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方法文章

一种用于初步检测枪击残留物的新型细菌生物传感器的制备与应用

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DOI：

10.3791/59471

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2019年5月9日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Longwood University, 2Department of Chemistry and Physics, Longwood University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用合成生物学技术合成一系列细菌生物传感器以检测枪击残留物的实验方案，并通过荧光光谱法测试这些装置在预期用途中的功能表现。

摘要

MicRoboCop 是一种为法医化学中独特应用而设计的生物传感器。MicRoboCop 由三种装置组成，当联合使用时，可通过在三种关键分析物（锑、铅和枪击残留物中的有机成分）存在下产生荧光信号，来指示枪击残留物（GSR）的存在。本方案描述了利用大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）合成该生物传感器的过程，以及用于评估传感器选择性和灵敏度的分析化学方法。通过使用从用过的弹壳内表面采集的枪击残留物，可验证该系统的功能。制备完成后，生物传感器可储存以备后续使用，并可用于检测这些关键分析物。当三种分析物均呈阳性反应时，可初步判定为枪击残留物阳性；而每种独立装置也可用于在其他样品中检测相应分析物（例如，用于检测饮用水中铅污染的传感器）。该系统的主要局限性在于产生阳性信号所需的时间；未来的研究可能涉及探索不同的生物体以优化响应时间。

引言

生物传感器是一种利用生物组分（如蛋白质、核酸或完整生物体）产生可检测化学物质或分析物的响应信号的分析装置。例如，煤矿工业在20世纪的大部分时间里曾使用生物传感器来检测矿井中的有毒气体。th 一个世纪以来用于检测有毒矿井气体的金丝雀：矿井中的金丝雀1通过观察生物体（金丝雀）对化学分析物（一氧化碳）的反应（死亡或不适），矿工们得以保护自身安全。在更为现代且复杂的例子中，可利用合成生物学技术改造细菌，使其在特定化学分析物存在时产生特定反应，例如表达荧光蛋白。

合成生物学是一个广义术语，指构建自然界中不存在的生物装置和系统，或对现有生物系统进行重新设计以实现特定目的。2合成生物学与基因工程的区别在于其具有标准化的方法学以及标准化的组件。 部分 （标准合成生物学遗传元件），可用于合成 设备 和 系统. A 部分 被引入到基因组中的 设备，一种生物体（如细菌）会表达某种特定性状，该性状可作为功能的指示标志。例如，在许多合成装置中，荧光蛋白的表达被引入单细胞生物体中作为报告蛋白。多个装置可组合成一个 系统微生物（如细菌）的基因组易于通过这种方式进行改造。在过去十年中，文献已报道了大量针对广泛化学分析物的生物传感器实例。3,4.

本研究中，MicRoboCop 系统是利用合成生物学技术设计、并应用于法医学和环境化学领域的一种生物传感器示例。MicRoboCop 由三个独立的装置组成，当三者结合使用时，可使大肠杆菌（Escherichia coli）在检测到来自人体手部或物体表面的枪击残留物（GSR）时表达红色荧光蛋白（RFP）。这三个装置分别响应已知构成 GSR 的三种特定化学分析物5。该系统所响应的三种分析物分别为：I. 2,4,6-三硝基甲苯（TNT）及其相关化合物；II. 铅（以铅离子形式存在）；III. 锑（同样以离子形式存在）。

枪击残留物（GSR）由多种不同的化学物质组成，但通常用于识别残留物是否为GSR的三种成分是钡（barium）、铅（lead）和锑（antimony）5。鉴定GSR的标准证据检验方法是使用扫描电子显微镜（SEM）结合能量色散X射线荧光光谱（EDX）5。SEM-EDX技术使分析人员能够识别GSR独特的形态特征及其元素组成。目前，广泛使用的二元初步检验方法较少。一种最近发表的初步检验方法采用离子迁移谱（IMS），但该技术需要专用设备，许多实验室可能不具备6。此外，也存在一些显色“斑点”试验可用于检测，尽管这些方法通常用于射击距离判断，或用于弹孔及伤口处GSR的鉴定5。另外，文献中对用于GSR检测的电化学测试方法也有少量报道，例如伏安分析法，其优势在于可能实现现场便携检测；还有阳极溶出伏安法，这是一种对金属元素具有极高灵敏度的检测方法7。尽管已有针对其他法医学应用的生物传感器研究发表，但文献中专门针对GSR检测而设计的生物传感器报道极少8。

MicRoboCop 系统中每个装置的生物元件及其质粒构建如图1所示。图1b中的弯曲箭头代表在分析物存在时被激活的启动子区域，椭圆形为核糖体结合位点，用于启动报告蛋白的翻译，标有 RFP 的灰色方框是表达红色荧光蛋白的基因，红色八边形为转录终止位点。这三个装置将联合组成一个系统用于检测枪击残留物（GSR）。每个带有特定启动子（SbRFP、PbRFP 和 TNT-RFP）的装置将与待测样品共同孵育，并测量 RFP 的荧光信号。只有当相应的化学分析物存在并激活启动子区域时，才会表达 RFP。本文设计并展示了三种可响应 GSR 中部分化学物质的装置。

三种 MicRoboCop 装置中使用的启动子分别为对砷和锑敏感的启动子SbRFP9,10、对铅敏感的启动子PbRFP11,12，以及对三硝基甲苯（TNT）敏感的启动子TNT-RFP13。由于文献检索未发现针对钡设计的启动子，因此选用TNT启动子作为替代，因为该启动子对多种结构相关的化合物（特别是2,4-二硝基甲苯和二硝基苯）具有敏感性，而这些化合物已知是枪击残留物（GSR）中有机成分的一部分。该启动子已成功用于特异性检测埋藏地雷中微量的TNT和2,4-二硝基甲苯（2,4-DNT）13。将这三种装置联合组成系统使用时，若检测到枪击残留物，则三种装置均会产生荧光信号；而仅有一种或两种装置出现荧光信号，则表明分析物可能来源于其他环境因素，或在TNT启动子的情况下，是由非枪击残留物中的有机化合物所激活。通过同时使用这三种装置，可最大程度降低因环境干扰导致假阳性结果的可能性。无铅弹药虽然正逐渐流行，但目前在美国弹药销售中仍仅占约5%；因此，因不含铅而导致假阴性结果的可能性虽存在，但以铅作为枪击残留物标志物的传感器仍具有实际应用价值14。除这一特定的法医学应用外，每种装置亦可单独用于环境污染物的检测。

本文所述方案包括用于构建装置（传感器细菌）的合成生物学技术，以及用于检测装置功能和分析所获得荧光信号的分析技术。该方案还包括以手部擦拭方式采集嫌疑人手上的枪击残留物（GSR），或以拭子擦拭方式从物体表面采集GSR，以收集法医学证据。文中以铅传感器装置的结果作为示例结果，同时展示了使用已击发弹壳进行GSR阳性检测的示范。

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方案

注意：展示表达RFP的E. coli的合成过程。

1. 质粒DNA的制备 E. coli

  1. 解冻 E.coli 含有带RFP基因和氨苄青霉素抗性基因质粒的菌株进行培养 E.coli 在含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB（Luria Broth）琼脂平板上，37 °C培养24小时。例如，可使用合成生物学标准生物部件注册库中的J10060质粒（见 材料表）。J10060 质粒包含一个在 pBad 启动子区域控制下的 RFP（红色荧光蛋白）基因以及一个氨苄青霉素抗性基因。或者，转化 E.coli （参见步骤3.2）在质粒转染后、于LB琼脂平板培养前进行。
  2. 遵循标准的质粒小提实验步骤（参见 材料表) 从1 mL样品中分离DNA E. coli 含有 J10060 质粒的菌株。以下实验方案的目的是移除 pBad 启动子，并替换为该装置所需的启动子。
  3. 质粒小提完成后，将DNA储存于冰箱中，待消化时取出。

2. 限制性内切酶消化

  1. 在微量离心管中设置以下反应体系，用于EcoRI和NheI酶切：10 μL J10060质粒DNA（步骤1中提取）、8 μL水，以及EcoRI和NheI酶各1 μL（每种酶预先与1 μL缓冲液混合，参见材料表）。
  2. 对于启动子DNA，在微量离心管中设置以下反应体系，用于EcoRI和NheI酶切：10 μL退火后的启动子DNA序列（8 μL水，以及EcoRI和NheI酶各1 μL，每种酶预先与1 μL缓冲液混合）。
    1. 对于Sb-、Pb-或TNT-RFP（参见材料表），将寡核苷酸溶解于缓冲液（30 mM HEPES，pH 7.5；100 mM醋酸钾）中，以等摩尔浓度混合，于94 °C孵育2分钟，然后在室温下逐渐冷却。
  3. 用移液器将样品轻轻吹打混匀，移液器设定体积为10 μL。
  4. 在37 °C孵育30分钟。
  5. 在80 °C加热5分钟以灭活酶。
  6. 将酶切后的DNA保存于冰箱中，待进行下一步时使用。

3. 连接与转化

  1. 连接反应
    1. 使用在步骤2中经EcoRI和NheI双酶切的质粒和启动子DNA，在冰上于微量离心管中配制如表1所示的反应体系；最后加入T4 DNA连接酶。
      注意：表1所示的连接反应采用1:3的摩尔比（载体:插入片段），适用于所指示的DNA大小。
    2. 通过上下吹打轻轻混匀反应液，并短暂离心。
    3. 在室温下孵育10分钟。
    4. 在65 °C加热10分钟以灭活酶活性。
  2. 转化
    1. 将含有20 µL DH5-alpha感受态E. coli细胞的离心管置于冰上解冻，直至最后一粒冰晶消失。
    2. 向细胞混合物中加入5 µL质粒DNA。轻轻弹击管壁4–5次，使细胞与DNA充分混匀。
    3. 将混合物置于冰上静置2分钟。
    4. 在精确42 °C条件下热激30秒。期间不要混匀。
    5. 再次置于冰上静置2分钟。期间不要混匀。
    6. 加入380 µL室温SOC培养基，混匀后立即涂布于含氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB琼脂平板上，并在37 °C过夜培养。
    7. 在24小时内观察平板上的菌落生长情况。
    8. 用封口膜密封平板，并存放于冰箱中，待下一步使用。

4. 菌落PCR

  1. 向PCR管中加入反应混合物（共设置4个反应管），具体组分见表2。
  2. 通过上下吹打轻轻混匀各反应体系。
  3. 使用黄色枪头刮取转化后的E. coli菌落（或极小区域）；将该E. coli样品划线接种至已分区的新LB/氨苄青霉素/琼脂平板上，随后将枪头插入PCR管中，轻轻振荡枪头使E. coli与PCR反应液充分混合。重复上述操作三次，分别处理另外三个菌落。将PCR管放入PCR仪中，按照表3所示程序开始热循环反应。
  4. 使用含2%琼脂糖的凝胶，在TAE缓冲液中进行凝胶电泳，以确定哪些菌落的连接产物成功插入质粒，挑选阳性克隆在新的平板上扩大培养。
  5. 将平板保存于冰箱中，待后续检测使用。准备LB液体培养基（添加100 µg/mL氨苄青霉素），用于后续化学检测的菌液培养。

5. DNA 测序

  1. 每个样品中加入 5 µL 质粒、4 µL 测序引物和 3 µL 去离子水。
  2. 将该混合物放入离心管中，并送样进行 DNA 测序（参见材料表）。
  3. 分析 DNA 测序数据，使用 DNA 序列分析软件比较预期与实际获得的 DNA 序列，以确认无突变发生且基因已正确插入。
    注意：下文以 E. coli 作为化学传感器的应用为例进行说明。

6. 大肠杆菌（E. coli）培养物的制备

  1. 准备含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基用于液体培养。
  2. 制备传感细菌、阳性对照*细菌和阴性对照**细菌的液体培养物。
    注：*阳性对照细菌：携带含有在组成型启动子控制下的 RFP 基因质粒的 E. coli；本研究中使用了合成生物学标准生物元件注册库中的质粒 E1010（见材料表）。
    **阴性对照细菌：携带含有在不同启动子（如 pBad 启动子）控制下的 RFP 基因质粒的 E. coli（使用合成生物学标准生物元件注册库中的质粒 J10060（见材料表）），或不携带 RFP 基因的质粒。
  3. 将培养物置于 37 °C、220 rpm 的摇床培养箱中培养，时间不少于 8 小时，最长不超过 18 小时。培养液变浑浊表明细菌已生长。

7. 滴定 E. coli 检测设备功能

注意：传感器经滴定验证功能后，此步骤无需重复进行。每次使用时，可通过加入铅、锑、2,4-二硝基甲苯（2,4-DNT）或1,3-二硝基苯（1,3-DNB）作为阳性对照，以检测装置功能，而无需进行完整的滴定过程。

  1. 将目标分析物配制成浓度为 10 ppm 的水溶液作为储备液。若溶解度存在问题，可使用 50/50 的水/甲醇混合溶液。
  2. 以表 4为参考，标记相应数量的无菌培养管，并将 2 mL 培养液（来自方案步骤 6）加入每根试管中。
    注意：为确定传感器细菌的一般分析范围，至少应设置三个不同浓度的分析物检测，一个阴性对照组，一个阳性对照组。此外，每种细菌还应设一根不添加金属的试管（另一种类型的阴性对照）。为更准确地确定分析范围和检测限，应使用更宽范围的分析物浓度。
  3. 根据表 4所示，向含有 2 mL 培养液的试管中加入分析物储备液，将试管盖轻轻扣上（保持松动，以允许空气进入），然后涡旋振荡培养管。
  4. 保持试管盖松动，将试管置于摇床培养箱中，在 220 rpm、37 °C 条件下培养至少 24 小时。
  5. 从培养箱中取出试管，将试管盖紧密扣紧，并将试管置于冰箱中保存，直至进行荧光分析。

8. 使用 E. coli 作为GSR的化学传感器

  1. 使用专为去除铅设计的乙醇擦拭巾（参见材料表），擦拭双手的所有表面，包括指缝之间。每只手使用一张独立的擦拭巾。将使用过的擦拭巾存放在贴有适当标签的可密封塑料袋中，直至进行分析。
  2. 对于待检测的表面：大面积表面使用基于酒精的擦拭巾，小面积表面则使用经乙醇润湿的棉签。
    注：为演示传感器对GSR（枪击残留物）的响应，本研究使用经乙醇润湿的棉签擦拭了已使用过的.40口径弹壳内表面。
  3. 佩戴洁净手套，并使用经酒精清洁过的剪刀，从擦拭巾中心剪下约1 cm2的区域。
  4. 将剪下的手部擦拭巾样品或棉签直接放入含有2 mL传感器细菌的培养管中，确保其完全浸没于培养液中。
  5. 按照上述步骤7.4 – 7.5所述流程继续操作。

9. 使用便携式光谱仪进行荧光分析（参见材料表）

  1. 使用涡旋混合器振荡试管。
  2. 设置光谱仪，选择适合您所用RFP变体的发射波长，并以500 nm为激发波长采集荧光发射信号。
  3. 使用LB培养基（Luria broth）记录空白光谱。
  4. 小心将各上清液转移至低体积比色皿中，测定其发射光强度。

10. 使用96孔板读数仪进行荧光分析（参见材料表）

  1. 使用涡旋振荡器震荡试管。
  2. 将 200 mL 培养液转移至微孔板的孔中。记录每个样品所对应的孔位。
  3. 设置荧光分光光度计，以检测RFP变体在适当波长下的发射强度。

11. 数据分析

  1. 利用所有阴性对照（RFP阴性细菌或未添加分析物的传感器细菌）获得的信号，计算背景的平均荧光信号。
  2. 从传感器细菌测得的每个荧光信号中减去平均背景信号，得到经背景校正的荧光强度。
  3. 通过将经背景校正的荧光强度除以平均背景信号来估算信噪比（S/N）。如果信噪比大于3，则判定为阳性结果。

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结果

本研究中所用红色荧光蛋白（RFP）变体的荧光光谱如图2所示。这些数据来自PbRFP装置对铅的响应，以及TNT-RFP装置对两种分析物2,4-二硝基甲苯（2,4-DNT）和1,3-二硝基苯（1,3-DNB）的响应。该图展示了阴性对照（未添加分析物）的光谱，以及添加两种不同浓度分析物后的光谱。所用RFP变体的最大荧光信号出现在575 nm处（激发波长为500 nm）。图3中的数据代表了一次典型的滴定实验结果（因此未包含误差棒），即按照实验方案第7步进行的PbRFP装置滴定实验。图3a显示了便携式光谱仪采集的数据，而图3b显示了荧光分光光度计采集的数据（来自同一批溶液）。随着金属浓度的增加，荧光信号总体呈上升趋势。值得注意的是，在高浓度条件下（约高于800 ppb），由于金属在该浓度下的毒性作用，响应信号开始下降。该最大响应水平可能因所用分析物的不同而有所差异。我们先前关于SbRFP的研究表明，细菌能够耐受更高浓度的砷和锑（至少可达1,000 ...

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讨论

修改与故障排除

表4中描述的实验可根据所设计的传感器进行适当修改。化学传感器最重要的方面是评估其灵敏度和特异性。应分析较宽范围的待测物浓度，以确定传感器的有效分析范围，这具有重要意义。同时，确定待测物对细胞的最高耐受水平也十分必要。由于本研究中使用的待测物为有毒金属（Pb和Sb）或甲醇溶液中的有机化合物（TNT衍生物），当待测物或溶液的毒性达到一定浓度时，将导致细胞死亡（目前所进行的实验中，该浓度通常高于500 – 1,000 ppb）。

该技术的局限性

本研究中展示的结果本质上是定性的，但旨在演示经RFP修饰的E. coli的定量检测能力。传感器的灵敏度在不同培养批次之间可能存在显著差异，具体取决于培养液中细胞的密度。若需获得定量结果，应在分析前通过测量液体培养物的光密度来估算细胞浓度。一旦确定了培养物的光密度，即可对细胞进行适当稀释，以降低实验间的变...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

作者希望感谢隆伍德大学 BIOL 324（遗传学）课程以及 CHEM 403（高级化学实验问题解决）课程的学生，他们参与了锑和铅生物传感器的初步制备与测试工作。MicRoboCop 的构想诞生于由美国国家科学基金会（NSF）和霍华德·休斯医学研究所资助、马里兰大学巴尔的摩县分校主办的 GCAT SynBIO 研讨会（2014 年夏季）。作者同时感谢隆伍德大学库克-科尔文理学院以及 GCAT SynBio 校友基金提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,3-二硝基苯，97%AldrichD194255-25G
2,4-二硝基甲苯，97%Aldrich101397-5G
琼脂Fisher ScientificBP1423-500
氨苄青霉素Fisher ScientificBP1760-5
锑，标准溶液（1000ppm ±1%/认证）Fisher ScientificSA450-100稀硝酸中的标准品
Cut Smart 缓冲液New England BioLabsB7204S
双链缓冲液Integrated DNA Technologies11-01-03-00
EcoRI-HF 限制性内切酶New England BioLabsR3101S
乙醇，HPLC 级，变性Acros OrganicsAC611050040溶剂无需 HPLC 级，ACS 级或试剂级即可使用。
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA 测序试剂盒Eurofins GenomicsSimpleSeq Kit 标准型
菌落 PCR 正向引物Integrated DNA Technologies5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
DNA 测序正向引物Integrated DNA Technologies5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science 高速质粒小量提取试剂盒IBI ScientificIB47101
LB 肉汤，Miller 型Fisher ScientificBP1426-500
铅，标准溶液（1000ppm ±1%/认证）Fisher ScientificSL21-100稀硝酸中的标准品
LeadOff 一次性清洁与去污湿巾Hygenall45NRCN以罐装或单片独立包装形式出售，任何含酒精的湿巾均可使用。
甲醇，HPLC 级Fisher ScientificA452-4溶剂无需 HPLC 级，ACS 级或试剂级即可使用。
NEB 5-alpha 感受态 E. coli 细胞New England BioLabsC2987I
NheI-HF 限制性内切酶New England BioLabsR3131S
无核酸酶水New England BioLabsB1500S
OneTaq 2X 预混液（含标准缓冲液）New England BioLabsM0482S
用于合成生物学的标准生物部件注册库中的质粒标准生物部件注册库http://parts.igem.org/Main_Page
启动子序列Integrated DNA TechnologiesSb 启动子： 5’-GCATGAATTCA
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC
GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’
3’-CGTACTTAAGCTCACTATA
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC
TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG
TTAGCGATCGCGTA-5’
Pb 启动子： 5’-GCATGAATTCG
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG

TGTATAATCGGCAACGCG
AGCTAGCGCAT-3’
3’-CGTACTTAAGCAGAA
CTGAGATATCATTGATCTCCCACA
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC
GTA-5’
TNT 启动子： 5’GCATTCTAGAT
CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA
ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT
AAAAAAACGTGATACTCATCACAT
CGACGAAACAACGTCACTTATACA
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT
GAATTCGCAT3’
3’CGTAAGATCTAGTTAA
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC
TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA
GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA
GCGTA5’
菌落 PCR 反向引物Integrated DNA Technologies5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
DNA 测序反向引物Integrated DNA Technologies5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA 连接酶New England BioLabsM0202S

参考文献

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