方法文章

一种用于初步检测枪击残留物的新型细菌生物传感器的制备与应用

DOI：

10.3791/59471

⸱

2019年5月9日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Longwood University, 2Department of Chemistry and Physics, Longwood University

本文内容

摘要

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本文介绍了一种利用合成生物学技术合成一系列细菌生物传感器以检测枪击残留物的实验方案，并通过荧光光谱法测试这些装置在预期用途中的功能表现。

摘要

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MicRoboCop 是一种为法医化学中独特应用而设计的生物传感器。MicRoboCop 由三种装置组成，当联合使用时，可通过在三种关键分析物（锑、铅和枪击残留物中的有机成分）存在下产生荧光信号，来指示枪击残留物（GSR）的存在。本方案描述了利用大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）合成该生物传感器的过程，以及用于评估传感器选择性和灵敏度的分析化学方法。通过使用从用过的弹壳内表面采集的枪击残留物，可验证该系统的功能。制备完成后，生物传感器可储存以备后续使用，并可用于检测这些关键分析物。当三种分析物均呈阳性反应时，可初步判定为枪击残留物阳性；而每种独立装置也可用于在其他样品中检测相应分析物（例如，用于检测饮用水中铅污染的传感器）。该系统的主要局限性在于产生阳性信号所需的时间；未来的研究可能涉及探索不同的生物体以优化响应时间。

引言

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生物传感器是一种利用生物组分（如蛋白质、核酸或完整生物体）产生可检测化学物质或分析物的响应信号的分析装置。例如，煤矿工业在20世纪的大部分时间里曾使用生物传感器来检测矿井中的有毒气体。th 一个世纪以来用于检测有毒矿井气体的金丝雀：矿井中的金丝雀1通过观察生物体（金丝雀）对化学分析物（一氧化碳）的反应（死亡或不适），矿工们得以保护自身安全。在更为现代且复杂的例子中，可利用合成生物学技术改造细菌，使其在特定化学分析物存在时产生特定反应，例如表达荧光蛋白。

合成生物学是一个广义术语，指构建自然界中不存在的生物装置和系统，或对现有生物系统进行重新设计以实现特定目的。2合成生物学与基因工程的区别在于其具有标准化的方法学以及标准化的组件。 部分 （标准合成生物学遗传元件），可用于合成 设备 和 系统. A 部分 被引入到基因组中的 设备，一种生物体（如细菌）会表达某种特定性状，该性状可作为功能的指示标志。例如，在许多合成装置中，荧光蛋白的表达被引入单细胞生物体中作为报告蛋白。多个装置可组合成一个 系统微生物（如细菌）的基因组易于通过这种方式进行改造。在过去十年中，文献已报道了大量针对广泛化学分析物的生物传感器实例。3....

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方案

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注意：展示表达RFP的E. coli的合成过程。

1. 质粒DNA的制备 E. coli

  1. 解冻 E.coli 含有带RFP基因和氨苄青霉素抗性基因质粒的菌株进行培养 E.coli 在含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB（Luria Broth）琼脂平板上，37 °C培养24小时。例如，可使用合成生物学标准生物部件注册库中的J10060质粒（见 材料表）。J10060 质粒包含一个在 pBad 启动子区域控制下的 RFP（红色荧光蛋白）基因以及一个氨苄青霉素抗性基因。或者，转化 E.coli （参见步骤3.2）在质粒转染后、于LB琼脂平板培养前进行。
  2. 遵循标准的质粒小提实验步骤（参见 材料表) 从1 mL样品中分离DNA E. coli 含有 J10060 质粒的菌株。以下实验方案的目的是移除 pBad 启动子，并替换为该装置所需的启动子。
  3. 质粒小提完成后，将DNA储存于冰箱中，待消化时取出。

2. 限制性内切酶消化

  1. 在微量离心管中设置以下反应体系，用于EcoRI和NheI酶切：10 μL J10060质粒DNA（步骤1中提取）、8 μL水，以及E....

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结果

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本研究中所用红色荧光蛋白（RFP）变体的荧光光谱如图2所示。这些数据来自PbRFP装置对铅的响应，以及TNT-RFP装置对两种分析物2,4-二硝基甲苯（2,4-DNT）和1,3-二硝基苯（1,3-DNB）的响应。该图展示了阴性对照（未添加分析物）的光谱，以及添加两种不同浓度分析物后的光谱。所用RFP变体的最大荧光信号出现在575 nm处（激发波长为500 nm）。图3中的数据代表了一次典型的滴定实验结果（因此未包含误差棒），该实验按照方案第7步进行滴定。图3a显示了便携式光谱仪采集的数据，而图3b显示了荧光分光光度计采集的数据（来自同一组溶液）。随着金属浓度的增加，荧光信号总体呈上升趋势。值得注意的是，在高浓度条件下（约高于800 ppb），由于金属在该浓度下的毒性作用，响应信号开始下降。该最大响应水平可能因所用分析物的不同而有所变化。我们先前关于SbRFP的研究表明，细菌能够耐受更高浓度的砷和锑（至少可达1,000 ppb）1.......

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讨论

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修改与故障排除

表4中描述的实验可根据所设计的传感器进行适当修改。化学传感器最重要的方面是评估其灵敏度和特异性。应分析较宽范围的待测物浓度，以确定传感器的有效分析范围，这具有重要意义。同时，确定待测物对细胞的最高耐受水平也十分必要。由于本研究中使用的待测物为有毒金属（Pb和Sb）或甲醇溶液中的有机化合物（TNT衍生物），当待测物或溶液的毒性达到一定浓度时，将导致细胞死亡（目前所进行的实验中，该浓度通常高于500 – 1,000 ppb）。

该技术的局限性

本研究中展示的结果本质上是定性的，但旨在演示经RFP修饰的E. coli的定量检测能力。传感器的灵敏度在不同培养批次之间可能存在显著差异，具体取决于培养液中细胞的密度。若需获得定量结果，应在分析前通过测量液体培养物的光密度来估算细胞浓度。一旦确定了培养物的光密度，即可对细胞进行适当稀释，以降低实验间的变.......

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披露

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作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

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作者希望感谢隆伍德大学 BIOL 324（遗传学）课程以及 CHEM 403（高级化学实验问题解决）课程的学生，他们参与了锑和铅生物传感器的初步制备与测试工作。MicRoboCop 的构想诞生于由美国国家科学基金会（NSF）和霍华德·休斯医学研究所资助、马里兰大学巴尔的摩县分校主办的 GCAT SynBIO 研讨会（2014 年夏季）。作者同时感谢隆伍德大学库克-科尔文理学院以及 GCAT SynBio 校友基金提供的经费支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,3-二硝基苯，97%AldrichD194255-25G
2,4-二硝基甲苯，97%Aldrich101397-5G
琼脂Fisher ScientificBP1423-500
氨苄青霉素Fisher ScientificBP1760-5
锑，标准溶液（1000ppm ±1%/认证）Fisher ScientificSA450-100稀硝酸中的标准品
Cut Smart 缓冲液New England BioLabsB7204S
双链缓冲液Integrated DNA Technologies11-01-03-00
EcoRI-HF 限制性内切酶New England BioLabsR3101S
乙醇，HPLC 级，变性Acros OrganicsAC611050040溶剂无需 HPLC 级，ACS 级或试剂级即可使用。
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA 测序试剂盒Eurofins GenomicsSimpleSeq Kit 标准型
菌落 PCR 正向引物Integrated DNA Technologies5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
DNA 测序正向引物Integrated DNA Technologies5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science 高速质粒小量提取试剂盒IBI ScientificIB47101
LB 肉汤，Miller 型Fisher ScientificBP1426-500
铅，标准溶液（1000ppm ±1%/认证）Fisher ScientificSL21-100稀硝酸中的标准品
LeadOff 一次性清洁与去污湿巾Hygenall45NRCN以罐装或单片独立包装形式出售，任何含酒精的湿巾均可使用。
甲醇，HPLC 级Fisher ScientificA452-4溶剂无需 HPLC 级，ACS 级或试剂级即可使用。
NEB 5-alpha 感受态 E. coli 细胞New England BioLabsC2987I
NheI-HF 限制性内切酶New England BioLabsR3131S
无核酸酶水New England BioLabsB1500S
OneTaq 2X 预混液（含标准缓冲液）New England BioLabsM0482S
用于合成生物学的标准生物部件注册库中的质粒标准生物部件注册库http://parts.igem.org/Main_Page
启动子序列Integrated DNA TechnologiesSb 启动子： 5’-GCATGAATTCA
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC
GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’
3’-CGTACTTAAGCTCACTATA
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC
TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG
TTAGCGATCGCGTA-5’
Pb 启动子： 5’-GCATGAATTCG
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG

TGTATAATCGGCAACGCG
AGCTAGCGCAT-3’
3’-CGTACTTAAGCAGAA
CTGAGATATCATTGATCTCCCACA
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC
GTA-5’
TNT 启动子： 5’GCATTCTAGAT
CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA
ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT
AAAAAAACGTGATACTCATCACAT
CGACGAAACAACGTCACTTATACA
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT
GAATTCGCAT3’
3’CGTAAGATCTAGTTAA
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC
TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA
GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA
GCGTA5’
菌落 PCR 反向引物Integrated DNA Technologies5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
DNA 测序反向引物Integrated DNA Technologies5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA 连接酶New England BioLabsM0202S

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
  2. The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
  3. Roda, A., et al.

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