方法文章

建立和表征三个抗阿法替尼的肺腺癌PC-9细胞系与增加剂量的阿法替尼开发

DOI：

10.3791/59473

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2019年6月26日

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1Advanced Cancer Translational Research Institute, Showa University, 2Division of Breast Surgical Oncology, Department of Surgery, Showa University School of Medicine, 3Division of Allergology and Respiratory Medicine, Department of Medicine, Showa University School of Medicine

本文内容

摘要

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开发了一种从肺腺癌PC-9细胞中建立抗阿法替尼细胞系的方法,并对抗性细胞进行了特征描述。该耐药细胞可用于研究表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抑制剂机制,适用于非小细胞肺癌患者。

摘要

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分子靶向抑制剂的习得抗药性是癌症治疗中的一个严重问题。在大多数国家,肺癌仍然是导致癌症相关死亡的主要原因。发现"致癌驱动因素突变",如表皮生长因子受体(EGFR)-激活突变,以及随后开发EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)(gefitinib,erlotinib,近几十年来,阿法替尼、达科米尼布和奥西米替尼的肺癌治疗发生了戏剧性的变化。然而,这些药物仍然不能有效在非小细胞肺癌(NSCLC)携带EGFR激活突变的患者。在获得抗药性后,NSCLC的系统性进展仍然是治疗EGFR突变阳性NSCLC患者的重大障碍。在这里,我们提出了一个逐步剂量升级方法,用于从NSCLC PC-9细胞中建立三个独立的获得性阿法替尼耐药细胞系,在EGFR exon 19中携带EGFR-激活突变的15碱基对。简要介绍了三个独立的阿法替尼-抗细胞系的特征化方法。EGFR TKIs 的后天电阻机制是异构的。因此,必须检查对EGFR-TKIs具有获得性强的多个细胞系。使用这种循序渐进的剂量升级方法,需要10到12个月才能获得具有获得性耐药性的细胞系。发现新的后天抵抗机制将有助于制定更有效和安全的治疗策略。

引言

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五种酪氨酸激酶抑制剂,靶向表皮生长因子受体(EGFR),包括格菲替尼、埃尔洛替尼、阿法替尼、达科米替尼和奥西米替尼,目前可用于治疗EGFR突变阳性非小细胞肺患者癌症(NSCLC)。在过去的十年中,随着新的潜在EGFR-TKIs的发现,针对此类患者的疗法得到了巨大的发展。在肺腺癌患者中,大约50%的亚洲人和15%的白种人患者中,在EGFR中发现细胞突变。EGFR中最常见的突变是EGFR外电21和15碱基对(bp)缺失中的EGFR外电192中的L858R点突变。在NSCLC的EGFR突变阳性患者中,EGFR-TKIs比以前的铂双子化疗3标准提高了反应率和临床结果。

格菲替尼和埃尔洛替尼是第一批经批准的小分子抑制剂,通常被称为第一代EGFR TKIs。这些EGFR TKI通过与ATP竞争和逆向结合到ATP结合位点4来阻止酪氨酸激酶活性。阿法替尼是第二代EGFR TKI,不可逆转和共价结合于EGFR的酪氨酸激酶域,并被定性为泛人EGFR家族抑制剂5。

尽管这些疗法在NSCLC患者中具有显著的好处,但获得抗药性是不可避免的。对第一代和第二代EGFRTKIs最常见的抗药性机制是E....

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方案

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1. 建立三个独立的抗阿法替尼PC-9细胞系

  1. 使用3-(4,5-二甲基硫磷-2-yl)测定PC-9细胞的初始阿法替尼暴露浓度-2,5-二苯基四甲二甲二苯溴二甲二甲二甲苯(MTT)测定
    1. 在生长培养基中培养PC-9细胞,含有胎儿牛血清(10%)、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100微克/mL),在37°C的5%CO2培养箱中处理10厘米的培养皿中。
    2. 在生长培养基中重新悬浮PC-9细胞,在生长培养基中重新悬浮4×104细胞/mL,然后在96孔微孔盘中以50μL/孔播种。细胞的最终浓度为2.0 x 103细胞/50μL/井。在 37°C 的5% CO2 培养箱中孵育过夜。
    3. 在不同浓度下加入50 μL的阿法替尼溶液:0、0.002、0.006、0.02、0.06、0.2、0.6、2、6和20 μM,以含有生长培养基(50μL)的井。阿法替尼的最终体积和浓度分别为100μL和0,0.001,0.003,0.01,0.03,0.1,0.3,1,3和10μM。
    4. 在 37°C 的 5% CO2培养箱中孵育 96 孔板 96 小时。
    5. 向每口井添加15μL染料溶液(见材料表),在37°C的5%CO2培养箱中孵育4小时,然后向....

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结果

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图1显示了使用分步剂量升级程序从PC-9细胞中建立三个阿法替尼-抗细胞系的架构。图2显示,随着阿法替尼浓度的增加,父母PC-9细胞的细胞增殖减少,表明PC-9细胞对阿法替尼暴露敏感。图3显示了三个细胞系的阿法替尼抗性。三种抗阿法替尼细胞系AFR1、AFR2和AFR3均未显示在阿法替尼暴露下抑制细胞增殖。图 4显示了 PC-9、AFR1、AFR2 和 AFR3 细胞的细胞增殖曲线。三个抗阿法替尼细胞系的生长明显慢于亲亲PC-9细胞。图5显示了PC-9和三个抗阿法替尼细胞中EGFR gDNA的表达水平,这表明抗阿法替尼细胞表达的EGFR gDNA水平明显高于亲亲PC-9细胞。图6显示了PC-9和抗法替尼细胞中EGFR的蛋白.......

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讨论

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在这里,我们描述了一种建立三个独立的抗阿法替尼细胞系的方法,并通过与亲的PC-9细胞进行比较来对这些细胞进行特征化。通过逐步剂量升级暴露,父母PC-9细胞在10-12个月内获得对阿法替尼的抵抗力。临床上,EGFR TKIs的抗性机制是异质的,因此,在使用阿法替尼进行初步治疗后,PC-9细胞被分成三个独立的p100碟,并进一步暴露在阿法替尼。最初,细胞生长没有显著减缓,但随着药物浓度接近IC50值,细胞增殖减缓。这是获得对抑制剂的后天抗性细胞的关键步骤。增殖细胞应以1:10或1:5的比例分裂并转移到新的p100盘。当PC-9细胞在p100盘中培养时,观察到一些粘附性,但大多数细胞在悬浮中生长。随着阿法替尼浓度的增加,细胞粘附在组织培养处理的菜肴的底部。如果大多数细胞是附着的,它们可以通过细胞刮刀分离。阿法替尼的最终浓度为1μM,约为血清最大浓度(C最大值)14的5倍。为了获得亲子克隆和抗性克隆之间的明显差异,最终浓度设置为高于C最大值。

即使 RPMI-1640 含有青霉.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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我们感谢高级癌症转化研究所的成员,感谢他们在英语编辑方面给予的周到评论和编辑。这项工作得到了JSPS KAKENHI(赠款编号:16K09590到T.Y.)的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿法替尼SelleckS1011
抗 EGFR 单克隆抗体细胞信号传输技术4267S
二辛可宁酸测定sigmaB9643
细胞培养物处理的 10 cm 培养皿Violamo2-8590-03
细胞BANKER1 TakaRaCB011冻存培养基
CellTiter 96Promega G4100 非放射性细胞增殖测定;染料溶液和增溶/终止液
DMSOWako043-07216
ECL 溶液Perkin ElmerNEL105001EA
FBSgibco26140-079
GeneAmp 5700Applied Biosystems基于荧光的 RT-PCR 检测系统 
GraphPad Prism v.7 软件 GraphPad 公司统计软件
NanoDrop Lite 分光光度计热分光光度计
脱脂奶粉细胞信号传输技术9999S
Pen Strepgibco15140-163
磷酸酶抑制剂混合物 2西格玛P5726
磷酸酶抑制剂混合物 3西格玛P0044
Powerscan HT 微孔板检测仪BioTek
 Power SYBR Green 预混液 Applied BiosystemsSYBR Green 预混
蛋白酶抑制剂混合物SigmaP8340
QIAamp DNA 小量试剂盒Qiagen51306DNA 纯化
试剂盒 QIAquick PCR 纯化试剂盒QIAGENPCR 纯化试剂盒
RPMI-1640 Wako189-02025与 L-谷氨酰胺和酚红
TBST 粉末sigmaT9039
Trans-Blot SD 半干电泳转移池Bio-Rad半干 t4ransfer 装置
96 孔微孔板Thermo130188
液

参考文献

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  1. Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
  2. Mitsudomi, T., Yatabe, Y.

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标签

PC 9 EGFR MTT EGFR DNA

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