Method Article

从未引用的太平洋牡蛎生成虚拟序列的 cDNA 库的聚合策略

DOI:

10.3791/59462

⸱

June 13th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center (GGBRC), College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, 2College of Life Science, Nanjing Agricultural University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了如何使用未引用的太平洋牡蛎标本的RNA样本的策略,并通过与公开提供的基因组数据进行比较来评估遗传物质,以生成几乎序列化的cDNA库。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以前在开发新型细胞系或基因组测序项目等关键实验中使用参考物种的生物材料,往往难以为进一步研究或第三方提供。样品的消耗性质。虽然现在广泛分布于亚洲、澳大利亚和北美的太平洋沿岸,但个别太平洋牡蛎标本在基因上相当多样化,因此不能直接作为基因库的起始材料。在本文中,我们演示了使用从区域海鲜市场获得的未引用的太平洋牡蛎标本来生成 cDNA 库。然后将这些库与公开提供的牡蛎基因组进行比较,并使用线粒体参考基因细胞色素C氧化酶亚单位I(COX1)和NADH脱氢酶(ND)选择最接近的相关库。生成的 cDNA 库的适用性也通过克隆和表达两个基因来证明编码酶 UDP-葡曲酸脱氢酶 (UGD) 和 UDP-xylose 合成酶 (UXS),它们负责 UDP-xylose 的生物合成。UDP-葡萄糖。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于交货时间长、创业推理或针对具体国家的海关法规,获取活的参考生物材料可能具有挑战性。作为替代方案,也可以从表象相同的标本中收集所需的生物材料。然而,这些样本在基因型水平上可能有很大差异,因此,由于新来源的材料与同一物种的数字化存储参考基因组的比较,往往变得困难,甚至徒劳。现有的DNA扩增方法。测序单个样本的高度保守的基因是识别物种1的广泛使用和强大的工具,例如常用的线粒体基因,这些基因经常用作cDNA库的质量评估的参考基因2 ,3,4,5,6.本文提出的方法的基本原理是,与参考基因组的相应序列相比,单个匿名牡蛎样本中的线粒体基因序列高度保存表明,其他基因也可能显示低发分,因为线粒体DNA进化速度比核DNA7要快,只需公开使用,即可对各种科学和工业相关的基因进行扩增和分离可作为参考的排序数据。

本文所述方法的总体目标是提供一个优化的工作流程,用于生成虚拟序列化的牡蛎 cDNA 库,该库可用作牡蛎基因克隆的模板 DNA。在虚拟测序中,绕过了新基因组测序;相反,一....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:图1显示了原理图概述。

1. 样本收集

  1. 获取牡蛎标本。在收获后、运输和实验室使用前,在购买后4-7天内将牡蛎留在冰上。
    注:根据本协议,牡蛎是从南京中彩批发市场(原产于中国福建宁德和中国江苏连云港)、青岛海杰水产品公司(原产于中国山东青岛)、居城购买牡蛎。烟台水产品公司(原产于中国山东烟台)和青岛金秀水产品公司(原产于中国山东青岛)。

2. 通过苯二甲酸酯-苯酚萃取的RNA分离

  1. 牡蛎组织样本的制备
    1. 用消毒手术刀从每个牡蛎标本的近似几何中心切出约100毫克的均匀软组织,并将样品转移到液氮中。
    2. 将牡蛎的剩余部分冷冻在-80°C1小时,并作为生物废物丢弃,从而将牡蛎的剩余部分归化。
    3. 将闪速冷冻的牡蛎组织研磨成细粉,放入装满50 mL液氮的砂浆(200 mL)。
    4. 将每个标本的冷冻组织75mg称重至无菌的1.5 mL离心管中,并与1mL的苯二甲酸酚萃取试剂混合。在4°C下将样品在14,000 x g下离心15分钟。
  2. 将上清液转移到新的1.5 mL离心管中,加入200μL的氯仿,并使用涡旋混合器彻底混合10-15s,直到混合物变成乳白色。
  3. 在 4°....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

图1显示了从太平洋牡蛎个体中提取的收敛cDNA库所述制备方法的原理图概述。图2显示了与参考材料的COX1和ND基因序列高度背离的远亲牡蛎标本的COX1和ND基因序列。图3显示了与参考材料的COX1和ND基因序列有低差异的密切相关的牡蛎标本的COX1和ND基因序列。图4显示了cDNA库成功克隆工业相关基因MgUGD和MgUXS。

figure-results-1
图 1: 描述的分析方法的原理概述分子识别太平洋.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过将COX1和ND基因与公开的牡蛎DNA基因组数据库进行比较,允许对区域海鲜市场具有类似表型的无配表型牡蛎标本进行基因鉴定。该方法的意义在于其简单性,因为评估虚拟cDNA库只需要一个PCR反应。两个保守的线粒体COX1和ND基因从cDNA库被放大,该库由每个牡蛎的RNA提取物的逆转转录产生。通过直接在液氮中研磨牡蛎组织,简化了RNA分离方法(步骤2.1)。对每个试样的COX1和ND基因进行测序后,序列排列表明,一些样本与参考菌株高度相似。近亲显示了COX1和ND基因序列的完整标识。

此过程最关键的步骤是RNA提取步骤;为了尽量减少RNA降解,减少牡蛎组织收获和RNA提取之间的时间至关重要。

克隆成功的例子是克隆牡蛎UGE基因12,在这里通过克隆MgUGD和MgUXS基因13,验证了生成的cDNA库的实用性,允许克隆任意数量的感兴趣的基因而无需使用退化引种的繁琐克隆策略。这种通过扩增COX1和ND基因来生成虚拟序列的cDNA库的分子.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作部分得到了中国自然科学基金(赠款号31471703、A0201300537和31671854给J.V.和L.L.,授予G.Y.编号31470435)和100名外国人才计划(授予编号JSB2014012到J.V.)的支持。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<强>化学品：
1% Triton X-100Solarbio9002-93-1*可提供替代分布商
2,5-二羟基苯甲酸Alfa Aesar490-79-9*可提供替代分布
乙腈Merck75-05-8*可提供替代分布
琼脂糖分子生物学Biowest Chemicals111860*可能的替代分销商
AmpicilinSolarbio69-52-3*可能的替代分销商
Chloroform Lingfeng， Shanghai67-66-3*可能的替代分销商
DEPC waterThermo ScientificR0601
EthanolJinhuada， Guangzhou64-17-5*可能有替代分布
硫氰酸铵-苯酚试剂Invitrogen15596018TRIzol 试剂
咪唑能源化学288-32-4*可能有替代分布
异丙醇南京化学试剂67-63-0*可能有替代分布
异丙基 &β;-D-硫代吡喃半乳糖苷Solarbio367-93-1*可选择其他分布商
卡那霉素Solarbio25389-94-0*可能使用其他分布
LB 琼脂Thermo Fisher22700025*可能
LB BrothThermo Fisher10855021*可能提供 甲
醇其他分配器广州金华达67-56-1*可能有替代分布
MgCl2 六水合西隆华工7791-18-6*可能有NaCl 替代分布
西隆华工7647-14-5*可能有NAD
+Duly Biotech53-84-9*可能有替代分布器
苯基甲基磺酰氟Macklin329-98-6*可选择其他经销商
TrisSolarbio77-86-1*可选择
UDP-葡萄糖芜湖诺威化工28053-08-9*可能选择其他经销商
UDP-葡萄糖SIGMA63700-19-6*可
选择其他经销商工具/仪器：
MALDI-TOF质谱仪BrukerAutoflex*可选择经销商
金属块加热器Long Yang Scientific InstrumentsThermoshaker HB20*可选择经销商
PCR 热循环仪Hema9600*可
选择其他经销商<强>酶及试剂盒：
10次连接缓冲液Thermo ScientificB69*可选择
分配器 5&次;PrimeSTAR 缓冲液Takara9158A
碱性磷酸酶ThermoFisher FastAPEF0654*替代经销商
可能的 COX 正向引物金斯瑞ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG
COX 反向引物金斯瑞ACTTGACCAAAAACATAAGACATG
Cutsmart 缓冲液NEBB7204S*替代品经销商可能的
dNTP 混合物Invitrogen18427088
MgUGD 正向引物金斯瑞ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTGT
MgUGD 反向引物金斯瑞ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG
MgUXS 正向引物金斯瑞CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC
MgUXS 反向引物金斯瑞ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT
ND 正向引物金斯瑞ATGAGATGGCAATTATTTTTAAT
ND 反向引物金斯瑞ATGTATTTGGAAAAATCTCCAC
PCR 纯化试剂盒AxyGenAP-PCR-250*可能的替代分销商
pET-30a（+） 载体Merck Millipore69909
商 商 商 商 商 器 提供 商 物 商

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blaxter, M. L. The promise of a DNA taxonomy. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).
  2. Wen, J., et al. Species identification of drie....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pacific OystercDNA LibraryRNA ExtractionCOX1 GeneND GeneSanger SequencingMALDI TOFGene CloningProtein ExpressionEnzyme Activity

Related Articles