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方法文章

建立并鉴定三种通过逐步增加阿法替尼剂量诱导的耐阿法替尼肺腺癌PC-9细胞系

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DOI：

10.3791/59473

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2019年6月26日

 ,  ,  ,  , 
1Advanced Cancer Translational Research Institute, Showa University, 2Division of Breast Surgical Oncology, Department of Surgery, Showa University School of Medicine, 3Division of Allergology and Respiratory Medicine, Department of Medicine, Showa University School of Medicine

本文内容

摘要

建立了一种从肺腺癌PC-9细胞中构建阿法替尼耐药细胞系的方法，并对耐药细胞进行了表征。这些耐药细胞可用于研究表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的耐药机制，适用于非小细胞肺癌患者的临床研究。

摘要

获得性耐药是分子靶向抑制剂在癌症治疗中面临的一个严重问题。肺癌在大多数国家仍然是癌症相关死亡的首要原因。近年来，“致癌驱动突变”的发现，例如表皮生长因子受体（EGFR）激活突变，以及随后开发的EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）（吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、达克替尼和奥希替尼）等分子靶向药物，极大地改变了肺癌的治疗格局。然而，这些药物对携带EGFR激活突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者仍然并非完全有效。在出现获得性耐药后，NSCLC的全身进展仍是治疗EGFR突变阳性NSCLC患者过程中的重大障碍。本文介绍了一种逐步剂量递增的方法，用于从携带EGFR第19号外显子15个碱基对缺失激活突变的NSCLC PC-9细胞中建立三个独立的获得性阿法替尼耐药细胞系。文中简要描述了对这三个独立阿法替尼耐药细胞系进行表征的方法。EGFR-TKIs的获得性耐药机制具有异质性，因此必须检测多个获得EGFR-TKI耐药的细胞系。采用这种逐步剂量递增方法，通常需要10至12个月才能获得具有获得性耐药特性的细胞系。新型获得性耐药机制的发现将有助于开发更有效且安全的治疗策略。

引言

目前已有五种靶向表皮生长因子受体（EGFR）的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）可用于治疗EGFR突变阳性的非小细胞肺癌（NSCLC）患者，包括吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、达克替尼和奥希替尼。在过去十年中，随着新型潜在EGFR-TKI的发现，这类患者的治疗取得了显著进展。在肺腺癌患者中，约50%的亚洲患者和15%的高加索患者可检测到EGFR的体细胞突变1。EGFR最常见的突变为第21号外显子的L858R点突变以及第19号外显子的15个碱基对（bp）缺失2。对于EGFR突变阳性的NSCLC患者，与既往标准的含铂双药化疗相比，EGFR-TKI可提高治疗反应率和改善临床结局3。

吉非替尼和厄洛替尼是首批获批的小分子抑制剂，通常被称为第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）。这些EGFR TKI通过与ATP竞争，可逆地结合ATP结合位点，从而抑制酪氨酸激酶活性4。阿法替尼是一种第二代EGFR TKI，可不可逆地共价结合EGFR的酪氨酸激酶结构域，被归类为泛人EGFR家族抑制剂5。

尽管这些疗法为非小细胞肺癌（NSCLC）患者带来了显著的临床获益，但获得性耐药不可避免。针对第一代和第二代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）最常见的耐药机制是EGFR外显子20上出现T790M突变，该突变在50%-70%的肿瘤样本中存在6,7,8。其他耐药机制包括旁路信号激活（如MET、IGF1R和HER2）、转化为小细胞肺癌以及上皮-间质转化的诱导，这些机制在临床前和临床研究中均有发现9。EGFR-TKIs的耐药机制具有异质性。通过在临床前研究中鉴定新的耐药机制，可能有助于开发新型治疗手段以克服耐药。为了最大化患者的临床获益，最佳的序贯治疗策略必须综合考虑耐药机制及可靶向的治疗靶点。

选择合适的亲本细胞系至关重要，因为它是所有后续实验的基础。选择策略首先考虑临床相关性，必须选用未经化疗和放疗的细胞系。既往的化疗和/或放疗可能诱导耐药通路的改变以及药物耐药标志物表达水平的变化。本研究采用携带EGFR第19号外显子15个碱基对缺失突变的PC-9细胞，用于建立对阿法替尼的获得性耐药。该细胞系来源于一名未接受过前期化疗和放疗的日本非小细胞肺癌患者。

由于阿法替尼以口服方式每日给药，因此需持续进行 体外处理，即细胞在持续含有阿法替尼的培养环境中生长，具有临床相关性。实验各阶段所用药物的剂量必须根据所选的亲本细胞系进行优化。可采用细胞毒性实验来确定合适的药物浓度范围，该范围应与药物的药代动力学数据相一致。

在整个筛选过程中，细胞的整个群体始终保持为单一的群体；不使用克隆或其他分离方法。首先，细胞持续暴露于低浓度的药物中。随后，当细胞适应在药物存在下生长后，逐步增加药物剂量，直至达到最终的最佳药物剂量10,11。或者，也可采用脉冲式给药或诱变方法来筛选耐药细胞，这些操作均在药物处理之前进行12,13。遗憾的是，药物耐药性未能成功建立的情况通常未被报道。这些筛选策略的建立旨在模拟癌症患者的实际情况，以重建具有临床相关性的耐药模型。有时，为了鉴定与药物耐药机制相关的分子变化，会使用高浓度药物。然而，这种模型的临床相关性较低。

本文介绍了一种从携带EGFR第19号外显子15个碱基对缺失的PC-9细胞中建立三个独立的阿法替尼耐药细胞系的方法，并对这些阿法替尼耐药细胞系进行了初步表征。

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方案

1. 建立三株独立的阿法替尼耐药PC-9细胞系

  1. 使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法测定PC-9细胞初始阿法替尼暴露浓度
    1. 在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的生长培养基中，将PC-9细胞接种于经细胞培养处理的10 cm培养皿中，并在37 °C、5% CO2培养箱中培养。
    2. 将PC-9细胞以4 × 104 个/mL的密度重悬于生长培养基中，每孔加入50 µL至96孔微孔板中，最终细胞浓度为每孔50 µL含2.0 × 103 个细胞。在37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。
    3. 向含有50 µL生长培养基的各孔中加入50 µL不同浓度的阿法替尼溶液：0、0.002、0.006、0.02、0.06、0.2、0.6、2、6 和 20 µM。最终体积为100 µL，阿法替尼终浓度分别为0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 和 10 µM。
    4. 将96孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中培养96小时。
    5. 每孔加入15 µL染料溶液（见材料表），在37 °C、5% CO2培养箱中孵育4小时；随后每孔加入100 µL溶解/终止液（见材料表），并在37 °C、5% CO2培养箱中过夜孵育。
    6. 使用酶标仪（见材料表）在570 nm波长处测定吸光度（OD570）。每组设置6–12个重复孔，并至少独立重复实验三次。
    7. 使用统计学软件（见材料表）将数据以半对数图形式作图，并计算IC50值，即药物效应降至最大响应50%时的药物浓度（见材料表）。
  2. 通过逐步剂量递增法，在三个独立的10 cm培养皿中对PC-9细胞持续暴露于不可逆EGFR-TKI阿法替尼
    1. 将PC-9细胞在含有10 mL生长培养基的p100培养皿中培养。当PC-9细胞达到亚融合状态时，取1 mL细胞悬液转移至三个新的p100培养皿中，每皿加入9 mL新鲜生长培养基。经1:10稀释后的PC-9细胞在3–4天内再次达到亚融合状态，细胞密度约为4–5 × 105 个/mL。
    2. 次日，向三个p100培养皿中分别加入相当于IC50值1/10浓度的阿法替尼。
      注意：阿法替尼以DMSO配制，储备液浓度分别为1 μM、10 µM、100 µM、1 mM和5 mM。根据所需终浓度，向10 mL培养基中加入1–10 µL阿法替尼溶液。
    3. 当含阿法替尼的p100培养皿中的细胞达到亚融合状态时，用1 mL移液器充分吹打混匀，取1 mL细胞悬液接种至含9 mL新鲜生长培养基的新p100培养皿中，随后向新培养体系中加入比前一阶段高10–20%浓度的阿法替尼。
    4. 在10–12个月期间，通过逐步剂量递增的方式，将培养基中阿法替尼浓度从0.1 nM逐步提高至1 μM，每次递增幅度为10–20%。
      注意：当阿法替尼浓度接近IC50值时，细胞生长显著减慢。若以1:9比例传代，细胞可能无法增殖，因高浓度阿法替尼会杀死细胞。因此，在较高阿法替尼浓度下，可采用1:2比例进行传代。最耐药的细胞在含阿法替尼的培养基中持续培养3–14天，期间不更换培养基，直至需要传代时才进行更换。
    5. 将获得的阿法替尼耐药细胞在含1 µM阿法替尼的生长培养基中继续培养2–3个月。在1 µM阿法替尼浓度下，该模型建立耐药性通常需要10–12个月。通过MTT实验验证细胞对阿法替尼的耐药性。三个独立建立的阿法替尼耐药细胞系分别命名为AFR1、AFR2和AFR3。

2. 三种独立阿法替尼耐药细胞的表征

  1. PC-9 亲本细胞生长曲线的测定及阿法替尼耐药细胞的建立
    1. 在 37 °C、5% CO2 培养箱中，使用生长培养基培养 PC-9、AFR1、AFR2 和 AFR3 细胞。
    2. 用生长培养基将细胞重悬至 5 × 103 个细胞/mL，每孔接种 100 µL 到 96 孔板中，使细胞终浓度为 500 个细胞/100 µL/孔。
      注意：通过 MTT 法测定第 0、1、2、3、5 和 7 天的 OD570 值。每天需要 6 块 96 孔板。
    3. 每 24 小时进行一次 MTT 检测，分别在第 0、1、2、3、5 和 7 天进行。测定 OD570 值，设置 6–12 个重复；至少重复实验三次，并使用统计软件绘制结果（参见材料表）。
  2. 通过实时 PCR 鉴定 EGFR 基因组 DNA 的改变
    注意：阿法替尼是一种靶向 EGFR 酪氨酸激酶的小分子抑制剂。EGFR 的表达状态需在 DNA 和蛋白水平上进行测定。
    1. 按照试剂盒说明书（参见材料表），使用 DNA 纯化试剂盒提取基因组 DNA。使用分光光度计（参见材料表）测定提取的基因组 DNA 浓度，并将所有基因组 DNA 样品调整至 25 ng/µL。
    2. 使用 SYBR Green 主混合液（参见材料表）扩增 50 ng 基因组 DNA（相当于 2 µL 的 25 ng/µL 储存液），并使用基于荧光的 RT-PCR 检测系统（参见材料表）分析结果。
      注意：PCR 循环条件为：95 °C 初始变性 20 秒，随后进行 40 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 3 秒，60 °C 退火 30 秒。特异性引物序列如下：EGFR F: 5′-CAAGGCCATGGAATCTGTCA-3′，R: 5′-CTGGAATGAGGTGGAGGAACA-3′；标准化基因 LINE-1 F: 5′-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3′，R: 5′-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3′。
  3. 通过 Western 印迹分析评估蛋白改变对 EGFR 水平的影响
    1. 实验前连续用阿法替尼处理细胞 24 小时。用 PBS 洗涤 PC-9、AFR1、AFR2 和 AFR3 细胞两次，然后将其接种于不含阿法替尼的生长培养基中。再用 5 mL 冰冷 PBS 洗涤 PC-9、AFR1、AFR2 和 AFR3 细胞两次。
    2. 使用含 1% 蛋白酶抑制剂混合物（参见材料表）以及磷酸酶抑制剂混合物 II 和 III（参见材料表）的 RIPA 缓冲液裂解细胞，并在 4 °C 下孵育 30 分钟。将裂解液在 4 °C、100 × g 条件下离心 10 分钟，收集上清液。
    3. 使用二喹啉甲酸法（参见材料表）测定蛋白浓度，使用 4× 上样缓冲液（500 mM Tris (pH 6.8)、40% 甘油、8% SDS、20% H2O、0.02% 溴酚蓝）将所有蛋白样品调整至 0.5 或 1 µg/µL，并在 96 °C 下煮沸 5 分钟。将蛋白样品保存于 -80 °C，直至进行 Western 印迹分析。
    4. 使用 8% SDS-PAGE 分离等量蛋白样品（建议 20–30 µL），并将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
      注意：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）常用于实验室中根据蛋白分子量进行分离。
      1. 用乙醇清洗玻璃板并组装玻璃板与垫片。配制含 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）、40% 双丙烯酰胺、10% SDS、10% 过硫酸铵（APS）和 TEMED 的 8% 聚丙烯酰胺凝胶。室温下聚合 30 分钟。
      2. 随后，配制含 0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）、40% 双丙烯酰胺、10% SDS、10% APS 和 TEMED 的浓缩胶。加入浓缩胶溶液，插入梳子，并在室温下聚合 20–30 分钟。
      3. 将凝胶放入电泳装置中，电泳槽内加入电泳缓冲液（0.25 M Tris、1.92 M 甘氨酸、1% SDS）。加入等量蛋白样品（20–30 µL），在 180 V 下电泳。约 60 分钟后，当染料前沿移出凝胶时停止电泳。
      4. 用 TBST 洗涤凝胶 1–2 分钟，然后通过半干转印法（参见材料表）在恒定电流 300 mA 下转印 1.5 小时，将蛋白转移至 PVDF 膜上。
    5. 用含 5% 脱脂奶粉（参见材料表）的 TBST 溶液（参见材料表）在室温下封闭膜 1 小时，然后在 4 °C 下过夜孵育一抗，包括抗 EGFR、抗磷酸化 EGFR（Y1068）、抗 HER2、抗 HER3、抗 MET 和抗肌动蛋白抗体（均按 1:3,000 稀释）（参见材料表）。
    6. 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟，然后在室温下与二抗（按 1:200 稀释于 TBST）孵育 1–1.5 小时。再用 TBST 在室温下洗涤 5 次，每次 10 分钟，加入 ECL 溶液（参见材料表）显色，并通过胶片检测信号。
  4. 通过测序分析 EGFR 突变
    1. 使用 EGFR 外显子 19–21 的特异性引物扩增基因组 DNA。PCR 循环条件为：94 °C 初始变性 1 分钟，随后进行 30 个循环，每个循环包括 98 °C 变性 10 秒、55 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 1 分钟。
      注意：EGFR 外显子 19 的特异性引物：F: 5′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3′，R: 5′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3′；外显子 20：F: 5′-CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC-3′，R: 5′-CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC-3′；外显子 21：F: 5′-ATGAACATGACCCTGAATTCGG-3′，R: 5′-GCTCACCCAGAATGTCTGGAGA-3′。
    2. 使用 PCR 纯化试剂盒（参见材料表）纯化扩增的 PCR 产物，并对扩增子进行测序。

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结果

通过逐步剂量递增法从PC-9细胞建立三种阿法替尼耐药细胞系的示意图见图1。图2显示，随着阿法替尼浓度的增加，亲代PC-9细胞的增殖能力下降，表明PC-9细胞对阿法替尼敏感。图3展示了三种细胞系的阿法替尼耐药性。在阿法替尼处理下，三种阿法替尼耐药细胞系AFR1、AFR2和AFR3均未出现细胞增殖抑制现象。图4显示了PC-9、AFR1、AFR2和AFR3细胞的细胞增殖曲线。三种阿法替尼耐药细胞系的生长速度显著慢于亲代PC-9细胞。图5展示了PC-9细胞及三种阿法替尼耐药细胞中EGFR基因组DNA（gDNA）的表达水平，结果表明阿法替尼耐药细胞中EGFR gDNA的表达水平显著高于亲代PC-9细胞。图6展示了PC-9细胞和阿...

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讨论

本文描述了一种建立三种独立的阿法替尼耐药细胞系的方法，并通过与亲代PC-9细胞比较对这些细胞进行了表征。通过逐步增加药物浓度的暴露方式，亲代PC-9细胞在10至12个月内获得了对阿法替尼的耐药性。临床上，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR TKIs）的耐药机制具有异质性，因此在初始阿法替尼处理后，将PC-9细胞分为三个独立的p100培养皿并继续暴露于阿法替尼中。最初，细胞生长未显著减缓，但当药物浓度接近半数抑制浓度（IC50）时，细胞增殖速度减慢。这是获得对抑制剂具有获得性耐药细胞的关键步骤。增殖中的细胞应以1:10或1:5的比例传代并转移至新的p100培养皿中。当PC-9细胞在p100培养皿中培养时，可观察到部分贴壁现象，但大多数细胞以悬浮状态生长。随着阿法替尼浓度的升高，细胞逐渐贴附于组织培养处理过的培养皿底部。若大多数细胞呈贴壁状态，可用细胞刮棒将其脱离。阿法替尼的最终浓度为1 µM，约为最大血药浓度（Cmax）的5倍14。为了在亲代细胞与耐药克隆之间获得明显差异，最终浓度设定为高于Cmax。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢先进癌症转化研究所成员提出的宝贵意见，以及 Editage 在英文语言编辑方面的帮助。本研究由日本学术振兴会科学研究费补助金（JSPS KAKENHI，资助编号：16K09590，负责人：T.Y.）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿法替尼SelleckS1011
抗EGFR单克隆抗体Cell Signaling Technology4267S
双辛可宁酸测定法SigmaB9643
细胞培养处理的10 cm培养皿Violamo2-8590-03
CELL BANKER1 TakaRaCB011冻存培养基
CellTiter 96Promega G4100 非放射性细胞增殖检测试剂盒；染料溶液和溶解/终止溶液
DMSOWako043-07216
ECL溶液Perkin ElmerNEL105001EA
FBSGibco26140-079
GeneAmp 5700Applied Biosystems基于荧光的RT-PCR检测系统 
GraphPad Prism v.7 软件 GraphPad, Inc.一种统计学软件
NanoDrop Lite分光光度计Thermo分光光度计
脱脂干奶粉Cell Signaling Technology9999S
青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）Gibco15140-163
磷酸酶抑制剂混合物2SigmaP5726
磷酸酶抑制剂混合物3SigmaP0044
Powerscan HT微孔板读数仪BioTek
 Power SYBR Green预混液 Applied BiosystemsSYBR Green预混液
蛋白酶抑制剂混合物SigmaP8340
QIAamp DNA Mini试剂盒Qiagen51306DNA纯化试剂盒
QIAquick PCR纯化试剂盒QIAGENPCR纯化试剂盒
RPMI-1640 Wako189-02025含L-谷氨酰胺和酚红
TBST粉末SigmaT9039
Trans-Blot SD半干电泳转移系统Bio-Rad半干式转移装置
96孔微孔板Thermo130188

参考文献

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