
引言
X染色体失活（XCI）是一种剂量补偿过程，通过沉默雌性个体中的一条X染色体来平衡X连锁基因的表达1。因此，失活的X染色体（Xi）会积累异染色质的特征性修饰，包括DNA甲基化以及抑制性的组蛋白修饰，例如组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）和组蛋白H2A泛素化（H2Aub）2。X染色体沉默的主要调控区域是X失活中心（Xic），该区域大小约为100−500 kb，负责X染色体的数量感知与配对、随机选择其中一条X染色体进行失活，并启动和传播染色体上的沉默信号3。X染色体失活过程由X失活特异性转录本（Xist）启动，Xist以顺式（cis）方式包被Xi，介导全染色体范围的基因沉默，并重塑X染色体的三维结构4。近年来，多项蛋白质组学和遗传学筛选研究已鉴定出更多参与XCI调控的因子，例如与Xist相互作用的蛋白质5,6,7,8,9,
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方案
涉及小鼠的实验已获得弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC；#4112）的批准。
1. 构建一种具有基因标记的Xi上Mecp2的非随机X染色体失活小鼠模型
注意：本研究中使用的小鼠品系如下：Mecp2-Gfp/Mecp2-Gfp（Mecp2tm3.1Bird，材料表）和 Xist/ΔXist（B6;129-Xist<tm5Sado>；由西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心的Antonio Bedalov提供）。已针对各品系设计了相应的繁殖策略，以扩增每种品系的小鼠群体。
- 使用 表1 中列出的基因特异性引物，对所有小鼠品系及其繁殖后获得的后代进行PCR基因分型。
2. 设计小鼠繁殖策略以生成 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp
- 将一只 Mecp2-Gfp/Y 雄性小鼠与一只 XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 雌性小鼠共同饲养（12 小时光照 / 12 小时黑暗循环），建立繁殖配对（图 1....
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结果
为了验证 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp 小鼠模型在X染色体失活（Xi）再激活研究中的可行性，我们在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中测试了XCIF抑制剂介导的Xi连锁 Mecp2-Gfp 的再激活。如第3节所述，从第15.5天的 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp 胚胎中分离得到雌性MEFs（图1A）。通过基因型PCR（如前所述19）（图1B）以及基于FACS的检测方法（图1C）确认了雌性 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp MEFs的基因型。MEFs分别用DMSO或两种药物LDN193189和GSK650394（浓度分别为0.5 μM和2.5 μM）处理7天。药物处理后，通过qRT-PCR检测 Mecp2-Gfp 的表达水平。如
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讨论
此前，已鉴定出在哺乳动物雌性细胞中选择性沉默X染色体连锁基因所必需的XCIFs12。我们进一步优化了靶向XCIFs（如ACVR1）以及PDPK1下游效应分子的高效小分子抑制剂，这些抑制剂可在小鼠成纤维细胞系、小鼠皮层神经元以及源自Rett综合征（RTT）患者的成纤维细胞系中有效重新激活X染色体连锁的Mecp2基因。这些结果表明，X染色体再激活是一种有望用于挽救X染色体连锁疾病患者基因缺陷的治疗策略；然而，其在体内的可行性仍有待验证。最近研究表明，XCIF抑制剂可在体内重新激活X染色体连锁的Mecp2基因，为此研究构建了一种非随机的XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠模型。
该方法的一个诱人特点 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp 该模型的优势在于能够对X染色体失活连锁的基因进行精确定量 Mecp2 由于缺失了多个原因，导致重新激活 Xist 在母源X染色体上， XistΔ:Mecp2.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Antonio Bedalov提供试剂；感谢弗吉尼亚大学组织病理学核心实验室提供冷冻切片服务；感谢弗吉尼亚大学流式细胞术核心实验室提供流式细胞术分析；感谢Christian Blue和Saloni Singh在基因分型方面的技术协助。本研究工作得到了Z.Z.获得的Double Hoo研究资助，以及S.B.获得的弗吉尼亚大学-弗吉尼亚理工大学种子基金奖的试点项目计划奖和哈特韦尔基金会个体生物医学研究奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠 | |||
| Mecp2tm3.1Bird | 杰克逊实验室 | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | 由西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心 Antonio Bedalov 提供 | ||
| 试剂 | |||
| 22×22 mm 盖玻片 | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% 多聚甲醛 | 电子显微镜科学公司 | 15714-S | |
| 50 ml 注射器 | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60 mm 培养皿 | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| 氯化铵 (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| 抗-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| 抗-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Promega | R396D | |
| 缓释型布托啡诺 | Zoopharm | ||
| 柠檬酸 | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| 杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| 乙醇 | Decon Labs | 2701 | |
| 胎牛血清 (FBS) | VWR 生命科学 | 89510-198 | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| 载玻片 | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| 山羊抗鸡 IgG FITC 标记二抗 | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| Hamilton 10μl 注射器 | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| 汉克平衡盐溶液 (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| 氯胺酮 | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| 大型钝头/钝头弯剪刀 | 精细科学工具公司 | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| 碘克沙醇 | Sigma | 1343517 | |
| 氯化镁 (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| 甲基纤维素 | Sigma | M0262-100G | |
| 含 DAPI 的封片剂 | Vectashield | H-1200 | |
| 针头，26 号 × 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| 眼科软膏 | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| 最佳切割温度 (O.C.T.) 包埋剂 | ThermoFisher | ||
| PCR 混合液 | |||
| 青霉素/链霉素 (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| 磷酸盐缓冲液 pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| 氯化钾 (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| 手术刀片 | |||
| 浅玻璃或塑料托盘 | |||
| 皮肤胶/组织粘合剂 | 3M Vetbond | 1469SB | |
| 叠氮化钠 | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| 氯化钠 (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| 标准止血钳 | 精细科学工具公司 | 13013-14 | |
| 标准镊子 | 精细科学工具公司 | 11027-12 | |
| 直剪虹膜剪 | 精细科学工具公司 | 14058-11 | |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris 碱 | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 赛拉嗪 | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| 设备 | |||
| 蔡司 AxioObserver 活细胞显微镜 | 蔡司 | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45 mm 钻头 | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| 离心机 | |||
| 玻璃匀浆器 | |||
| 细胞培养孵育箱 | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S 研究型冷冻切片机 | |||
| 立体定位平台 | |||
| 热循环仪 | |||
| 计时器 | |||
| 超速离心机 | 贝克曼 Coulter Optima L-100 XP | ||
| 水浴锅 (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
参考文献
- Lyon, M. F. X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).
- Heard, E.
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