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方法文章

通过瞬时抑制Rho激酶活性增强人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的移植存活

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DOI：

10.3791/59452

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2019年7月10日

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1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Cardiovascular Diseases, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Cardiac Surgery, The Second Xiangya Hospital of Central South University

本文内容

摘要

在本方案中，我们演示并详细阐述了如何利用人诱导性多能干细胞进行心肌细胞分化与纯化，以及如何通过Rho相关蛋白激酶抑制剂预处理，在小鼠心肌梗死模型中进一步提高其移植效率。

摘要

提高细胞治疗在心肌再生中有效性的关键因素是安全且高效地提升细胞植入率。Y-27632 是一种高效的选择性 Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶（RhoA/ROCK）抑制剂，可用于防止因细胞解离诱导的细胞凋亡（失巢凋亡）。我们证明，在急性心肌梗死（MI）小鼠模型中，移植前对人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs+RI）进行 Y-27632 预处理，可显著提高细胞的植入率。本文详细描述了 hiPSC-CMs 的分化、纯化及 Y-27632 预处理的完整操作流程，以及后续的细胞收缩功能检测、钙瞬变测量和向小鼠 MI 模型的细胞移植步骤。该方法提供了一种简便、安全、有效且低成本的技术方案，可显著提升细胞植入率。该方法不仅可与其他技术联合使用以进一步提高细胞移植效率，也为其他心脏疾病机制的研究提供了有利基础。

引言

基于干细胞的疗法在治疗由心肌梗死（MI）引起的心脏损伤方面已显示出相当大的潜力1。利用已分化的hiPSC可提供无限来源的hiPSC-CM2，并为突破性治疗方法的快速开发开辟了道路。然而，该疗法在转化应用方面仍存在诸多局限，包括移植细胞的极低定植率这一挑战。

使用胰蛋白酶消化细胞会启动失巢凋亡3，当这些细胞被注射到缺血心肌等恶劣环境时，缺氧环境会进一步加速细胞走向死亡的过程。在剩余的细胞中，很大一部分会从移植部位被冲刷进入血液循环，并扩散至外周组织。其中一条关键的凋亡通路是 RhoA/ROCK 通路4。根据既往研究，RhoA/ROCK 通路可调控肌动蛋白细胞骨架的组装5,6，而后者与细胞功能障碍密切相关7,8。ROCK 抑制剂 Y-27632 在体细胞和干细胞的消化与传代过程中被广泛应用，以增强细胞黏附并减少细胞凋亡9,10,11。本研究中，Y-27632 被用于移植前处理 hiPSC-CMs，旨在提高细胞的移植存活率。

已有多种旨在提高细胞移植率的方法被建立，例如热激处理和基底膜基质包被12。除这些方法外，基因技术也可促进心肌细胞增殖13，或将非心肌细胞重编程为心肌细胞14。从生物工程的角度来看，可将心肌细胞接种于生物材料支架上以提高移植效率15。然而，大多数此类方法操作复杂且成本较高。相比之下，本文提出的方法简便、经济且有效，既可作为移植前的基础处理手段，也可与其他技术联合使用。

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方案

本研究中的所有动物实验程序均经阿拉巴马大学伯明翰分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循美国国立卫生研究院实验室动物照护与使用指南（NIH出版物第85-23号）。

1. 培养基和培养板的制备

  1. 培养基制备
    1. 对于hiPSC培养基，将400 mL人多能干细胞（hPSC）基础培养基（材料表1）与100 mL hPSC 5倍补充剂混合；于4 °C保存。
    2. 对于RPMI 1640/B27不含胰岛素（RB-）培养基，将500 mL RPMI 1640与10 mL不含胰岛素的B27补充剂混合。
    3. 对于RPMI 1640/B27（RB+）培养基，将500 mL RPMI 1640、10 mL B27补充剂和5 mL青霉素-链霉素（pen-strep）抗生素混合。
    4. 对于纯化培养基16，将500 mL无葡萄糖RPMI 1640、10 mL B27补充剂、5 mL pen-strep抗生素和1,000 μL DL-乳酸钠溶液（终浓度为4 mM）混合。
    5. 对于中和溶液，将200 mL RPMI 1640、50 mL胎牛血清（FBS）、2.5 mL pen-strep抗生素和50 μL Y-27632（终浓度为10 μM）混合。
    6. 对于冻存培养基，将9 mL FBS、1 mL二甲基亚砜（DMSO）和10 μL Y-27632（终浓度为10 μM）混合。
    7. 对于细胞外基质溶液（EMS），在4 °C条件下解冻浓缩的细胞外基质（材料表1），直至其完全变为均匀液体状态。在冰上操作前，预先冷却移液器吸头和离心管，将基质分装为每份350 µL，于-20 °C保存。在包被培养板前，将一份解冻的分装物溶于24 mL预冷的DMEM/F12培养基中（EMS）；EMS可在4 °C保存最多2周。
      注意：所有包被步骤均需在冰上进行，以防止基底膜基质凝固。
    8. 对于Tyrode溶液，取所需终体积90%的组织培养级水，加入适量以下试剂，并搅拌至完全溶解。然后用1 N NaOH调节pH至7.4。加水至终浓度为140 mmol/L氯化钠、1 mmol/L氯化镁、10 mmol/L HEPES、5 mmol/L氯化钾、10 mmol/L葡萄糖和1.8 mmol/L氯化钙。使用0.22 µm滤膜过滤除菌。
  2. 细胞培养板包被
    1. 对于hiPSC培养板，向6孔板的每孔加入1 mL EMS，在37 °C孵育至少1小时。接种细胞前吸除DMEM/F12溶液。
    2. 对于明胶包被，将0.2 g明胶粉末溶于组织培养级水中，配制成0.2%（w/v）溶液。在121 °C、15 psi条件下高压灭菌30分钟。每孔加入2 mL该溶液包被6孔板，在37 °C孵育1小时。传代细胞前，吸除溶液，并在组织培养超净台内室温干燥至少1小时。

2. hiPSC 的维持与心肌细胞分化

  1. 将hiPSCs在hiPSC培养基（见步骤1.1.1）中培养，每天更换培养基，直至每个孔的细胞汇合度达到80%–90%。
    注意：为维持培养，hiPSCs通常每4天左右可传代一次。
  2. 传代hiPSCs时，吸除培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤孔内细胞1次。每孔加入0.5 mL干细胞解离溶液（材料表1），于37 °C孵育5–7分钟。
    注意：孵育时间取决于细胞密度和解离速度，可在显微镜下观察判断。
  3. 用1 mL添加了5 μM Y-27632的hiPSC培养基中和干细胞解离溶液。将混合液收集至15 mL离心管中，以200 × g离心5分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，然后将细胞重悬于1 mL含5 μM Y-27632的hiPSC培养基中。
  4. 按1:6至1:18的比例，将hiPSCs接种至新的EMS包被的6孔板中。24小时后更换为不含Y27632的hiPSC培养基。
  5. 冻存细胞时，将解离后的hiPSCs重悬于冻存液中，浓度为每500 μL含0.5–1×10⁶个细胞，将细胞悬液分装至冻存管中，置于-80 °C冰箱中保存。24小时后转移至液氮中长期保存。
  6. 诱导分化时，在细胞汇合度达80%–90%时，将hiPSC培养基更换为2 mL添加10 μM GSK-3β抑制剂CHIR99021（CHIR）的RB-培养基。24小时后更换为3 mL RB-培养基，继续孵育48小时（第3天）。
  7. 第3天，更换为含10 μM Wnt抑制剂IWR1的3 mL RB-培养基，作用48小时（至第5天），随后更换为3 mL RB-培养基，继续维持培养48小时（至第7天）。
  8. 第7天，将培养基更换为3 mL RB培养基，并自此每3天更换一次培养基。hiPSC-CMs的自发性搏动通常在第7至10天之间出现。

3. hiPSC-CMs 的纯化与小分子预处理

注意：采用高纯度的重组细胞解离酶（材料表 1）对人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）进行解离。

  1. 在hiPSC-CM分化后的第21天，吸除培养基，并用无菌PBS洗涤细胞1次。每孔加入0.5 mL细胞解离酶，在37 °C孵育5–7分钟。使用1 mL移液器反复吹打细胞悬液，以充分解离细胞。
  2. 细胞解离后，每孔加入1 mL中和液，将细胞混合物收集至15 mL离心管中，在200 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，用中和液重悬细胞。
  3. 以每孔200万个细胞的密度，将细胞重新接种至明胶包被的6孔板中。
  4. 24–48小时后，将培养基更换为纯化培养基，持续培养3–5天。
    注意：当显微镜下每个视野中超过90%的细胞出现搏动时，表明纯化完成。为避免对心肌细胞造成进一步损伤，纯化时间不应超过5天。若第一轮纯化未达到所需纯度，可先用RB+培养基培养1天，再进行第二轮纯化。
  5. 移植前，将处理组细胞在添加了10 μM Y-27632的RB+培养基中培养12小时。同样，将另一组细胞在含1 μM维拉帕米的RB+培养基中处理12小时（hiPSC-CMs+VER）。
  6. 处理结束后，用PBS洗涤hiPSC-CMs 1次，每孔加入0.5 mL细胞解离酶，孵育时间最多不超过2分钟。使用1 mL移液器反复吹打细胞悬液，以充分解离细胞。用中和液中和细胞，将细胞混合物收集至15 mL离心管中，在200 × g条件下离心3分钟。用PBS重悬细胞，调整细胞浓度至0.1百万个细胞/5 μL，以备注射使用。

4. 心肌梗死与细胞移植

注意：所有手术器械均经高压灭菌器预灭菌，并在多次手术过程中通过热珠灭菌器（材料表 2）保持无菌状态。

  1. 使用吸入式异氟烷（1.5%–2%）对 NOD/scid 小鼠（材料表 2）进行麻醉。通过脚趾夹捏反应监测麻醉深度。在小鼠眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止手术期间角膜干燥。
  2. 术前皮下注射 0.1 mg/kg 布托啡诺以进行镇痛管理。
  3. 将小鼠仰卧位固定于加热手术台上，使用脱毛膏去除颈部腹侧及左侧胸部的毛发，暴露皮肤后用 70% 酒精消毒。
  4. 使用手术剪在颈部中央做 0.5 cm 切口，用无菌镊子分离皮下脂肪组织，暴露气管。经口将插管套管插入气管，连接至小型动物呼吸机，并调节通气参数（设定潮气量为 100–150 μL，呼吸频率为 100–150 次/分钟）。
  5. 待小鼠生命体征稳定后，在左侧胸壁皮肤中部做 0.5 cm 切口。用镊子钝性分离肌层，在第五肋间做小切口以暴露胸腔。将牵开器置入切口以打开胸腔，定位左前降支冠状动脉（LAD）。在解剖显微镜下，使用 8-0 不可吸收缝线结扎 LAD。
  6. 心肌梗死（MI）诱导后立即向小鼠心肌内注射 5 μL 的 hiPSC-CMs-RI、hiPSC-CMs+RI、hiPSC-CMs-VER、hiPSC-CMs+VER 或等体积 PBS（每只动物 3 × 105 个细胞，每注射位点 1 × 105 个细胞），分别注射至梗死区域及梗死周围两个区域。
    注意：由于 5 μL 体积极小，直接用注射器吸取难以精确控制。可将无菌培养皿盖翻转，先用移液器将 5 μL 细胞悬液滴加于盖内表面。由于表面张力作用，液滴不会扩散，而是凝聚成小液珠，便于准确吸取并注入小鼠心肌组织。
  7. 用温热的等渗盐水填充胸腔以排除残留空气。依次使用 6-0 可吸收缝线缝合肋骨、肌肉和皮肤。关闭异氟烷麻醉气体供应。术后将动物置于加热垫上，密切观察直至完全清醒。随后将动物转移至清洁笼具中饲养。在动物完全恢复前，不得将其与其他动物合笼。
  8. 术后每隔 12 小时腹腔注射布托啡诺（0.1 mg/kg），连续给药 3 天；每隔 12 小时注射布洛芬（5 mg/kg），持续 1 天。在指定时间点进行后续分析研究。
    注意：镇痛处理应遵循当地动物护理委员会的相关指南。

5. 钙瞬变与收缩性记录

  1. 高压灭菌15 mm直径的盖玻片（材料表 2）和镊子放入小玻璃烧杯中，在121 °C、15 psi条件下灭菌15分钟。将盖玻片和镊子在4 °C预冷。
  2. 使用镊子将盖玻片放入12孔板中，每孔加入300 μL细胞外基质。
    注意： 不要让基质超过盖玻片边缘，以防止基质包被量减少。将12孔板置于37 °C细胞培养孵箱中孵育1 h。
  3. 吸弃已包被明胶的6孔板中含纯化hiPSC-CMs的培养基，用PBS洗涤1次，加入0.5 mL细胞解离酶消化1.5 min。加入1 mL中和液，用1 mL移液器反复吹打不超过5–10次，将混合液于200 × g离心 g 3 分钟。
  4. 吸弃盖玻片上的包被细胞外基质。计数细胞数量，将细胞重悬于中和溶液中，调整浓度为40,000/300 μL，然后向每张盖玻片加入300 μL细胞悬液。将培养板置于37 °C培养箱中培养。
  5. 24小时后，轻轻吸除中和液，每孔加入500 μL RB+培养基，继续培养2天。
  6. 在检测钙瞬变和收缩性前12小时，向hiPSC-CMs的培养基中加入Y-27632（10 μM）、Rho激酶激活剂（RA，100 nM）、维拉帕米（1 μM）或等体积的PBS。
    注意： 除了在化学处理12小时后检测细胞的钙瞬变和收缩性外，还在撤除化学处理后的12、24、48和72小时检测了这些参数。
  7. 取出培养板，弃去培养基，用 PBS 洗涤 1 次。更换为不含酚红的 DMEM 培养基，其中添加 0.02%（w/v）表面活性剂聚醇（材料表 1），5 μM 钙离子指示剂（材料表 1），并分别加入相应体积的 Y-27632（10 μM）、RA（100 nM）、维拉帕米（1 μM）或等体积 PBS，37 °C 孵育 30 分钟。
  8. 弃去上清液，用不含染料的DMEM培养基洗涤细胞3次，然后静置培养基30分钟，使示踪染料去酯化。
  9. 将接种细胞的盖玻片置于开放式浴槽室中，并将该室放入已通过自动温度控制器平衡至 37 °C 的微孵育系统内材料表 2），用台氏液灌注，并持续向灌注液中加入Rho激酶抑制剂（RI）、RA或PBS。
  10. 使用倒置荧光显微镜（材料表 2）和一个激光扫描头（材料表 2) 采用x-t线扫描模式记录自发性钙瞬变，使用488 nm氩离子激光器激发荧光染料，并通过515 ± 10 nm带通滤光片收集发射光。利用共聚焦显微镜的微分干涉差（Differential Interference Contrast）功能记录hiPSC-CMs的自发性收缩。材料表 2).  
    注意： 钙瞬变记录使用 MATLAB R2016A 软件进行处理和分析（材料表 4）。细胞收缩变化检测使用 ImageJ 软件进行材料表 4).

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结果

本研究中使用的hiPSC-CMs来源于人类，并携带荧光素酶报告基因；因此，通过生物发光成像（BLI）17检测移植细胞在体内的存活率（图1A、B）。对于心脏组织切片，人特异性心肌肌钙蛋白T（hcTnT）与人核抗原（HNA）双阳性细胞被定义为成功植入的hiPSC-CMs（图1C）。两项结果均表明，Y-27632预处理显著提高了细胞的植入率。与hiPSC-CM-RI组相比，hiPSC-CM+RI组在移植后第3、7和28天的荧光素酶活性大约提高了六倍（图1B）。此外，相对于hiPSC-CM-RI组，hiPSC-CM+RI组中hcTnT/HNA的表达量接近提高了七倍（图1C）。<...

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讨论

本研究的关键步骤包括获取纯化的hiPSC-CMs，通过Y-27632预处理提高hiPSC-CMs的活性，最后将精确数量的hiPSC-CMs移植到小鼠心肌梗死模型中。

本文解决的关键问题首先是优化了无葡萄糖的纯化方法19，并建立了一种新型高效的纯化体系。该体系的操作流程包括使用细胞解离酶、将细胞重植于明胶包被的培养板中、重铺板后在中和培养基中培养24小时，以及尽量缩短移植前的细胞消化时间。上述所有步骤均旨在获得高纯度心肌细胞的同时，确保细胞具有最高的活性。

其次，我们详细阐述了在细胞注射前12小时使用Y-27632对hiPSC-CMs进行预处理。细胞脱离基质引发的失巢凋亡（anoikis）通常由细胞黏附蛋白（如整合素4,20和N-钙黏蛋白21）的改变所诱导，进而激活凋亡通路。我们证明，Y-27632预处理可通过维持整合...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢斯坦福大学的 Joseph C. Wu 博士慷慨提供 Fluc-GFP 载体，以及 Yanwen Liu 博士提供的出色技术协助。本研究由美国国立卫生研究院资助，项目编号为 RO1 HL95077、HL114120、HL131017、HL138023、UO1 HL134764（资助对象：J.Z.），HL121206A1（资助对象：L.Z.），R56 HL142627（资助对象：W.Z.），美国心脏协会科学家发展基金 16SDG30410018，以及阿拉巴马大学伯明翰分校教师发展基金（资助对象：W.Z.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
Accutase（干细胞解离溶液）STEMCELL Technologies#07920
B27 不含胰岛素Fisher ScientificA1895601
B27 补充剂Fisher Scientific17-504-044
CHIR99021Stem Cell Technologies72054
DMEM（1×），高糖，含 HEPES，不含酚红Thermofisher20163029
胎牛血清Atlanta BiologicalsS11150
Fluo-4 AM（钙离子指示剂）Invitrogen/ThermofisherF14201
无葡萄糖 RPMI 1640Fisher Scientific11879020
IWR1Stem Cell Technologies72562
Matrigel（细胞外基质）Fisher ScientificCB-40230C
mTeSR（人多能干细胞培养基）STEMCELL Technologies85850
青霉素-链霉素抗生素Fisher Scientific15-140-122
Pluronic F-127（表面活性多元醇）Sigma-AldrichP2443
Rho 激活剂 IICytoskeletonCN03
RPMI1640Fisher Scientific11875119
DL-乳酸钠Sigma-AldrichL4263
TrypLE（细胞解离酶）Fisher Scientific12-605-010
维拉帕米Sigma-AldrichV4629
Y-27632STEMCELL Technologies72304
名称公司货号备注
仪器与耗材
IVIS Lumina III 生物发光成像仪PerkinElmerCLS136334
15 mm 盖玻片WarnerCS-15R15
离心机Eppendorf5415R
共聚焦显微镜OlympusIX81
冷冻切片机Thermo ScientificNX50
双通道自动温度控制器Warner InstrumentsTC-344B
电泳电源BIO-RAD1645050
荧光显微镜OlympusIX83
高速相机pco1200 s
激光扫描头OlympusFV-1000
低剖面开放式灌流腔室（安装于上述微孵育系统）Warner InstrumentsRC-42LP
微孵育系统Warner InstrumentsDH-40iL
Minivent 小鼠呼吸机Harvard Apparatus845
NOD/SCID 小鼠Jackson Laboratory001303
预制蛋白凝胶BIO-RAD4561033
PVDF 转膜试剂盒BIO-RAD1704156
Trans-Blot 转膜系统BIO-RADTrans-Blot Turbo
热珠灭菌器Fine Science Tools18000-45
名称公司货号备注
抗体
抗人核仁素（Alexa Fluor 647）Abcamab198580
心肌肌钙蛋白 TR&D SystemsMAB1874
心肌肌钙蛋白 CAbcamab137130
心肌肌钙蛋白 IAbcamab47003
Cy5-驴抗小鼠Jackson ImmunoResearch Laboratory715-175-150
Cy3-驴抗兔Jackson ImmunoResearch Laboratory711-165-152
Fitc-驴抗小鼠Jackson ImmunoResearch Laboratory715-095-150
GAPDHAbcamab22555
人源心肌肌钙蛋白 TAbcamab91605
整合素 β1Abcamab24693
Ki67EMD Milliporeab9260
N-钙黏蛋白Abcamab18203
磷酸化肌球蛋白轻链 2Cell Signaling Technology3671s
名称公司货号备注
软件
MatlabMathWorksR2016A
ImageJNIH1.52g

参考文献

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Rho 激酶抑制Y-27632 预处理细胞移植率心肌梗死模型细胞解离酶钙瞬变检测共聚焦显微镜蛋白质印迹分析荧光素酶活性检测
通过瞬时抑制Rho激酶活性增强人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的移植存活
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