方法文章

在单轴拉伸应变下单个活细胞核动力学的高分辨率成像

DOI：

10.3791/59474

⸱

2019年6月2日

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1BioSystems and Micromechanics Interdisciplinary Research Group, Singapore-MIT Alliance for Research and Technology, CREATE, 2Department of Material Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

本文内容

摘要

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利用先前设计的装置对贴壁细胞施加机械应变，本文描述了一种重新设计的基质几何结构以及一种定制设备，可用于使用100倍油浸物镜对受应变细胞进行高分辨率单细胞成像。

摘要

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已知细胞外机械应变可引发细胞表型响应，并在多种组织系统中具有生理相关性。为了通过生化检测在体外捕获施加的细胞外张应力对细胞群体的影响，此前已设计出一种装置，该装置结构简单、易于制备，且体积足够小，可放入组织培养孵育箱内，也可置于显微镜载物台上。然而，先前设计的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底不支持通过油浸物镜进行高分辨率亚细胞成像。本研究描述了一种重新设计的聚二甲基硅氧烷基底几何结构以及一种定制的成像系统，二者结合可在施加应变的同时实现活细胞的高分辨率亚细胞成像。该基底可与先前设计的同一装置配合使用，因此除支持高分辨率光学成像外，仍具备上述所有优点。通过在基底中引入网格结构，可进一步优化聚二甲基硅氧烷基底的设计，便于在施加应变前后追踪同一细胞。代表性结果展示了利用本文所述方法获取的受应变细胞中荧光标记细胞核的高分辨率延时成像。这些细胞核动态数据为张应力促进少突胶质前体细胞分化的机制提供了深入见解。 

引言

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机体内的细胞和组织会受到各种力学信号的作用，包括拉伸应变。然而，这些力学信号对神经细胞生物学特性的影响尚未得到充分研究和深入理解。在中枢神经系统中，力学应变的来源包括发育过程中的生长1,2,3,4、生理过程（如脊髓弯曲、血液和脑脊液搏动）以及病理状态（如创伤、轴突肿胀、胶质瘢痕或肿瘤生长）5,6,7,8。研究拉伸应变如何影响少突胶质细胞的分化及其后续对轴突的髓鞘化过程具有重要意义，因为这一过程在脊椎动物的中枢神经系统中至关重要。以往的研究9,10利用定制的拉伸装置和弹性多孔培养板表明，静态单轴拉伸可通过基因表达的整体变化促进少突胶质细胞的分化10。为了进一步阐明这些细胞中力学应变转导的机制，有必要对先前的实验装置进行重新设计，以便在拉伸条件下对活细胞的核动态进行....

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方案

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1. 用于高分辨率成像的单孔聚二甲基硅氧烷模具设计

注意：用于制造聚二甲基硅氧烷平板的模具设计具有以下特征，以支持使用100倍油浸镜头成像，并确保与定制应变装置的正确匹配（图1A、B）。

  1. 保持整体载物板的尺寸，使其能够适配应变装置的夹具。
    注：此处尺寸为 60 mm × 73 mm。
  2. 设计一个细胞培养腔室或孔，其横向尺寸应显著小于整个载物板的尺寸，以避免在施加应变时聚二甲基硅氧烷（PDMS）载物板未夹持边缘处产生电弧（面外弯曲）效应。
    注：此处腔室设计为 23 mm × 23 mm 的正方形。
  3. 细胞培养腔室的深度应尽可能小（不超过 80 µm），以便通过置于腔室上方的盖玻片，使用 100 倍油浸物镜进行聚焦，同时深度需足以容纳培养基，并避免接触或挤压细胞。
  4. 将细胞培养腔室置于一个高度为 3 mm 的正方形基座上，使细胞在倒置显微镜系统中更接近物镜，便于聚焦。
    注：具有上述特征的模具可通过多种技术制造，例如铣削铝材。或者，也可使用激光切割的丙烯酸板、用于细胞腔室的 #0 盖玻片和超级胶水组装母模。该母模用于制作聚二甲基硅氧烷（PDMS）印模，再通过浇铸树脂制备工作模具。

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结果

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近期研究旨在探究张应力对少突胶质细胞的影响10，结果表明，10%的单轴张应力可通过全局性基因表达变化促进少突胶质细胞前体细胞的分化。这些基因表达变化背后的机制可通过成像技术检测亚细胞参数来探究，例如细胞骨架结构、转录因子定位、细胞核动态以及染色质组织。然而，此前使用的聚二甲基硅氧烷基底的几何结构不支持高分辨率的单细胞成像。如本研究所述，重新设计的聚二甲基硅氧烷基底几何结构与成像装置显著缩短了细胞与物镜之间的距离，从而可利用100倍油浸物镜捕获荧光标记细胞核的时间序列图像（图6A）。

细胞核投影面积的波动程度取决于细胞的分化状态11,12。少突胶质前体细胞与终末分化少突胶质细胞的细胞核波动情况比较显示，后者波动显著降低（

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讨论

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此前已设计出一种用于对贴壁细胞施加细胞外张应力的装置1。在之前的研究中，聚二甲基硅氧烷基底的设计足以满足生化检测以及对拉伸细胞进行低分辨率成像的需求。在本研究中，对该基底进行了重新设计，并引入了一种新型成像构型，可实现高分辨率的亚细胞活细胞成像。该系统具有诸多优势：可在实验室内使用简单组件自行搭建，与商用应变装置相比成本低廉（每台细胞应变装置约500美元），且体积小巧，可放入组织培养孵育箱内，并适配于显微镜。此外，尽管本文所述成像系统采用倒置显微镜配置，但也可方便地调整为正置显微镜配置。

样本制备和成像过程中有几个关键步骤需要注意。首先，在接种细胞前（方案步骤2.8），必须彻底清洁聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane）平板和方形腔室，以确保细胞存活（因为未固化的聚二甲基硅氧烷对细胞具有毒性）。其次，由于方形腔室内可容纳的液体培养基体积小于1 mL，若样品在培养箱中放置数天，培养基可能发生蒸发。因此，必须每天检查培养基情况，并在需要时及时补充。此外，可将一个倒置的直径60 mm塑料培养皿覆盖在聚二甲基硅氧烷平板的凸起.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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所有作者均感谢新加坡国家研究基金会通过新加坡-麻省理工学院科研与技术联盟（SMART）生物系统与微机械（BioSyM）跨学科研究小组提供的资金支持。Jagielska 博士和 Van Vliet 博士还感谢 Saks-Kavanaugh 基金会提供的资金与支持。作者感谢新加坡南洋理工大学的 William Ong 和 Chew Sing Yian 博士为本研究中部分实验提供了大鼠少突胶质前体细胞；同时感谢新加坡国立大学生物力学研究所的 G. V. Shivashankar 博士就核面积波动问题进行的讨论。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
原代细胞从新生大鼠中分离的原代少突胶质前体细胞
由新加坡南洋理工大学S. Y. Chew博士实验室提供
培养基
DMEM高 糖Gibco11996-065-500ml
青霉素-链霉素（Pen/Strep）Gibco15070-063-100ml
FGFProspecCYT-608-50ug
PDGFProspecCYT-776-10ug
培养基储备液组分
BSASigmaA9418-10G
孕酮SigmaP8783-1G
腐胺SigmaP5780-5G
亚硒酸钠SigmaS5261-10G
三碘甲腺原氨酸SigmaT6397-100MG
甲状腺素SigmaT1775-100MG
全转铁蛋白SigmaT0665-500MG
胰岛素SigmaI9278
模具与PDMS平板
PDMS - Dow Corning Sylgard 184Ellsworth184 SIL ELAST KIT 0.5KG
模具 - 液态塑料Smooth-OnSmooth Cast 310 - 试用装
基底包被
多聚-D-赖氨酸SigmaP6407-5MG
纤连蛋白SigmaF1141-2MG
组蛋白染色
CellLight H2B-GFP BacMamMolecular ProbesC10594
表面功能化
APTESSigmaA3648-100ml
BS3Covachem13306-100mg
HEPES缓冲液 pH 8.0Alfa AesarJ63578-AK-250ml
细胞解离
AccutaseInvitrogenA1110501-100ml

参考文献

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  1. Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
  2. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).

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