方法文章

通过瞬时抑制Rho激酶活性增强人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的移植存活

DOI：

10.3791/59452

⸱

2019年7月10日

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1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Cardiovascular Diseases, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Cardiac Surgery, The Second Xiangya Hospital of Central South University

本文内容

摘要

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在本方案中，我们演示并详细阐述了如何利用人诱导性多能干细胞进行心肌细胞分化与纯化，以及如何通过Rho相关蛋白激酶抑制剂预处理，在小鼠心肌梗死模型中进一步提高其移植效率。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提高细胞治疗在心肌再生中有效性的关键因素是安全且高效地提升细胞植入率。Y-27632 是一种高效的选择性 Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶（RhoA/ROCK）抑制剂，可用于防止因细胞解离诱导的细胞凋亡（失巢凋亡）。我们证明，在急性心肌梗死（MI）小鼠模型中，移植前对人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs+RI）进行 Y-27632 预处理，可显著提高细胞的植入率。本文详细描述了 hiPSC-CMs 的分化、纯化及 Y-27632 预处理的完整操作流程，以及后续的细胞收缩功能检测、钙瞬变测量和向小鼠 MI 模型的细胞移植步骤。该方法提供了一种简便、安全、有效且低成本的技术方案，可显著提升细胞植入率。该方法不仅可与其他技术联合使用以进一步提高细胞移植效率，也为其他心脏疾病机制的研究提供了有利基础。

引言

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基于干细胞的疗法在治疗由心肌梗死（MI）引起的心脏损伤方面已显示出相当大的潜力1。利用已分化的hiPSC可提供无限来源的hiPSC-CM2，并为突破性治疗方法的快速开发开辟了道路。然而，该疗法在转化应用方面仍存在诸多局限，包括移植细胞的极低定植率这一挑战。

使用胰蛋白酶消化细胞会启动失巢凋亡3，当这些细胞被注射到缺血心肌等恶劣环境时，缺氧环境会进一步加速细胞走向死亡的过程。在剩余的细胞中，很大一部分会从移植部位被冲刷进入血液循环，并扩散至外周组织。其中一条关键的凋亡通路是 RhoA/ROCK 通路4。根据既往研究，RhoA/ROCK 通路可调控肌动蛋白细胞骨架的组装5,6，而后者与细胞功能障碍密切相关7,8。ROCK 抑制剂 Y-27632 在体细胞和干细胞的消化与传代过程中被广泛应用，以增强细胞黏附并减少细胞凋亡9,10,

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方案

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本研究中的所有动物实验程序均经阿拉巴马大学伯明翰分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循美国国立卫生研究院实验室动物照护与使用指南（NIH出版物第85-23号）。

1. 培养基和培养板的制备

  1. 培养基制备
    1. 对于hiPSC培养基，将400 mL人多能干细胞（hPSC）基础培养基（材料表1）与100 mL hPSC 5倍补充剂混合；于4 °C保存。
    2. 对于RPMI 1640/B27不含胰岛素（RB-）培养基，将500 mL RPMI 1640与10 mL不含胰岛素的B27补充剂混合。
    3. 对于RPMI 1640/B27（RB+）培养基，将500 mL RPMI 1640、10 mL B27补充剂和5 mL青霉素-链霉素（pen-strep）抗生素混合。
    4. 对于纯化培养基16，将500 mL无葡萄糖RPMI 1640、10 mL B27补充剂、5 mL pen-strep抗生素和1,000 μL DL-乳酸钠溶液（终浓度为4 mM）混合。
    5. 对于中和溶液，将200 mL RPMI 1640、50 mL胎牛血清（FBS）、2.5 mL pen-strep抗生素和50 μL Y-27632（终浓度为10 μM）混合。

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结果

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本研究中使用的hiPSC-CMs来源于人类，并携带荧光素酶报告基因；因此，通过生物发光成像（BLI）17检测移植细胞在体内的存活率（图1A、B）。对于心脏组织切片，人特异性心肌肌钙蛋白T（hcTnT）和人核抗原（HNA）双阳性细胞被认定为成功植入的hiPSC-CMs（图1C）。两项结果均表明，Y-27632预处理显著提高了细胞的植入率。与hiPSC-CM-RI组相比，hiPSC-CM+RI组在移植后第3、7和28天的荧光素酶活性大约增加了六倍（图1B）。此外，hiPSC-CM+RI组中hcTnT/HNA的表达量相较于hiPSC-CM-RI组接近增加了七倍（图1C）。

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讨论

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本研究的关键步骤包括获取纯化的hiPSC-CMs，通过Y-27632预处理提高hiPSC-CMs的活性，最后将精确数量的hiPSC-CMs移植到小鼠心肌梗死模型中。

本文解决的关键问题首先是优化了无葡萄糖的纯化方法19，并建立了一种新型高效的纯化体系。该体系的操作流程包括使用细胞解离酶、将细胞重植于明胶包被的培养板中、重铺板后在中和培养基中培养24小时，以及尽量缩短移植前的细胞消化时间。上述所有步骤均旨在获得高纯度心肌细胞的同时，确保细胞具有最高的活性。

其次，我们详细阐述了在细胞注射前12小时使用Y-27632对hiPSC-CMs进行预处理。细胞脱离基质引发的失巢凋亡（anoikis）通常由细胞黏附蛋白（如整合素4,20和N-钙黏蛋白21）的改变所诱导，进而激活凋亡通路。我们证明，Y-27632预处理可通过维持整合.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢斯坦福大学的 Joseph C. Wu 博士慷慨提供 Fluc-GFP 载体，以及 Yanwen Liu 博士提供的出色技术协助。本研究由美国国立卫生研究院资助，项目编号为 RO1 HL95077、HL114120、HL131017、HL138023、UO1 HL134764（资助对象：J.Z.），HL121206A1（资助对象：L.Z.），R56 HL142627（资助对象：W.Z.），美国心脏协会科学家发展基金 16SDG30410018，以及阿拉巴马大学伯明翰分校教师发展基金（资助对象：W.Z.）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
Accutase（干细胞解离溶液）STEMCELL Technologies#07920
B27 不含胰岛素Fisher ScientificA1895601
B27 补充剂Fisher Scientific17-504-044
CHIR99021Stem Cell Technologies72054
DMEM（1×），高糖，含 HEPES，不含酚红Thermofisher20163029
胎牛血清Atlanta BiologicalsS11150
Fluo-4 AM（钙离子指示剂）Invitrogen/ThermofisherF14201
无葡萄糖 RPMI 1640Fisher Scientific11879020
IWR1Stem Cell Technologies72562
Matrigel（细胞外基质）Fisher ScientificCB-40230C
mTeSR（人多能干细胞培养基）STEMCELL Technologies85850
青霉素-链霉素抗生素Fisher Scientific15-140-122
Pluronic F-127（表面活性多元醇）Sigma-AldrichP2443
Rho 激活剂 IICytoskeletonCN03
RPMI1640Fisher Scientific11875119
DL-乳酸钠Sigma-AldrichL4263
TrypLE（细胞解离酶）Fisher Scientific12-605-010
维拉帕米Sigma-AldrichV4629
Y-27632STEMCELL Technologies72304
名称公司货号备注
仪器与耗材
IVIS Lumina III 生物发光成像仪PerkinElmerCLS136334
15 mm 盖玻片WarnerCS-15R15
离心机Eppendorf5415R
共聚焦显微镜OlympusIX81
冷冻切片机Thermo ScientificNX50
双通道自动温度控制器Warner InstrumentsTC-344B
电泳电源BIO-RAD1645050
荧光显微镜OlympusIX83
高速相机pco1200 s
激光扫描头OlympusFV-1000
低剖面开放式灌流腔室（安装于上述微孵育系统）Warner InstrumentsRC-42LP
微孵育系统Warner InstrumentsDH-40iL
Minivent 小鼠呼吸机Harvard Apparatus845
NOD/SCID 小鼠Jackson Laboratory001303
预制蛋白凝胶BIO-RAD4561033
PVDF 转膜试剂盒BIO-RAD1704156
Trans-Blot 转膜系统BIO-RADTrans-Blot Turbo
热珠灭菌器Fine Science Tools18000-45
名称公司货号备注
抗体
抗人核仁素（Alexa Fluor 647）Abcamab198580
心肌肌钙蛋白 TR&D SystemsMAB1874
心肌肌钙蛋白 CAbcamab137130
心肌肌钙蛋白 IAbcamab47003
Cy5-驴抗小鼠Jackson ImmunoResearch Laboratory715-175-150
Cy3-驴抗兔Jackson ImmunoResearch Laboratory711-165-152
Fitc-驴抗小鼠Jackson ImmunoResearch Laboratory715-095-150
GAPDHAbcamab22555
人源心肌肌钙蛋白 TAbcamab91605
整合素 β1Abcamab24693
Ki67EMD Milliporeab9260
N-钙黏蛋白Abcamab18203
磷酸化肌球蛋白轻链 2Cell Signaling Technology3671s
名称公司货号备注
软件
MatlabMathWorksR2016A
ImageJNIH1.52g

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
  2. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C.

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重印与许可

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标签

Rho Y 27632

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