本文介绍了两种互补的方法，利用功能获得型报告系统在模式分枝杆菌Mycobacterium smegmatis中测定翻译错误和错译的特异性速率。这些方法可用于低通量条件下精确测定错误率，或在较高通量条件下测定相对错误率。
本文内容
摘要
摘要
基因翻译成蛋白质的过程容易发生错误。尽管在模式系统中，翻译错误的平均速率估计为每10,000个密码子出现1次，但实际错误率因物种、环境以及所研究的密码子不同而存在广泛差异。我们此前已证明，分枝杆菌采用两步途径生成氨酰化谷氨酰胺和天冬酰胺tRNA，且该途径由于其关键组分——转氨甲酰酶GatCAB对错译速率的调控作用，与相对较高的错误率密切相关。我们对先前用于大肠杆菌（Escherichia coli）中错译率检测的海肾-萤火虫双荧光素酶（Renilla-Firefly dual-luciferase）系统进行了改造，使其适用于分枝杆菌，以测定谷氨酸在谷氨酰胺密码子以及天冬氨酸在天冬酰胺密码子上的特异性错译率。尽管该报告系统适用于特异性错误率的精确估算，但其灵敏度不足且操作步骤繁琐，难以适用于高通量应用。因此，我们开发了第二种功能获得型报告系统，采用Nluc荧光素酶与绿色荧光蛋白（GFP），更适合中高通量实验条件。我们利用该系统鉴定出井冈霉素（kasugamycin）是一种可降低分枝杆菌错译水平的小分子化合物。尽管本文所述报告系统主要用于检测特定类型的分枝杆菌错译，但其亦可经改造后用于多种模式系统中其他类型错译的测量。
引言
分子生物学中的信息流需要将遗传信息翻译成功能性蛋白质。与所有生物系统一样，基因翻译也涉及可测量的错误。翻译错误率的估计值通常引用为每个密码子约1/10,000（Ribas de Pouplana等1综述）。然而，错误率变化范围很广，从低于10-5到超过0.05/密码子不等1,2,3,4,5。错误率跨越三个多数量级的广泛范围，是由于错误可能来源于翻译途径中的多个步骤：包括氨酰化过程中的随机性、突变或应激诱导的错误6,7,8,9,10、天冬氨酰-和谷氨酰-tRNA的生理错氨酰化5，或核糖体解码错误2,3,11。显著较高的错误率（超过0.01/密码子）表明，翻译错误可能具有生理功能1,12，且错译可能是特定环境依赖的13。
我们及其他研究者已证实，基因翻译过程中自然发生的错误可能具有适应性，尤其是在环境应激条件下1,5,12,14,15,16,17,18。在分枝杆菌中，由两步间接的谷氨酰胺/天冬酰胺tRNA氨酰化途径19,20产生的错误可显著增强其对一线抗结核抗生素利福平的耐受性5。因此，我们推测，使用小分子降低分枝杆菌的翻译错误率，可能增强利福平对分枝杆菌的杀灭作用。我们通过筛选发现，天然存在的氨基糖苷类抗生素春日霉素可降低分枝杆菌的翻译错误率，增强利福平在体外和体内对分枝杆菌的杀灭效果21，并限制利福平耐药性的出现21，而利福平耐药性正威胁着全球结核病的防控22——结核分枝杆菌是全球最致命的病原体。
为了研究翻译错误，必须采用测量错译的方法。目前已开发出多种用于测量错译的方法，每种方法都有其优缺点。简而言之，基于高精度质谱的方法具有多项优势，其中最重要的是，借助新型算法检测多种类型的翻译错误，可实现相对无偏倚的错译测量18。然而，质谱法并不适用于检测脱酰胺错译事件——这正是由于分枝杆菌中易出错的间接tRNA氨酰化途径所导致的错译类型。其原因在于样品在质谱分析前处理过程中会发生高频的非酶促脱酰胺反应23，从而产生极高的背景信号。因此，针对该途径中错误的检测，基因功能获得型报告系统具有明显优势。具体而言，合适的功能获得型报告系统可具有极低的背景信号，从而能够检测极低频率的错误率11。
由于对致病性结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）进行实验需要特殊的设施和额外的预防措施，我们通常在非致病性分枝杆菌M. smegmatis中开展大部分实验，并且此前已证明这两种物种之间的实验结果具有广泛的可比性5,21。为了测量由间接tRNA氨酰化途径在分枝杆菌中引发的翻译错误率，我们对一种先前用于在大肠杆菌（E. coli）中测量核糖体解码错误的海肾-萤火虫双荧光素酶系统进行了改造，使其适用于分枝杆菌11。我们进行了三项具体修改：原始报告系统在分枝杆菌中表达效率较低，因此我们对其序列进行了密码子优化，并将萤火虫荧光素酶C末端的三个氨基酸——丝氨酸-赖氨酸-亮氨酸（在某些系统中被注释为转运信号24）——修改为异亮氨酸-丙氨酸-缬氨酸25。原始报告系统中萤火虫荧光素酶含有一个关键的赖氨酸残基突变，而我们则分别将海肾荧光素酶中一个高度保守的天冬氨酸（D120）或谷氨酸（E144）残基突变为天冬酰胺或谷氨酰胺25（图1）。该报告系统被亚克隆至游离型四环素诱导质粒pUV-tetOR中（参见材料表）。功能获得型报告系统通过突变酶或荧光蛋白中关键且保守的功能性残基，使其失去原有功能11,26。翻译过程（或理论上转录过程）中的错误若生成了具有功能的蛋白变体，则会在部分翻译产物中产生可检测的酶活性。为校正蛋白丰度的差异，将突变型报告系统与一个功能性蛋白共同表达，后者作为基准对照，从而实现对功能获得水平的准确定量11。尽管海肾-萤火虫双荧光素酶报告系统能够准确测量特定的分枝杆菌翻译错误率5,25（图2及本方案第1节），但我们很快发现该系统不适用于对可能改变翻译错误率的分子进行中高通量筛选。这主要出于两个原因：a）海肾荧光素酶的相对活性较弱，导致每样本至少需要1 mL的分枝杆菌培养物才能测量错误率；b）在测定酶活性前需裂解细胞，这一过程涉及大量人工操作；而分枝杆菌细胞具有厚实且多层的细胞壁和包膜，相对难以裂解。因此，我们着手开发一种新的功能获得型报告系统，该系统可适用于小体积样本（例如在96孔板体系中使用），且无需细胞裂解即可完成检测。我们采用了高活性的Nluc荧光素酶，并鉴定出一个关键的天冬氨酸残基，当其突变为天冬酰胺时会导致酶活性下降两个数量级（图1）。此外，Nluc分子量较小，可在其N端添加分泌信号标签——来自分枝杆菌主要分泌抗原Ag85A的分泌信号27——从而使Nluc分泌至培养上清中，避免了细胞裂解的需要。作为基准对照的GFP蛋白与突变型Nluc由同一启动子驱动表达，但位于整合型载体上（参见材料表），可在完整细胞中直接检测其表达水平21（图3）。尽管具备上述优势，Nluc/GFP报告系统（本方案第2节）也存在局限性：D140N突变仅使Nluc活性降低约100倍，因此无法用于检测极低水平的翻译错误率，使其更适合作为筛选工具，而非用于精确测定翻译错误率。此外，Nluc中不存在关键的谷氨酸残基，因此仅能检测天冬酰胺误读为天冬氨酸的错误率。本文所述的一般原则可帮助研究人员直接使用这些报告系统，或根据需要对其进行改造，以在其选定的模型系统中实现对其他特定翻译错误率的准确和/或便捷测量。
方案
1. Renilla-萤火虫双荧光素酶报告系统
注意：有关本方法的图示，请参见图2。
- 从 -80 °C 保存的菌种中接种分枝杆菌报告菌株至 2 mL 的 7H9 培养基中。需使用野生型双荧光素酶菌株以及突变的 Renilla（报告基因）菌株，以用于计算错译率（见步骤 1.7）。在 37 °C 下振荡培养 1 至 2 天，直至 OD600 达到稳定期（OD > 3）。
- 将菌液分装并稀释至 OD600nm 约为 0.1 - 0.5。对于常规实验，使用三个独立的生物学重复培养物。加入无水四环素（ATC）——一种由四环素诱导型启动子控制的报告基因表达的四环素类似物诱导剂——至终浓度为 50 ng/mL。
- 为测定 kasugamycin 对错译率的影响21，在培养时同时加入不同剂量的 kasugamycin（参见 图 4 所示剂量）（在测试剂量下，kasugamycin 无抗菌活性）。注意：每种报告菌株至少需设置一个未诱导的对照组。在 37 °C 下振荡培养 4–6 小时以诱导表达。
- 将细菌培养物转移至 2 mL 离心管中，在室温下以 3,220 × g 离心 5 分钟，使细菌沉淀。弃去上清液。
- 加入 40 μL 已用双蒸水按 1:1 稀释的 1× 被动裂解缓冲液（由双荧光素酶试剂盒提供），以裂解细菌。将重悬的细菌裂解物转移至白色 96 孔板中，每样本一孔，在室温下振荡 20 分钟。
注意： 避免在裂解缓冲液中孵育细菌过长时间（超过 30 分钟）。 - 向每孔加入 80 μL 萤火虫荧光素酶底物，振荡 15 秒，使用发光仪测量发光强度，积分时间为 1,000 ms。建议使用自动进样器或多通道移液器以避免移液误差。
- 向每孔加入 80 μL Renilla 荧光素酶底物，振荡 15 秒，使用发光仪测量发光强度，积分时间为 1,000 ms。
- 从测得的发光值中减去背景发光值——使用野生型 M. smegmatis（即不含报告基因）或未诱导的报告基因裂解物测得的值。使用校正后的数值，根据以下公式11,25计算各条件下的错译率，其中 DN 表示突变报告菌株中的活性：
2. Nluc/GFP 报告基因
注意：有关本方法的图示，请参见图3。
- 从-80 °C保存的菌种中接种2 mL 7H9培养基中的细菌报告菌株。在37 °C下振荡培养1至2天，直至OD600达到稳定期（OD >3）。
- 将菌液转接到50 mL 7H9培养基中，继续培养至OD600进入晚期稳定期（>4）。
- 在将细菌分装至96孔板前，加入ATC至终浓度为50 ng/mL，并充分混匀。对大量培养物进行诱导可确保所有孔中含有相同浓度的诱导剂，并使报告系统的诱导同步化。将细菌分装至透明圆底96孔板中，每孔体积为100 μL。
- 为筛选影响错译率的小分子化合物，向选定孔中加入指定浓度的待测化合物。在本实验方案中，以春日霉素（剂量见图5）为例进行说明。向选定孔中加入不同剂量的春日霉素（每个实验组应至少包含两个生物学重复）。
- 在37 °C下振荡并诱导样品16–20小时。
注意：必须使用封板膜密封培养板。此外，所有边缘孔需加入至少200 μL无菌水，以减少测试孔中的蒸发。 - 使用多通道移液器从每孔中取出80 μL样品，转移至黑色96孔板（以最大化荧光信号检测）。使用发光仪测量GFP信号，积分时间为20 ms。
- 测量GFP信号后，将培养板在3,220 x g下离心10分钟。将50 μL上清液转移至白色底96孔板（以最大化化学发光信号检测），每孔加入50 μL Nluc底物，充分混匀后，使用发光仪测量化学发光信号，积分时间为1,000 ms。
- 通过将校正后的Nluc化学发光值除以GFP荧光值，计算Nluc/GFP比值：该数值（以任意单位表示）为天冬氨酸错译为天冬酰胺的相对度量指标。
结果
本研究中所使用的两种报告系统总体设计示意图见图1。图2展示了方案第1部分的概览，图3展示了第2部分的概览。卡那霉素对分枝杆菌错译影响的结果见图4，该结果由Renilla-Firefly报告系统测定。为验证卡那霉素作用的特异性，该报告系统还在一株缺失ksgA基因的M. smegmatis菌株（∆ksgA）中进行了表达。KsgA是一种rRNA二甲基转移酶，缺失ksgA的菌株对卡那霉素具有相对抗性。卡那霉素对错译的影响也通过Nluc/GFP报告系统进行了测定，结果如图5所示。
图1：展示两种功能获得型报告系统的示意图。 (A）该 海肾萤光素酶报告系统由两种萤光素酶组成，它们以融合蛋白的形式表达，并受四环素诱导型启动子调控。野生型双酶的表达导致两种酶均呈现可测得的高活性水平 海肾 和萤火虫荧光素酶（上图）。关键天冬氨酸残基 D120 的突变，在 海肾 转化为天冬酰胺使 海肾 酶（D120N）失活，但萤火虫荧光素酶仍具有活性。天冬酰胺被错误翻译为天冬氨酸（在此情况下，源于生理性的错酰化Asp-tRNA）Asn tRNA5,21）导致仅有小部分被翻译的产物 海肾 蛋白质获得活性，这一点可以进行测量。通过比较 海肾/Firefly 荧光素酶活性在突变报告基因与野生型双酶之间的比较可用于计算天冬酰胺被错译为天冬氨酸的速率。B) Nluc/GFP报告系统基于类似的原理。突变的Nluc（D140N）基因带有源自分枝杆菌主要分泌蛋白抗原85A的N端分泌信号。两者均具有 nluc 和 gfp 基因均从相同的四环素诱导型启动子表达，以便将GFP用作相对表达量的基准。注意：此处未设置野生型Nluc对照菌株，该报告系统主要用于筛选，其中相对错译率的测量已足以满足初筛需求。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 2：使用Renilla-Firefly 报告基因系统测定错义翻译率的流程示意图（实验方案第 1 部分）。将携带表达双荧光素酶报告基因质粒的 M. smegmatis 新鲜培养物进行培养。诱导报告基因表达，并测试待研究的化合物或实验条件。在报告基因表达 4–6 小时后，收集菌体并裂解，随后检测裂解液中的双荧光素酶活性。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：测量错译率的Nluc-GFP报告系统示意图（实验方案第2部分）。 将含有Nluc和GFP报告基因的M. smegmatis新鲜培养物扩增至足够体积，以满足所有待测孔板的需求（按每块96孔板约10 mL估算）。在将菌液加入各孔之前，向总体培养物中加入ATC以诱导报告基因表达。将孔板置于振荡条件下过夜培养。为测定相对错译率，将培养物转移至黑色孔板（以提高荧光检测灵敏度），测定GFP荧光信号，随后离心收集菌体沉淀。将上清液转移至白色孔板，用于检测Nluc活性。请点击此处查看该图的放大版本。
图4使用代表性结果 海肾- 荧光素酶报告系统检测不同菌株在卡那霉素存在下的错译率。 天冬氨酸被错误翻译为天冬酰胺的速率在（A野生型 M. smegmatis 和（B) 缺失某基因的菌株 ksgA (∆ksgA) 经链脲菌素（ksg）处理后的变化，通过测量得到 海肾-萤光素酶双报告系统。在细胞裂解和检测前，培养物经指定浓度（微克/毫升）的春日霉素处理6小时。经校正的Ren/FF比值（y轴）反映天冬氨酸对天冬酰胺的错译速率。缺失 ksgA 导致更高的基础错译率，且对藤霉素的调节作用具有更强的抗性。柱状图表示平均值，误差线为标准差。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5：使用Nluc-GFP报告系统检测卡那霉素存在下错译率的代表性结果。 通过Nluc/GFP报告系统测定野生型M. smegmatis中天冬酰胺被天冬氨酸错译的相对错译率，测定前经卡那霉素（ksg）处理过夜（16 h）。柱状图表示平均值，误差线表示标准差。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文所述方案可适用于多种生物体中翻译错误率的测量。在将该方案推广至其他系统时，需考虑若干因素。首先，应明确测量目的。若使用功能获得型报告系统准确测量翻译错误率，则需要满足以下条件：(a) 具备一种信号强且线性范围宽的检测方法（例如酶活性检测，本方案中为荧光素酶活性）；同时需满足 (b) 报告蛋白关键残基存在功能丧失突变，导致其功能显著降低，远低于预期的翻译错误率。例如，若预期待测的翻译错误率约为每密码子10-3，则该功能丧失突变所导致的活性下降应超过1,000倍；否则，低水平的翻译错误事件将难以被灵敏检测。最后，为准确利用功能获得型报告系统测量翻译错误率，(c) 还需一种稳定可靠的基准报告蛋白——本方案第一部分中为萤火虫荧光素酶。理想情况下，该基准报告蛋白应与突变的酶报告蛋白融合表达，从而确保两者以等摩尔比例表达（在实际应用中可视为完全一致）。基准报告蛋白（以及主报告蛋白）的信号应对环境变化具有较强的抗干扰能力。例如，野生型绿色荧光蛋白（GFP）的荧光信号极易受pH变化的影响28，因此不适合作为巨噬细胞内吞噬体（pH低于7）中分枝杆菌翻译错误率测量的基准29。另一方面，在小分子筛选等应用中，初筛最关键的考量因素是测量结果的可重复性（即精密度，而非准确性）、尽量减少人工操作步骤以及使用小体积培养体系。此时对翻译错误率的精确测量并非首要目标，可在后续进行二级实验时完成。最后需指出的是，本方案中基于荧光素酶酶学功能的报告系统仅能测量细菌群体的平均翻译错误率，无法提供单细胞水平上翻译错误率异质性的信息。鉴于单细胞变异在适应性表型中的重要性30,31,32，目前已开发出基于荧光蛋白的报告系统用于检测翻译错误事件12,33，包括用于分枝杆菌中翻译错误测量的系统5。
在考虑翻译错误检测的要求时，应注意本实验方案中所述的遗传性功能获得型报告系统每次只能检测一种类型的翻译错误（即一个密码子发生一种氨基酸替换）。因此，要检测不同类型的翻译错误事件，需要使用多个报告系统。例如，若要检测赖氨酰-tRNA 在某一位置因核糖体对近似同源密码子的解码错误所导致的翻译错误，至少需要16种报告系统2,3,11。高精度质谱分析结合生物信息学方法有可能同时鉴定多种不同类型的翻译错误事件18；然而，这些方法也存在局限性。总体而言，其准确性低于功能获得型报告系统。此外，如前所述，这些方法不太适用于检测某些特定类型的翻译错误，尤其是那些可能与非酶促脱酰胺反应难以区分的错误23。最后，质谱分析不适合作为中、高通量筛选的检测手段。
为了将这些报告基因和方案适用于其他系统中的翻译错误检测，还需考虑报告基因在目标模式系统中的高效表达。我们最初尝试在分枝杆菌系统中直接使用Farabaugh及其同事开发的双荧光素酶系统，但未获成功，原因是报告基因无法表达。经过 extensive troubleshooting 发现，必须对报告基因进行密码子优化并进行轻微的序列修改，才能实现高效表达25（参见上文）。可以预见，在其他系统中使用时，报告基因可能也需要类似的优化调整。
最后，应考虑所测量的错译事件类型。例如，若需要测量终止密码子通读（无义抑制），则需在主报告蛋白的非关键区域引入终止密码子的功能丧失突变34。否则，该检测方法仅能测量那些恢复了关键残基（从而恢复报告蛋白功能）的特定无义抑制事件，这可能导致对真实错译率的显著低估。越来越多的证据表明，翻译错误可能在大量生物体中发挥适应性作用1,12,13,35。然而，对错译事件的测量目前仍局限于少数模式物种，尽管这一范围正在逐步扩大。采用灵敏的方法来检测错译事件，有望进一步加深科学家对翻译错误在生理与病理过程中所起作用的理解。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了比尔及梅琳达·盖茨基金会（OPP1109789）、国家自然科学基金（31570129）以及清华大学医学院为 B.J. 提供的启动资金支持。B.J. 是惠康信托基金研究员（207487/Z/17/Z）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Middlebrook 7H9 | BD Difco | 271310 | |
| 无水四环素 | Cayman Chemical | 10009542 | |
| 卡那霉素 | sigma | K4013 | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | promega | E1960 | |
| Nano-Glo 荧光素酶检测试剂盒 | promega | N1120 | |
| Fluoroskan Ascent FL 发光检测仪 | Thermo | / | |
| 检测板，96孔白色，平底高结合，无盖 | Costar | 3922 | |
| 检测板，96孔黑色，平底高结合，无盖 | Costar | 3925 | |
| 细胞培养板，96孔，平底，带盖 | Costar | 3599 | |
| 非商业化试剂（质粒） | |||
| pUV-TetOR-RenFF | NA | NA | 附加体质粒载体，可实现四环素诱导型野生型双荧光素酶报告基因的表达 |
| pUV-TetOR-Ren-D120N-FF | 海肾荧光素酶突变型双荧光素酶报告基因质粒 | ||
| pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N | NA | NA | 附加体质粒载体，含四环素诱导型可分泌的突变型Nluc荧光素酶 |
| pMC1S-GFP | NA | NA | 分枝杆菌整合型（L5位点）载体，用于四环素诱导型GFP表达 |
参考文献
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