我们提出了一种用于定量完整线粒体数量的柠檬酸合酶活性比色检测方案 果蝇 组织匀浆
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方法文章
一种用于黑腹果蝇（Drosophila Melanogaster）柠檬酸合酶活性的比色测定法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
线粒体通过氧化磷酸化产生ATP，并调控多种生理过程，在细胞代谢中发挥着最突出的作用。线粒体功能障碍是多种代谢性疾病和神经退行性疾病的主要病因。完整的线粒体对其正常功能至关重要。柠檬酸合酶定位于线粒体基质中，因此可作为完整线粒体数量的定量酶学标志物。鉴于在线粒体中具有重要功能的许多分子和通路在人类与Drosophila之间高度保守，且Drosophila拥有大量强大的遗传学工具，Drosophila是研究线粒体功能的良好模型系统。本文介绍一种无需分离线粒体，直接利用成年果蝇组织匀浆快速简便测定柠檬酸合酶活性的实验方案。该方案同样适用于幼虫、培养细胞以及哺乳动物组织中柠檬酸合酶活性的测定。
引言
线粒体最广为人知的功能是在大多数真核生物中作为产能细胞器，通过三羧酸循环（即 Krebs 循环）和氧化磷酸化产生能量货币 ATP。研究发现，线粒体还在许多其他生理过程中发挥重要作用，例如凋亡调控1、Ca2+ 稳态2,3、活性氧（ROS）生成4以及内质网（ER）应激反应5。线粒体功能障碍可在任何年龄影响机体的任何器官，是代谢性疾病、衰老相关疾病6和神经退行性疾病7的主要病因之一。完整的线粒体结构与其功能密切相关，因此，对完整线粒体数量进行准确量化对于评估线粒体功能至关重要8。柠檬酸合酶是三羧酸循环第一步反应的限速酶9，定位于真核细胞的线粒体基质中，因此可作为完整线粒体数量的定量标志物9,10。柠檬酸合酶活性也可用于对完整线粒体蛋白进行标准化校正11,12。
果蝇， 黑腹果蝇是研究线粒体功能的优良模型系统，因为在线粒体中发挥关键作用的许多分子和通路在进化上从 果蝇 对人类13,14,15. 本文介绍一种通过比色法快速简便测定柠檬酸合酶活性的实验方案 果蝇 组织匀浆16 以96孔板形式进行。在柠檬酸合酶活性检测中，柠檬酸合酶在 果蝇 组织匀浆催化草酰乙酸与乙酰辅酶A（acetyl CoA）反应生成柠檬酸、CoA-SH和H+辅酶A-SH随后与5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应生成有色产物2-硝基-5-巯基苯甲酸盐(TNB)，该产物可在412 nm处通过分光光度法易于测定。柠檬酸合酶活性可通过显色反应速率来反映。
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方案
1. 柠檬酸合酶活性比色法检测 D. melanogaster16
- 每个样本收集十只成年果蝇。每种基因型至少收集三个重复样本。
- 为每个样本在1.5 mL离心管中准备500 µL预冷的提取缓冲液，内含20 mM HEPES（pH = 7.2）、1 mM EDTA和0.1% Triton X-100。
- 使用CO2麻醉垫麻醉成年果蝇，并分离所需组织。例如，若要分离成年果蝇的胸部，可用镊子固定果蝇胸部，然后用剪刀沿胸部与腹部交界处剪下，分离腹部。收集果蝇胸部用于肌肉柠檬酸合酶活性测定。
注意：若需用组织鲜重对柠檬酸合酶活性进行归一化处理，请在此步骤测定组织鲜重。 - 立即将10只成年果蝇的胸部组织转移至100 µL预冷的提取缓冲液中，在冰上用研磨杵充分匀浆。为保持样品处于低温状态，每次在冰上匀浆5-10秒后，将样品在冰上静置5秒，重复此过程直至管内所有组织完全匀浆。
注意：可用胶带固定离心管，检查匀浆液中无团块存在，确保组织完全匀浆。所有样品处理步骤均应在冰上进行。 - 取10 µL匀浆后的样品转移至新离心管中用于蛋白质含量测定。将用于蛋白质测定的样品保持在冰上。
注意：蛋白质样品可冷冻并储存在-80 °C以备后续分析。蛋白质浓度将作为柠檬酸合酶活性归一化的内部参数。 - 向每个剩余样品中加入400 µL预冷的提取缓冲液，使总体积达到500 µL。通过轻柔吹打至少5次充分混匀，避免产生气泡。每项反应中，将1 µL稀释后的细胞裂解液加入150 µL新鲜配制的反应液（20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.1 mM DTNB、0.3 mM乙酰辅酶A、1 mM草酰乙酸）中。立即通过轻柔吹打充分混匀，避免产生气泡。使用具备412 nm波长检测功能的酶标仪，在25 °C条件下每隔10-30秒测定一次412 nm处的吸光度，持续4分钟，最小时间间隔为10秒。
注意：吸取不同试剂前应更换枪头，避免在孔中产生气泡。试剂混合不充分可能导致测量结果出现偏差。柠檬酸合酶活性测定应在室温下于样品制备后立即进行，因为该测定用于量化完整线粒体质量。反应缓冲液应在使用前即刻配制，不应储存。 - 以光密度（OD）吸光度（abs）为纵坐标（Y轴），时间为横坐标（X轴，单位为分钟）作图。计算曲线线性部分的斜率，该斜率代表反应速率：
将该值除以样品的蛋白质浓度，以归一化柠檬酸合酶活性。柠檬酸合酶活性计算公式如下：
注意：样品蛋白质浓度可通过蛋白质浓度测定试剂盒进行测量。
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结果
图1 展示了使用柠檬酸合酶活性比色法测定过程中，在412 nm处随时间变化的光密度吸光度动力学曲线示例 果蝇 不同基因型的胸部组织匀浆。众所周知，PGC-1α 是线粒体生物发生的主导调控因子。PGC-1α 在不同物种间具有功能保守性。 果蝇 和人类。 果蝇 RNF34（dRNF34）是一种E3泛素连接酶 果蝇 PGC-1α、dPGC-1及其促进dPGC-1蛋白降解17透射电子显微镜和线粒体DNA qPCR结果表明，dRNF34基因敲低后 果蝇 肌肉增加线粒体含量，而dPGC-1的敲低可抑制这一过程17根据这些结果，我们提出假设：在果蝇中敲低 dRNF34 可能 果蝇 肌肉中线粒体柠檬酸合酶活性会增加，而这种效应应可通过敲低 dPGC-1 得以逆转。事实上，利用本文所述的柠檬酸合酶活性比色法检测，我们发现敲低 dR...
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讨论
使用Drosophila作为模型进行代谢研究时，必须考虑果蝇的遗传背景、饮食及品系保种方式18。为避免不同遗传背景对柠檬酸合酶活性测定结果的影响，不同Drosophila品系应与对照品系回交10代。本实验所用的所有Drosophila品系的遗传背景均为w1118，因此我们采用w1118作为对照。通常我们认为w1118是一个良好的对照品系，因为大多数Drosophila品系均以此为遗传背景，且其回交操作比Canton-S更为简便。所有实验组的饮食和品系保种条件必须完全一致。在本实验中，果蝇通常饲养于25 °C、相对湿度50-60%的环境中。样品制备步骤也需谨慎操作。为实验所设置的杂交应保持相似且适当的规模。设置杂交时，将3-4只雌性成年 virgin 果蝇与2-3只雄性成年果蝇共同置于一个直径4 cm、高15 cm并装有新鲜培养基的试管中。培养基配方可根据实验设计而变化（例如高脂饮食、正常饮食、高糖饮食...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（31401013 和 31471010）、上海市科学技术委员会、上海市浦江人才计划（14PJ1405900）以及上海市自然科学基金（19ZR1446400）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES） | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇（TRIZMA Base） | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| 乙酰辅酶A（Acetyl-CoA） | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| 二硫代双硝基苯甲酸（DTNB） | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| 草酰乙酸（Oxaloacetate） | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| 研磨杵（Pellet pestle） | Sangon | F619072 | |
| 研磨杵电机（Pellet pestle motor） | Tiangen | OSE-Y10 | |
| 酶标仪（Plate reader） | BioTek | Eon | |
| 蛋白质BCA检测试剂盒（Protein BCA Assay kit） | Beyotime | P0010S | |
| 剪刀（Scissors） | WPI | 14124 | |
| 曲拉通X-100（Triton X-100） | Sangon | A110694-0100 |
参考文献
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