本文介绍了一种高效结合连续块面扫描与聚焦离子束扫描电子显微镜的技术方案，用于定位目标区域。该方法可在大视野范围内实现三维空间中稀有事件的高效搜索与精确定位。
本文内容
摘要
摘要
本方案可实现对细胞或组织样本在电子显微镜分辨率水平上的高效、有效的三维成像。多年来，电子显微镜（EM）本质上一直是一种二维技术。随着连续扫描电子显微镜成像技术（体积电子显微镜，volume EM）的发展，通过集成切片机或聚焦离子束对包埋组织进行逐层切割并成像，第三维度变得易于获取。连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）采用封闭在扫描电镜腔室内的超薄切片机，能够处理较大的样品（1,000 µm × 1,000 µm），并在较小的X、Y像素尺寸下成像大视野区域，但在Z轴方向上受限于金刚石刀片的性能。聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）在三维分辨率上无此限制（可实现≤5 nm的各向同性体素），但其成像视野要小得多。本方案展示了一种结合这两种技术的工作流程，可在大视野中定位特定兴趣区域（ROIs），随后对目标体积进行高各向同性体素分辨率的成像。由于体积电子显微镜技术需要更强的对比度以在扫描电镜成像中有效产生信号，因此固定细胞或组织的制备要求更高。此类制备流程耗时且劳动强度大。本方案还引入了微波辅助组织处理技术，以促进试剂渗透，将原本需要数天的处理时间缩短至数小时。
引言
本方案描述了一种高效地将高分辨率三维电子显微镜（EM）技术应用于特定感兴趣区域（ROI）的工作流程。自20世纪30年代问世以来，电子显微镜本质上是一种二维技术。最早的图像为完整组织或细胞的成像，但很快被使用超薄切片机手工切割的切片所取代，并通过透射电子显微镜（TEM）进行成像。TEM可产生极高分辨率的显微图像，甚至最微小的细胞结构也清晰可辨。然而，为使组织能够被电子束成像，所需切片极薄，导致Z轴方向的信息极为有限。由于细胞本身是三维结构，细胞内部结构之间以及细胞表面之间的相互作用只能基于有限的数据进行推断，这增加了误判的可能性，尤其是在结构复杂的区域。一些显微技术研究者通过连续切片法对细胞和组织进行切片，再 painstakingly（ painstakingly 指极其费力地）从单个TEM图像中重建三维结构，从而获得更准确的三维构象1。这一过程极为耗时耗力，在数字成像和计算机三维重建技术出现之前，其结果也难以直观呈现。近年来，两种新技术相继问世，统称为体积电子显微镜技术（volume EM）2，使得三维电子显微镜技术得以在更多实验室中推广应用。
利用电子显微镜对包埋样品块进行连续成像以获得图像序列的构想，最早可追溯至1981年，当时Steve Leighton和Alan Kuzirian研制出一种微型切片机，并将其置于扫描电子显微镜的样品室中3（SBF-SEM）。这一原型机在23年后被Denk和Horstmann复制并改进4，随后实现了商业化。几乎在同一时期，生物学家开始关注另一种主要应用于材料科学的技术——聚焦离子束。该技术利用某种离子束（如镓离子束或等离子体）从样品表面去除极少量材料（FIB-SEM）5。这两种技术均采用先切片后成像的方式，获得一系列图像，进而组合成X、Y、Z方向的图像堆栈。两种方法均可提供三维信息，但分辨率尺度不同。SBF-SEM受限于金刚石刀具的物理特性，在长时间连续成像过程中切片厚度无法薄于50 nm；然而其可切片的样品块尺寸较大，最大可达1 mm × 1 mm × 1 mm。由于背散射电子探测器具有较大的数字采集格式（32k × 32k像素），且信号来自样品块表面，因此图像像素尺寸可小至1 nm。这导致体素呈现非各向同性，即X、Y方向的尺寸通常小于Z方向。由于离子束具有更高的精度，FIB-SEM能够获取体素尺寸≤5 nm的各向同性图像。然而，其可成像的总体积非常有限。此前已有文献发表过关于两种技术所成像的不同样品及其成像体积的汇总表格3。
体积电子显微镜（volume EM）的组织制备比标准透射电子显微镜（TEM）或扫描电子显微镜（SEM）更为困难，因为样品必须经过染色以在SEM中产生足够的信号。通常，染色方案不仅需要针对特定组织类型进行优化，还需增强某些细胞结构的对比度，以便于识别与三维重建。本文所采用的方案基于NCMIR标准6。额外的染色步骤通常意味着需要增加操作流程。因此，对于体积电子显微镜，标准方案需要加以扩展，以确保试剂有足够时间渗透样品。微波辅助处理可将染色所需时间从数小时缩短至数分钟，显著提高体积电子显微镜样品制备的效率7。该方法适用于所有类型的细胞和组织8，也适用于那些因组织异质性而必须对特定区域进行取样的研究问题9。
获得数据堆栈后，可对其进行对齐，并将感兴趣结构从其余数据中分割出来，进而进行三维建模。尽管对组织多个切片的成像自动化已使图像采集相对简便，但数据的数字重建与可视化过程仍耗时较长。目前尚无集成化或完全自动化的软件来完成此项工作。由于早期采用体电子显微镜（volume EM）的研究主要集中于神经科学领域，因此针对轴突等结构的染色及数字分割技术已相对成熟，而其他细胞和细胞器的相关技术则较为滞后。尽管关于非神经组织的研究文献正在迅速增加，但针对非线性或不规则结构的处理仍需要更多人工干预。
结合使用 SBF-SEM 和 FIB-SEM 是一种有效的方法，可用于在三维空间中以高分辨率定位并成像特定的非均质组织结构。将该方法与微波辅助组织处理技术相结合，可显著缩短样品制备所需时间。这一整合的工作流程将使精细结构的高分辨率各向同性体素图像数据集的生成变得更加高效和快速。
方案
1. 用于电子显微镜的样品固定与处理
- 固定幼苗 拟南芥 在含有0.5%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（PB，pH 6.8）中，于室温（RT）条件下在琼脂平板上培养2小时。
警告：醛类物质具有刺激性和腐蚀性，并可能具有致癌、致突变和致畸作用。所有溶液均须在通风橱中操作，并使用适当的个人防护装备。 - 切取步骤1.1中生长的植物根尖，将2-3个根尖放入含有相同固定液的0.5 mL离心管中，4 °C过夜。
注意：本步骤及后续所有步骤中溶液的体积由样本体积决定；样本与溶液的最小比例为10:1。任何维度超过1 mm的样本将难以染色，因此处理较大的组织块更为困难。不同组织的特性并不相同；例如，植物叶片和茎秆可能较难染色。若需处理较大样本或难以染色的组织类型，应在进行数据采集前优化样本处理条件。 - 制备硫羰基肼（TCH）溶液，该溶液需在步骤1.7之前新鲜配制并备用。将0.1 g硫羰基肼加入10 mL双蒸水（ddH₂O）中2O），在60 °C烘箱中加热1小时使其溶解。使用前，用0.22 µm注射器滤器过滤TCH溶液。
- 从离心管中移除固定剂，加入0.1 M磷酸缓冲液（pH 6.8）。将离心管置于转速为100 rpm的水平摇床中，洗涤10分钟。用新鲜的PBS重复洗涤5次。
- 用2%四氧化锇（OsO₄）替代PB，固定根尖4）以及含0.2% 钌红的0.1 M PB（pH 6.8）。将试管开盖放入微波炉中，启动程序9（表1).
警告：锇在摄入时具有极高毒性，吸入时具有严重毒性，皮肤接触时具有毒性。操作时务必使用适当的个人防护装备，并在通风橱中进行。
注意：在整个实验过程中，进行微波处理步骤时，试管的管盖应始终保持打开状态。 - 用ddH₂O洗涤根尖两次2O，每次5分钟，置于台面上。对于第三和第四次 ddH2O型洗涤，使用微波炉程序15（表1）。在最初的40秒ddH₂O之后2O 洗涤，将样品从微波炉中取出，并用新鲜的 ddH₂O 更换缓冲液2将样品重新放入微波炉，并继续运行程序。
注意：当缓冲液需要更换时，微波炉会发出警报。每次务必正确安装真空室的盖子。 - 将样本在预先配制的TCH溶液中于室温下在实验台上孵育2分钟，随后使用微波程序8进行进一步孵育。表1）。在实验台和微波炉之间操作时，不要更换溶液。
- 按照步骤1.6中所述清洗样品。
- 将样品置于1% OsO₄中4 在 ddH₂O 中2O 用于微波程序 9（表1).
- 按照步骤1.6中所述清洗样品。
- 在 ddH₂O 配制的 1% 醋酸铀中孵育样品2O 使用微波程序16（表1).
警告：醋酸铀酰具有毒性，为刺激性物质，且具有致癌、致突变和致畸风险。操作时务必使用适当的个人防护装备。 - 按照步骤1.6中所述清洗样品。
- 在步骤1.14中使用前，配制Walton's lead溶液。首先配制L-天冬氨酸储备液：将0.998 g L-天冬氨酸加入250 mL ddH₂O中2O，并用1 M KOH将pH值调节至3.8。接着，将0.066 g硝酸铅溶解于10 mL L-天冬氨酸储备液中，并调节pH至5.5。将溶液置于60 °C烘箱中静置30分钟。
注意：不应形成沉淀。 - 在60 °C烘箱中，将样品置于Walton's lead溶液中孵育30分钟。
- 按照步骤1.6所述清洗样品。
- 使用ddH₂O配制的50%、70%、90%乙醇，按梯度步骤对样品进行脱水处理2O，然后在100%乙醇中重复2次。使用微波程序10（表1）微波炉将每40秒提示用户更换为下一梯度的乙醇溶液。此步骤为微波处理的最后一步。
- 在室温下，用100%丙烯氧化物进一步脱水处理2次，每次10分钟，每次更换溶液。
注意：环氧丙烷可溶解某些塑料（如聚苯乙烯）；建议此步骤使用玻璃瓶，或预先测试塑料的耐受性。
警告：环氧丙烷高度易燃。务必在通风橱中操作，并使用适当的个人防护装备。 - 通过在50% Spurr树脂与丙酮的混合液中孵育（至少2小时），开始根尖的浸透。
警告：Spurr 树脂组分具有刺激性。操作时务必使用适当的防护装备，并在通风橱中进行。 - 更换为100% Spurr’s溶液，在室温下静置过夜。
- 更换为新鲜的100% Spurr树脂，重复2次（每次至少孵育2小时）。
- 将样品放入包埋模具中，模具内再次加入新鲜的100% Spurr树脂，于65 °C烘箱中聚合36−48 h。
注意：所使用的包埋模具取决于组织类型及成像方法。此处使用了平底硅胶包埋模具（图1A).
2. 准备包埋样品以进行成像
- 从烘箱中取出样品，将树脂从包埋模具中取出（图1B）。
- 使用剃刀刀片将样品粗略修整为最大尺寸为 0.5 mm × 0.5 mm × 0.5 mm 的块状（图1C）。
注意：为防止在 SBF-SEM 中产生电荷积累，应尽可能去除多余的裸露树脂，并使样品尽可能平坦和薄。理想情况下，块状样品的所有侧面均应含有组织，但最重要的是将要连接到金属针上的那一侧（见步骤 2.3）必须暴露组织，以确保组织与导电金属直接接触。 - 将样品从多余的树脂中分离，并使用导电环氧树脂将其固定在金属针上（图1D），确保部分组织与金属针接触。将环氧树脂在 65 °C 的烘箱中固化过夜。
注意：请确保样品位于金属针的中心位置，因为 SB-SEM 中载物台的移动范围有限。去除包裹样品的多余树脂时可能较为困难，因为微小的样品在脱离时容易飞散。一个简单有效的解决方法是如参考文献1的补充视频所示，用一层石蜡膜覆盖样品。 - 将载体固定在超薄切片机的持样器上。使用剃刀刀片去除多余的环氧树脂，并利用超薄切片机和金刚石刀修平块状样品的表面和侧面，形成金字塔形。确保至少部分组织已在块面暴露。
注意：使用金刚石刀进行修整是可选的额外步骤，但它能使后续在 SBF-SEM 中的接近操作更加容易，因为金刚石刀在块面上的阴影更清晰，有助于更准确地判断刀与块面之间的距离。 - 将修整好的样品块放入溅射镀膜仪中，用一层薄铂（Pt）膜（2−5 nm）对样品进行镀膜。
注意：在 SBF-SEM 的接近过程中（见下文），块面上的铂层将被切除，但金字塔侧面的铂层可提供额外的导电性。本示例中使用铂进行镀膜，但金或金/钯合金同样有效；然而，使用金镀膜会在成像过程中导致块面上产生更多碎屑。
3. SBF-SEM 中的成像
- 将载样台插入SBF-SEM显微镜中，并将刀片移近样品表面。使用金刚石刀切去样品上部，使铂层已被完全去除，并至少部分暴露组织。
注意：由于不同SBF-SEM显微镜的操作流程有所不同，此处未详述每一步骤。只要样品表面已无铂层且准备就绪可用于成像，即可进行后续步骤。 - 以低分辨率和短停留时间开始成像，以获取样品的整体概览并定位感兴趣区域（图1E）。
注意：本示例中，使用512 × 512像素和1 µs停留时间进行快速扫描和载物台定位，使用2,000 × 2,000像素和1 µs停留时间优化成像窗口并调整焦距。 - 在1.5–2.0 kV的加速电压和80–100 pA的束流下，采集组织图像。
注意：本示例在高真空系统中成像，需调节束流以最小化充电效应，该效应高度依赖于样品特性。通常电子束设定为1.5–2.0 kV，但具体参数需根据样品调整。在较高放大倍数下（通常> 10,000倍），树脂受电子束影响过大，难以保证切片平整，因此通常将像素尺寸设定为8–20 nm，图像尺寸为8,000–10,000 × 8,000–10,000像素，对应放大倍数为430–1,400倍，视场尺寸分别为64 × 64 μm和200 × 200 μm。 - 确定感兴趣区域，决定需要采集多少连续切片以覆盖目标体积，并使用背散射电子探测器开始成像运行。
注意：本示例中，共采集500个80 nm厚的切片，每个图像的像素尺寸为10 nm，图像尺寸为10,000 × 10,000像素（停留时间为1 µs）。显微镜参数设定为1.6 kV和100 pA。通常，切片数量取决于样品和感兴趣区域的大小，可从数百至数千个连续切片不等。最终数据集包含每个切片的单幅图像，这些图像需被整合为三维图像堆栈。
4. SBF-SEM 数据处理
- 使用 Fiji，选择“文件-导入-图像序列”并定位图像堆栈以加载图像。根据数据集的大小，勾选“使用虚拟堆栈”选项。
注意：如果数据集非常大，首先将其转换为 8 位（如果原始数据为 16 位），并在必要时对数据进行 binning 处理，直到其大小可被有效处理。 - 使用图像底部的播放按钮滚动浏览数据集，检查成像运行是否成功。查找 SBF-SEM 的典型成像伪影，例如切片从块面刀口脱落、裸露树脂区域的电荷积累、刀具切割伪影（图像上的水平线）。
- 使用“图像-属性”命令，调整成像过程中使用的像素大小和体素深度（即切片厚度）。如果数据已经过 binning 处理，需将此因素考虑在内。
- 使用“插件-配准-使用 SIFT 进行线性堆栈配准”命令对数据进行配准。
注意：SBF-SEM 数据需要配准，因为在成像过程中由于电荷积累或样品漂移可能导致样品发生轻微移动。由于这种移动在 XY 方向上极小，仅需进行平移配准即可。 - 通过滚动浏览数据集检查配准效果，若结果满意，则使用“文件”菜单下的“保存”命令，将配准后的数据集保存为 3D-tif 文件。
- 仔细分析数据集，确认是否包含感兴趣区域（ROI），并判断其是否包含回答生物学问题所需的信息。在堆栈的最后一张图像（即当前块面）上，选择用于 FIB-SEM 成像的新 ROI。
注意：如果当前块面上没有适合进行 FIB-SEM 成像的区域，可继续从仍在 SBF-SEM 中的样品块上切割更多切片，直至出现合适的 ROI。FIB 成像的体积存在限制，SBF-SEM 图像上的 ROI 在 X、Y 方向最大为 30–40 µm × 15–20 µm。
5. 在聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）中成像
- 在SBF-SEM中对样品进行整体成像，理想情况下应包含一个或多个在FIB-SEM中可识别的样品边缘（图2A，C）。
注意：在此示例中，SBF-SEM的整体图像采集参数为10 nm像素尺寸、8,000 × 8,000像素、驻留时间为1 µs。显微镜仍设置为1.6 kV和100 pA。 - 将样品从SBF-SEM中取出并放入溅射镀膜仪中。使用≥20 nm厚度的铂进行镀膜，以用于FIB-SEM成像。
- 将样品装入FIB-SEM，使用二次电子探测器在15 kV、1 nA条件下，在块面（block-face）上定位在SBF-SEM中确定的兴趣区域（ROI）（图2B，D）。
注意：必须在15 kV下成像，以便穿透铂涂层。 - 通过移动和倾斜样品台，将样品上的兴趣区域（ROI）调整至FIB与SEM电子束的共焦点位置（图3A）。
注意：FIB柱通常以一定角度安装（图3A）。这意味着样品必须倾斜，使待成像和切片的表面与FIB束平行。此时该表面相对于SEM束呈倾斜状态，因此在SEM能够成像ROI之前，需要先去除一部分组织形成沟槽（图3E）。 - 利用FIB束和气体注入系统，在ROI上方表面沉积一层1 μm厚的铂保护层（图3C）。随后使用较低的铣削电流（50–100 pA），在铂沉积层上铣出细线，用于成像过程中的自动对焦和三维追踪（图3D）。再通过FIB柱和碳气体注入器，将这些细线覆盖上碳沉积层。
注意：此处ROI的尺寸应与SBF-SEM图像中的ROI尺寸相对应，最大尺寸通常为30–40 µm × 15–20 µm。本示例中成像的ROI尺寸为17 µm × 8 µm。碳沉积用于保护细线，并在碳与铂之间形成黑白对比，有利于实现自动对焦。各步骤所用的铣削电流详见表2。 - 使用高铣削电流，在ROI前方铣出一个30 µm深的沟槽，以形成供SEM电子束成像的表面（图3E）。
注意：FIB束本身具有破坏性，尤其在高电流下更为显著。应尽量减少高电流下的成像操作，并采用低倍率和快速扫描速度，以避免ROI区域的树脂熔化。 - 使用接近成像过程中所用的铣削电流对成像表面进行抛光处理。当所有自动对焦和三维追踪标记在成像表面上清晰可见时，停止抛光（图3F）。抛光过程中可通过电子显微镜（使用背散射电子探测器）对表面成像，实时监测FIB加工进展。
- 确定新生成表面上需成像的区域，并设置成像参数。确保电子束聚焦于表面，调节亮度和对比度，并设定像素尺寸和切片厚度。通过调整驻留时间和线平均次数，将每次成像时间控制在1分钟以内。
注意：使用电子束成像时应采用低电压，以确保仅对块体表面成像（即不采集来自样品深层的电子信号）。为此，应将电压保持在2 kV以下，并使用带有栅极电压的背散射电子探测器，仅允许高能电子被成像。在本示例中，电子束设置为1.5 kV和1 nA，背散射电子探测器的栅极电压为1.2 kV。同样采用5 nm像素尺寸和5 nm切片厚度，以获得各向同性的体素数据集。成像区域为17 µm × 10 µm，驻留时间为6.5 µs，线平均为1.0。 - 设置自动调谐和三维追踪的窗口，使用与成像相同的像素尺寸、驻留时间和线平均参数。
注意：不同系统的具体操作可能有所不同，因此此处仅列出步骤，不详述具体操作。 - 启动成像运行，并在前50–100个切片期间监控过程的稳定性。一旦系统运行平稳，离开房间并尽可能减少外界干扰。
注意：运行持续时间和切片数量取决于ROI的大小和切片厚度。在FIB-SEM中，Z轴方向实际对应于SBF-SEM图像上ROI框的高度（最大15–20 µm；图3E）。 - 以与上述SBF-SEM数据相同的方法对FIB-SEM数据进行配准。
结果
SBF-SEM 图像可提供组织的整体概览，有助于了解细胞的空间取向及细胞间连接情况（图4A）。随后在新区域进行的 FIB-SEM 成像通常针对 SBF-SEM 扫描后确定的兴趣区域，可进一步提供特定细胞和/或结构的高分辨率细节（图4B）。
图4C、D展示了SBF-SEM数据的非各向同性体素（图4C）与FIB-SEM数据的各向同性体素（图4D）在渲染效果上的差异。由于SBF-SEM中使用的z轴厚度导致渲染结果明显显示出切片层，从而在表面产生“阶梯”效应。而在FIB-SEM数据中，5 nm的切片厚度确保了渲染效果更加平滑，单个切片完全融合于表面之中。
图1：树脂包埋样品的块面制备。（A）根尖被包埋在树脂中。（B）使用剃刀刮除多余的树脂，直至剩余约0.5 mm2的包埋块。（C,D）将修整好的包埋块粘附到金属销钉上，经烘箱过夜后，使用超薄切片机配合金刚石刀对包埋块侧面进行修整，并将其表面修平。（E）在SBF-SEM内部，样品被调整至可识别块面与感兴趣区域（ROI）的方向，比例尺 = 20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：SBF-SEM 与 FIB-SEM 之间的相关性。 使用 SBF-SEM（A）和 FIB-SEM（B）获取的块面概览图像，比例尺 = 5 µm。（C,D）对感兴趣区域（ROI）的放大图。红色框标出将用 FIB-SEM 成像的区域，比例尺 = 5 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。
图 3：FIB-SEM 示意图及样品制备步骤。 （A）显示 FIB 束、SEM 束与样品相对位置的示意图。样品需被调整至 FIB 与 SEM 束的交汇点，以便在同一区域进行铣削与成像。（B）为通过 FIB 切除截面后进行 SEM 成像所需的沟槽结构示意图。（C）使用 FIB 束拍摄的图像，显示在感兴趣区域（ROI）上沉积的铂，比例尺为 5 µm。（D）使用 FIB 束拍摄的图像，显示用于自动对焦和三维追踪的线条。中间的线条用于自动对焦，外侧线条用于三维追踪。在线条上方沉积的碳提供了执行这些任务所需的对比度（铂与碳之间的对比），比例尺为 5 µm。（E）FIB 铣削沟槽后使用 FIB 束拍摄的图像，比例尺为 5 µm。（F）使用 SEM 束拍摄的图像，显示 FIB-SEM 运行过程中成像的感兴趣区域，比例尺为 2 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。
图4：分割前后SBF-SEM与FIB-SEM结果。 (A) SBF-SEM 数据集的三维视图（100 × 100 × 40 µm，比例尺 = 10 µm), (BFIB-SEM 数据集的三维视图（17 x 10 x 5.4 µm，比例尺 = 2 µm), (C) 通过阈值分割从 SBF-SEM 数据中分割出的液泡，比例尺 = 2 µm D. 通过阈值分割从FIB-SEM数据中提取的重构颗粒，比例尺 = 2 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
| 微波处理方案 | |||||||||
| 程序编号 | 描述 | 用户提示（开/关） | 时间（小时:分钟:秒） | 功率（瓦特） | 温度（°C） | 负载冷却器（关/自动/开） | 真空/鼓泡泵（关/鼓泡/真空循环/真空开/蒸气） | 恒温 | |
| 泵（开/关） | 温度（°C） | ||||||||
| 8 | TCH | 关 | 0:01:00 | 150 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 |
| 关 | 0:01:00 | 0 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | ||
| 关 | 0:01:00 | 150 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | ||
| 9 | 四氧化锇 | 关 | 0:02:00 | 100 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 |
| 关 | 0:02:00 | 0 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | ||
| 关 | 0:02:00 | 100 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | ||
| 关 | 0:02:00 | 0 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | ||
| 关 | 0:02:00 | 100 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | ||
| 10 | 50% 乙醇 | 开 | 0:00:40 | 150 | 50 | 关 | 关 | 开 | 30 |
| 70% 乙醇 | 开 | 0:00:40 | 150 | 50 | 关 | 关 | 开 | 30 | |
| 90% 乙醇 | 开 | 0:00:40 | 150 | 50 | 关 | 关 | 开 | 30 | |
| 100% 乙醇 | 开 | 0:00:40 | 150 | 50 | 关 | 关 | 开 | 30 | |
| 100% 乙醇 | 开 | 0:00:40 | 150 | 50 | 关 | 关 | 开 | 30 | |
| 15 | 0.1M 醋酸镉缓冲液 | 开 | 0:00:40 | 250 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 |
| 0.1M 醋酸镉缓冲液 | 开 | 0:00:40 | 250 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | |
| 15 | ddH2O | 开 | 0:00:40 | 250 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 |
| ddH2O | 开 | 0:00:40 | 250 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | |
| 16 | 醋酸铀酰 | 关 | 0:01:00 | 150 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 |
| 关 | 0:01:00 | 0 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | ||
| 关 | 0:01:00 | 150 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | ||
| 关 | 0:01:00 | 0 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | ||
| 关 | 0:01:00 | 150 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | ||
| 关 | 0:01:00 | 0 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | ||
| 关 | 0:01:00 | 150 | 50 | 关 | 真空循环 | 开 | 30 | ||
表1. 微波处理的详细方案。
| 步骤 | 电流 | 预计时间 |
| 铂沉积 | 3n A | 10-15 分钟 |
| 铣削自动调焦和追踪标记 | 50-100 pA | 4-6 分钟 |
| 碳沉积 | 3 nA | 5-10 分钟 |
| 粗铣沟槽 | 15-30 nA | 30-50 分钟 |
| 表面抛光 | 1.5-3 nA | 15-20 分钟 |
| 成像运行 | 700 pA-1.5 nA | 数小时至数天 |
表2. 样品制备与成像过程中FIB铣削所使用的电流
讨论
体积电子显微镜技术比传统的扫描电镜或透射电镜更具挑战性且耗时更长。由于需要对组织或细胞进行整块染色，处理步骤必须足够长，以确保试剂充分渗透整个样品。利用微波能量可促进试剂渗透，从而缩短处理时间、提高效率，并改善染色效果。由于电镜样品制备的要求远比光学显微镜严格，所有溶液和试剂都必须进行严格的质量控制。pH值、渗透压的变化，使用不纯的试剂，以及因操作不当引入污染物，均可能对最终成像产生不利影响。
体积电子显微术（Volume EM）还需要针对每种不同类型的样本制定个性化的实验方案。不同类型的哺乳动物组织、植物、单细胞生物（如酵母、锥虫）、C. elegans 等，均需采用各自特定的处理方法以获得最佳结果。固定和染色步骤的设计必须能够保持样本的结构完整性，并尽可能使其形态接近体内真实状态。在生理温度、pH 和渗透压条件下对组织进行固定，对于实现尽可能接近生命状态的样本至关重要。对样本进行高压冷冻（HPF）可能有助于维持更接近生命状态的结构（或仅产生不同的假象），但对于细胞和极薄组织以外的样本，高压冷冻将无法奏效，因为玻璃态冰只能在较小体积内形成。因此，对于许多研究问题，化学固定是唯一可行的选择。无论采用高压冷冻还是化学固定，在任何电镜实验中，都必须将所获得的结构结果与活细胞或活体组织成像的类似结果进行仔细比对，以验证其一致性。染色方案也必须根据所要回答的具体科学问题以及后续数字图像可视化所采用的实验流程进行优化。
将SBF-SEM与FIB系统紧密配置在一起，在许多实验中具有显著优势。SBF-SEM具有大视野和高X、Y分辨率，便于直接定位特定结构/细胞/事件，并提供组织中细胞的整体空间定位信息。此外，其能够在Z轴方向对样品进行连续成像的能力非常强大；然而，由于该技术生成的体素不具备各向同性，因此在需要精细几何细节的三维重建中可能失败或产生伪影。FIB技术受物理过程限制，成像视野较小，但其三维分辨率足以实现高度精确的重建。这两种技术的结合使用十分便捷，样品可直接从SBF-SEM转移至FIB，无需进一步处理或制备。我们承认，使用SBF-SEM在样品中搜索特定区域是对这一功能更强大设备的一种高成本应用。然而，能够立即观察到新的切削面并判断是否已到达目标区域（ROI），是一项显著优势。此外，替代方法如使用连续半薄（0.5 µm）LM切片，可能在结构被检测到之前就已将其切除；而通过单张TEM切片检查块面，则需将切片切割、捞至载网，并在同样昂贵的透射电镜中观察，效率远低于本文所述方法。
由于存在多种用于分割和渲染数据的程序，而特定结构的需求可能无法由单一应用程序最佳满足，因此无法提出标准的工作流程。如果某些简单结构的灰度值范围非常狭窄，可使用阈值分割算法进行分割。神经元结构可以使用如 Ilastik11 等程序进行半自动分割，但对于内质网等形态更随机或更复杂的细胞器，该方法的效果将较差。Microscopy Image Browser 是一个非常灵活的程序，能够对体电子显微镜数据进行配准、分割和三维渲染，但需要大量的用户交互操作12。通常情况下，数字可视化结果所需的时间将远远超过样品制备和成像所需的时间。
体积电子显微技术为超微结构分析打开了三维的大门。其他获取三维电镜图像的方法在体积方面存在局限性（如透射电镜断层成像），或在效率方面受限（如连续切片透射电镜）。尽管目前体积电子显微技术在大多数情况下过于复杂且成本高昂，难以在单个实验室中实施，但提供此类技术的共享核心设施数量正在增长，成功成像的样本类型也迅速增加。对于有特定科学问题和特定组织的研究者而言，很可能能够找到可提供样品制备与成像指导建议的专家。体积电子显微设备可进一步改进，例如增强SBF-SEM处理更大样品的能力，以及提升FIB技术铣削更大感兴趣区域（ROI）的能力。能够以更自动化方式分割出目标结构的软件将极大简化数据分析流程，而计算速度的提升也将显著缩短分析所需时间。尽管目前仍存在局限性，体积电子显微技术仍是一种有用的工具，结合SBF-SEM与FIB-SEM可形成高效的工作流程，用于识别稀有事件并对其进行高分辨率成像。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
用于容积电子显微镜的设备由佛兰德斯政府的一项慷慨资助提供。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3View 2XP | Gatan | NA | 用于SBFI的腔内超薄切片机 |
| 0.2M 二甲胂酸钠缓冲液 | EM Sciences | 11652 | |
| 导电环氧树脂（circuit works） | RS components | 496-265 | |
| Diatome Histo 4.0mm 裂石刀 | EM Sciences | 40-HIS | |
| 数位绘图板 | Wacom | DTV-1200W | 已不再供应 |
| Eppendorf 管 | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| 平底包埋模具 | EM Sciences | 70900 | |
| 25% 戊二醛溶液 | EM Sciences | 16220 | |
| 高分子量鞣酸 | EM Sciences | 21700 | |
| 柠檬酸铅 | Sigma-Aldrich | 22861 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| 4% 四氧化锇溶液 | EM Sciences | 19170 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pelco Biowave Pro + 微波组织处理仪 | Ted Pella | 36700 | |
| 亚铁氰化钾 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| Quorum Q150T ES 溅射镀膜仪 | Quorum Technologies | 27645 | |
| Reichert-Jung Ultracut 超薄切片机 | NA | NA | 已不再供应 |
| 0.2M 二甲胂酸钠 | EM Sciences | 11653 | |
| Spurrs 树脂试剂盒 | EM Sciences | 14300 | |
| 醋酸铀酰 | EM Sciences | 22400 |
参考文献
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