直接支气管内给药以提高小鼠肺部靶向药物的沉积选择性

摘要

在小鼠中进行实验物质的气管内（IT）给药时，常导致药物在远端肺部的分布不对称。  本报告中，我们描述了一种直接支气管内（IB）给药方法，可在不进行手术的情况下对活体小鼠的每侧肺进行插管。  该方法可用于选择性地向单侧肺给药，也可经调整后用于改善双侧肺的药物对称性分布。

摘要

在博来霉素诱导的肺纤维化等弥漫性肺部疾病的鼠类模型中，经气管内（IT）给予实验试剂是一项关键技术。  然而，经气管给予的药物在小鼠远端肺组织中的分布常呈不对称性，小鼠较小但通路同样通畅的左肺肺实质药物浓度较高。  本报告描述了一种新型的非手术经支气管（IB）方法，用于对活体小鼠的左肺和/或右肺进行插管。  还展示了如何利用该方法选择性地向单侧肺给药，或进行调整（通过 剂量调整的支气管内给药（dose-adjusted IB delivery），以改善实验性药物在双肺左右分布的对称性，从而优化弥漫性肺部疾病模型，如博来霉素诱导的肺纤维化模型。

引言

在小鼠中直接向肺部给药实验试剂可用于研究肺部免疫反应、急性肺损伤以及肺纤维化。直接肺部给药通常通过以下方式实施 通过 经气管（IT）滴注，如先前所述^1,2,3然而，这种方法缺乏选择性，会以非靶向且通常不对称的方式影响双侧肺部。  选择性地靶向单侧肺脏对肺损伤的实验建模具有重要意义，可利用对侧肺作为自身对照。相反，为准确模拟人类弥漫性肺部疾病，需将实验干预因素对称地分布至双侧肺实质。

本报告的总体目标是描述一种将实验试剂选择性递送至小鼠左肺或右肺的方法（图1）。这种经支气管（IB）给药方法可实现小鼠肺部的单侧处理，并可轻松调整以确保实验试剂等量递送至双侧主支气管。通过采用经支气管给药方式，向体积较大的右肺递送较大剂量的实验试剂，同时向体积较小的左肺递送较小体积的试剂（即剂量调整的IB给药），本报告展示了该方法可提高实验试剂在肺部递送的均一性，从而优化小鼠弥漫性肺损伤模型。因此，本报告对于希望在小鼠中实现单侧给药或改善双肺药物沉积对称性的研究人员具有参考价值。

方案

所有动物实验方案均已获得科罗拉多大学丹佛分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。下文所述的所有操作步骤（第4–7节）均使用雄性和雌性C57BL/6小鼠进行优化。该方法已通过体重范围为19–40 g的小鼠验证。

1. 建立IB给药平台

1. 将书挡从基底翼与直立翼之间原有的90°角弯曲至70°（图2A）。
2. 在金属书挡直立翼的顶部中央钻一个孔（图2A）。
3. 在塑料板相应位置钻一个尺寸相同的孔，并在其下方和外侧钻两个较小的孔（图2A）。
4. 将一根4-0丝线穿过塑料板上的这两个小孔并悬挂（图2A）。
5. 将钩面与毛面胶带贴在塑料板的边缘（图2A）。
6. 用螺丝将塑料板组装到金属书挡上（图2B）。确保螺母足够紧固，以固定塑料板位置，同时必要时仍可调节角度。
7. 确保塑料板可顺时针和逆时针自由旋转。
   注：本报告中，顺时针运动表示为（+）度旋转，逆时针运动表示为（-）度旋转。
8. 使用量角器将塑料板分别置于+30°、+86°、-30°和-74°位置，并在书挡上标记这些角度。

2. 用于IB制剂给药的延长导管的制备

1. 使用锋利的刀片在原始22 G导管（25 mm，参见材料表）的尖端处做一垂直切割（图3，步骤1a）。
2. 用刀片将另一根原始导管（25 mm）的尖端削成斜面（~50°–60°），然后从导管接头处垂直切断（图3，步骤1b）。
3. 将两根导管的钝端以略小于180°的角度用胶水粘合（图3，步骤2）。
4. 使用低温电灼装置熔化斜面尖端，使其变钝（参见材料表）。
5. 使用“0”号砂纸对延长导管的粘合部位及斜面尖端进行打磨抛光（图3，步骤3）。
6. 在延长导管上分别于25 mm、30 mm和35 mm处用不同颜色做标记（图3，步骤3）。
7. 用记号笔在导管接头上标注斜面所在的一侧，以指示延长导管的斜面方向。
8. 先用去离子水冲洗延长导管，再用70%乙醇冲洗导管内部，然后将导管自然晾干。
9. 使用前用紫外光照射灭菌10分钟。

3. 术前准备

1. 在生物安全柜内，采用无菌技术配制所有给药试剂。
2. 使用70%乙醇清洁工作区域。
3. 使用70%乙醇对所有手术器械进行灭菌。
4. 通过将C型夹固定在书挡的基底翼上，将工作平台的底座固定在研究人员正前方的实验台面上。
5. 制备多个临时简易呼吸测量装置（即呼吸计），该装置可用于检测小鼠的潮气气流。简要步骤如下：将60 µL无菌生理盐水通过凝胶加样枪头加入一个1 mL注射器内（活塞已移除）。
   注意：滴入的生理盐水液滴会封闭注射器管腔，并在受到潮气通气作用时上下移动³。
6. 将一根22 G延长导管的接头端松松地连接到临时呼吸计上。
7. 将每个玻璃滴管放置在平台两侧，以便于取用。
8. 在兼容异氟烷的生物安全柜内，将异氟烷诱导室连接至啮齿类动物麻醉机（参见材料表）。

4. 非手术IT插管方法

1. 用氧气（2 L/min）和 5% 异氟烷麻醉一只 C57BL/6 小鼠（雄性或雌性，8–10 周龄，约 25 g）（参见 材料清单在诱导室中放置 4 分钟。
2. 吸除待递送的实验试剂（例如伊文思蓝染料或FITC-葡聚糖，如文中所示） 图4将两支移液管分别置于平台两侧，于镇静过程中使用。
3. 在将小鼠移出麻醉诱导舱之前，确保其呼吸频率约为24–30次/分钟。
   注意：异氟烷麻醉通常持续 4 分钟，足以完成所有 IB 操作。若操作者对该技术尚不熟练，可使用氯胺酮/赛拉嗪（80 mg/kg 和 10 mg/kg，腹腔注射，参见 材料表)可用于更长时间的麻醉。
4. 将小鼠仰卧位悬挂于缝合线上，使其门齿钩住缝合线。使用两到三段魔术贴松散固定小鼠，避免限制其呼吸。
5. 打开LED光纤照明器（参见 材料表, 图2C).
6. 将操作者置于平台后方（小鼠背侧）。
7. 调整照明灯的鹅颈管，使其透过皮肤照亮喉部区域。小鼠与光源之间的距离为2–3 cm（图2C).
8. 在进行以下所有操作前，通过捏压脚趾/足掌确认麻醉深度。
9. 用惯用手持无菌镊子，然后用镊子将舌头从口腔中拉出。
10. 用非惯用手持无菌压舌板，将舌根压平以充分暴露口咽部。随后可松开镊子，释放惯用手。
11. 用惯用手将延长的导管插入气管 通过 口腔图2C).
12. 通过观察注射器中的气泡是否随每次呼吸上下移动，确认位置是否正确。
13. IT插管的更多细节此前已有发表³整个操作过程耗时（不含麻醉时间）在操作熟练者手中为10–15秒。

5. 非手术性IB插管与分娩方法

1. 远端右肺叶选择性插管的IB方法
   1. 完成气管内插管（步骤4.11）后，将塑料板向+30°方向旋转（图4A）。
   2. 握住导管的接头部分，使其自然平行于小鼠身体中线推进，并根据体重推进至相应深度，具体深度参见表1。
      注：应记录在此深度时遇到的阻力。此时小鼠会出现轻度呼吸急促，详见代表性结果部分。对于经验丰富的操作者，约90%的操作可成功插管至右肺（并观察到呼吸急促）。
   3. 使用凝胶上样枪头注入20 µL的0.3%伊文思蓝染料（EBD，参见材料表）。
   4. 使用玻璃滴管排出1–2份空气（每份0.1 mL）。
      注：此举可确保清除导管内部残留的EBD溶液（或实验试剂）。
   5. 撤出导管，随后保持小鼠体位30秒。
   6. 将动物置于加热毯上，直至其恢复意识。通常在2分钟内完成恢复。
2. 远端左肺段选择性插管的IB方法
   1. 完成气管内插管（步骤4.11）后，将塑料板向-74°方向旋转（图4B）。
   2. 握住导管接头，施加轻柔压力将导管推进至左主支气管，同时适度向下（90°）并向书挡方向施加压力。当导管达到表1所列深度时，操作者应感受到阻力，表明已进入左肺下部肺段。若出现呼吸急促，应将导管回撤至20–25 mm位置，并重新尝试。
   3. 完成左肺下段插管后，需调整体位以利用重力辅助试剂输送。将塑料板向-30°方向旋转（图4B）。
   4. 使用凝胶上样枪头向左肺注入40 µL的0.3%伊文思蓝染料（EBD）。
      注：由于左肺仅有一个肺叶，因此可输送较大体积的试剂。
   5. 使用玻璃滴管排出1–2份空气（每份0.1–0.3 mL）。
      注：此举可确保清除导管内残留的任何EBD（或实验试剂）。
   6. 撤出导管，随后保持小鼠体位30秒。
   7. 将动物置于加热毯上，直至其恢复意识。通常在2分钟内完成恢复。
3. IB给药方式的改进：实现左肺或右肺整体给药
   注：若操作者希望将试剂输送至整个左肺或右肺，而非特定肺叶或肺段，则应将导管轻微回撤至相应的主支气管，具体操作如下。
   1. 右肺整体给药
      1. 完成步骤4.11后，将塑料板向+30°方向旋转（图5A）。
      2. 握住导管接头，使其自然平行于小鼠身体中线推进，达到右肺远端肺叶插管所需的深度（参见表1）。
      3. 确认出现呼吸急促的体征。
      4. 将小鼠向-74°方向旋转，以利用重力辅助试剂输送（图5B）。
      5. 将导管回撤至右主支气管起始处对应的位置（参见表1），并确保导管斜面朝下（图5B）。
      6. 使用凝胶上样枪头向右肺注入30 µL的0.3%伊文思蓝染料（EBD）。
      7. 使用玻璃滴管排出1–2份空气（每份0.1–0.3 mL）。
      8. 撤出导管，随后保持小鼠体位30秒。将动物置于加热毯上，直至其恢复意识。通常在2分钟内完成恢复。
   2. 左肺整体给药
      1. 完成步骤4.11后，将塑料板向-74°方向旋转（图6A）。或者，也可在步骤5.3.1.8完成后，将导管回撤至气管后再进行旋转，从而实现双侧IB试剂给药。
      2. 握住导管接头，施加轻柔压力将导管推进至左主支气管，同时适度向下（90°）并向书挡方向施加压力。插管深度依据表1确定。
      3. 确认无呼吸急促体征。
      4. 将小鼠向+86°方向旋转，以利于重力辅助试剂输送。
      5. 将导管回撤至左主支气管（与右肺相同的距离即可，参见表1），并旋转导管使其斜面朝下（图6B）。
      6. 使用凝胶上样枪头向左肺注入30 µL的0.3%伊文思蓝染料（EBD）。
      7. 使用玻璃滴管排出1–2份空气（每份0.1–0.3 mL）。
      8. 撤出导管，随后保持小鼠体位30秒。将动物置于加热毯上，直至其恢复意识。通常在2分钟内完成恢复。

6. 使用序贯性支气管内导管插管技术向每侧肺输送剂量调整体积的药物

1. IT administration group
   1. 按照步骤 4.1–4.11 所述进行 IT 插管。
   2. 使用加样枪头递送 60 µL 的 0.05% FITC-葡聚糖（见材料表）（图 1B）。
   3. 使用玻璃滴管分别加入 1–2 份空气（每份 0.1–0.3 mL）。
   4. 保持该体位 60 秒，并按上述方法让小鼠恢复。
2. 对称性双侧 IB 给药
   1. 执行步骤 5.3.1.1–5.3.1.8（右肺）和步骤 5.3.2.1–5.3.2.8（左肺）。
   2. 向肺部两侧分别给予等体积（30 µL）的 0.05% FITC-葡聚糖（或实验试剂）。
3. 剂量调整的双侧 IB 给药
   1. 执行步骤 5.3.1.1–5.3.1.8（右肺）和步骤 5.3.2.1–5.3.2.8（左肺）。
   2. 向较大的右肺给予较大体积（40 µL）的 0.05% FITC-葡聚糖，向较小的左肺给予较小体积（20 µL）的 0.05% FITC-葡聚糖。可使用实验试剂替代 FITC-葡聚糖。

7. 使用剂量调整的支气管内给药以改善单次博来霉素（BLM）诱导肺损伤的对称性

1. 博来霉素给药组
   1. 剂量调整的支气管内滴注博来霉素（IB-BLM，1.2 mg/kg，参见材料表）给药组：向小鼠（n = 5）给予60 µL博来霉素溶液（左肺20 µL，右肺40 µL）。对照组（n = 5）给予等体积生理盐水。
      注：参见步骤5.3.1和5.3.2。
   2. 气管内（IT）给药组：采用气管内给药技术向小鼠给予60 µL博来霉素溶液。
      注：参见步骤6.1.1–6.1.4。
2. 肺功能测定
   1. 在博来霉素或生理盐水处理后第21天，通过腹腔注射（IP）给予氯胺酮（160 mg/kg）和赛拉嗪（32 mg/kg）麻醉小鼠。
   2. 通过足掌/脚趾夹捏确认麻醉深度后，使用18 G套管（参见材料表）进行气管切开术。
   3. 将小鼠连接至呼吸机，并按照先前描述的方法测量呼吸力学参数⁴。
3. 肺组织采集与处理
   1. 在完成肺力学参数测量后，通过心脏穿刺处死麻醉状态的小鼠。
   2. 打开胸壁，诱导双侧气胸。
   3. 在恒定压力（42 cm H₂O）下，用PBS配制的1%低熔点琼脂糖（40 °C）⁵灌注肺部。
   4. 沿长轴横向切取4至5块肺组织，用10%福尔马林固定后进行石蜡包埋。
   5. 切取5 µm厚切片，并用Masson三色染色法染色以观察胶原沉积情况。

8 术后护理

1. 生存手术结束时，将动物置于加热毯上，直至其恢复意识。通常在2分钟内完成恢复。

结果

选择性支气管插管可针对特定肺叶（右肺）或基底段（左肺）。

按照5.1节所述方法对右肺进行EBD的支气管内给药。实验结束后，小鼠接受腹腔注射致死剂量的氯胺酮/赛拉嗪，随后取出肺组织以展示EBD的分布情况（图4A，右）。肺的大体外观显示，90%的实验成功插管至右肺的小后叶，而10%的实验插管至下叶。推测由于这些肺叶体积较小，因此在远端插管期间小鼠出现代偿性呼吸急促（以通过导管维持每分钟通气量）。

按照第5.2节所述方法，将EBD注入左侧支气管。100%的操作均成功靶向左侧肺的下部肺段（图4B）。与右侧插管相比，此操作未引起呼吸急促，表明已成功对容积较大的左侧肺段进行插管和通气。

...

讨论

肺损伤的经典动物模型通常通过气管内（IT）给予损伤性试剂（如博来霉素，BLM⁶）在啮齿类动物中建立。然而，这种气管内给药方式仅导致散在分布的损伤，反映出该方法在肺部递送过程中缺乏靶向性⁷。这些在建立肺损伤模型时存在的局限性，也为尝试通过气管内途径递送非损伤性实验试剂（如药物、siRNA 或细胞治疗制剂）时所面临的技术挑战提供了重要参考。

在本报告中，我们描述了实验性药物的直接支气管内给药方法。该方法相较于传统的气管内给药具有两个明显优势。首先，该方法可实现单侧肺的特异性单侧给药，从而保护对侧肺组织。这一方法适用于向单侧受损肺（例如缺血-再灌注损伤⁸）选择性地给予药物，避免在未受损肺中产生非特异性效应。此外，通过定向给药肿瘤细胞，可有效区分原发性肿瘤生长与对侧的转移性扩散^9,10。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
22 G 带护套静脉导管	BD	381423
博来霉素	Enzo life sciences	BML-AP302-0010
Compact Mini 小型啮齿类动物麻醉机	DRE Veterinary	9280
伊文思蓝染料	Sigma-Aldrich	E2129
异硫氰酸荧光素-葡聚糖	Sigma-Aldrich	FD150
异氟烷	Piramal Critical Care	NDC
LED-30W 光纤双臂显微镜照明灯	AmScope	LED-30W
低温电凝器（细尖头）	Bovie	AA02
Precisionglide 针头，18G × 1"	BD	305195	斜面针尖，长度 12 mm
赛拉嗪	AKORN	NDC 59399-110-20
Zatamine	VetOne	NDC 13985-702-10	氯胺酮