方法文章

小鼠胰岛细胞亚群中钙动力学的成像

8.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59491

⸱

2019年11月26日

 ,  ,  , 
1Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Metabolism, University of Oxford, 2Lund University Diabetes Centre, Unit of Molecular Metabolism, Clinical Research Centre, Malmö University HospitalMalmö, 3Institute of Neuroscience of Physiology, Department of Physiology, Metabolic Research Unit, University of Göteborg, 4Oxford National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre, 5Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于成像和定量分析异质性细胞群体（如胰岛细胞）中钙动力学的实验方案。将荧光报告分子递送至胰岛外周层细胞，随后对胰岛进行固定并成像，进而对单个细胞的荧光强度动力学进行分析。

摘要

胰岛激素调节血糖稳态。血糖水平的变化可诱导胰岛细胞胞质钙离子发生振荡，从而触发三种主要激素的分泌：胰岛素（由β细胞分泌）、胰高血糖素（由α细胞分泌）和生长抑素（由δ细胞分泌）。β细胞占胰岛细胞的大多数，并且彼此之间存在电耦合，能够作为一个整体对葡萄糖刺激作出反应。而数量较少的α细胞和δ细胞亚群（分别约占啮齿类1（人类2）胰岛细胞总数的20%（30%）和4%（10%））的兴奋性较难预测，因此尤为值得关注。

将钙离子传感器导入分离的胰岛中外围细胞层。随后固定单个胰岛或一组胰岛，并使用荧光显微镜进行成像。成像模式的选择取决于更高的通量（宽场）或更优的空间分辨率（共聚焦）。传统上，激光扫描共聚焦显微镜被用于组织成像，因其能够最佳地分离相邻细胞之间的信号。若能最大限度减少来自占主导地位的β细胞群体的干扰信号，也可使用宽场成像系统。

在记录特定刺激下钙离子动态变化后，数据以荧光强度随时间变化的数值形式表示，并相对于初始荧光强度进行归一化和基线校正，以消除荧光探针漂白带来的影响。通过计算尖峰频率或曲线下部分面积（pAUC）随时间的变化，对所观察到的效应进行量化。pAUC 方法更为敏感且具有较强的稳健性，而尖峰频率则能提供更多关于钙离子升高机制的信息。

可以利用某些标志化合物（如肾上腺素和饥饿素）诱导胰岛细胞特定亚群胞质钙离子浓度发生变化的功能反应，来鉴定其中的少量细胞亚群。

引言

该方法旨在对胰岛细胞中少数亚群的胞质钙离子浓度（[Ca2+]cyt）进行实时成像。这有助于揭示调控这些细胞激素分泌的机制，阐明不同类型细胞之间相互作用的细节，并可能将群体层面的维度引入胰岛信号转导的整体图景中。

胰岛由多种细胞类型组成。除了较为人熟知的分泌胰岛素的β细胞外，至少还有两个细胞亚群在调节血糖中也起着关键作用3。α细胞（约占胰岛细胞的17%）在血糖过低时分泌胰高血糖素，从而促使肝脏中的葡萄糖储存释放入血。过高的胰高血糖素水平（高胰高血糖素血症）以及胰高血糖素分泌调控受损，常伴随胰岛素敏感性下降的糖尿病前期状态（从机制上讲，也可能促进该状态的发生）4。δ细胞（约占2%）则在血糖升高时分泌生长抑素。这种广泛存在的肽类激素在胰岛内α细胞和β细胞周围可能处于较高浓度，可通过Gi受体介导，强烈抑制胰高血糖素和胰岛素的分泌。

α细胞和δ细胞与其亲缘关系密切的β细胞共享大部分葡萄糖感应机制。这三种细胞类型均具有ATP敏感性K+通道，以及复杂的代谢感受器5，可调控这些可兴奋细胞的质膜电位。与此同时，胰岛素、生长抑素和胰高血糖素的分泌受葡萄糖的调节方式各不相同。因此，对胰岛中这两个次要细胞亚群的Ca2+动态进行成像，有助于深入了解血糖水平与胰岛分泌输出之间的相互作用。

早期利用膜片钳电生理技术监测α细胞和δ细胞兴奋性的尝试，很快被对单个α细胞和δ细胞内Ca2+的成像所取代。在这些实验中，细胞的身份通过事后使用抗胰高血糖素或抗生长抑素抗体染色加以确认。这些研究经常受到一个发现的阻碍：胰岛细胞在完整胰岛内与作为单个细胞时的行为差异显著。尽管β细胞似乎是胰岛结构的主要受益者（因其数量占绝对优势，从而实现强烈的电耦合），但出乎意料的是，主要的差异却出现在α细胞上。在完整的胰岛中，这些细胞在低葡萄糖条件下持续且稳定地被激活，而这一现象在分散的单个α细胞中仅约7%的细胞中存在6。因此，人们认为，报告完整胰岛内α细胞和δ细胞的活动更能准确反映体内的真实情况。

通常，特异性报告α细胞或δ细胞亚群中Ca2+动态变化的方法有两种：（i）通过组织特异性启动子表达基因编码的Ca2+传感器，或（ii）使用标记化合物。前一种方法更为精巧，其显著优势在于能够实现真正的三维成像，从而研究细胞在胰岛内的空间分布。然而，该方法无法应用于完整的人胰岛组织。另一个潜在问题是启动子的“渗漏性”，尤其是在发生β/α细胞转分化或α细胞对高浓度葡萄糖产生反应的情况下。后一种方法可用于新鲜分离的组织，包括人源样本或培养的胰岛。然而，所获取的数据仅来自胰岛细胞的外周层，因为将染料/标记分子递送至更深层而不破坏胰岛结构具有挑战性。后一种方法的一个意外优势是其与宽场成像模式的兼容性，这使得实验可扩展至同时对数十甚至数百个胰岛（即数千至数万个细胞）进行成像。

使用基因编码的GCaMP7（或pericam8）家族传感器在活体中对钙进行成像，这些传感器是环状重排的绿色荧光蛋白（GFP）的变体，与钙结合蛋白钙调蛋白及其靶序列——肌球蛋白轻链激酶的M13片段融合而成7,9。GCaMP在纳摩尔浓度的Ca2+范围内具有极佳的信噪比，并且具有高的双光子截面，使其成为活体研究的理想选择10,11。使用重组传感器的一个难点在于将其递送至细胞内。异源表达需要使用病毒载体并进行数小时的离体培养，这常常引发人们对细胞去分化或功能退化的担忧。尽管经过预先基因工程改造以表达GCaMP的小鼠模型可解决这一问题，但这类模型也带来了新的挑战，显著延长了实验准备时间，并将研究限制在非人类模型中。基于蛋白质的传感器对细胞内pH值变化极为敏感，这是其另一个不利因素12，不过在检测振荡信号（如Ca2+）时，这一问题的影响相对较小。

可捕获性染料（如绿色荧光Fluo4）的优点是可在约一小时内将其加载到新分离的组织中。可以预见的是，可捕获性染料的信噪比较低，且光稳定性明显低于相应的重组蛋白染料。尽管如此，我们无法证实关于可捕获性染料毒性的相关报道1314，然而染料过载是一个常见问题。

自2011年以来，基于环状重排的红色重组Ca2+传感器发展迅速15，最近的进展在组织成像方面已能与GCaMPs形成有力竞争16，这得益于红光更深的穿透能力。市面上可获得的红色可捕获染料可用于可靠的单细胞成像，但在组织水平上，其性能尚无法与绿色类似物相媲美。

在组织实验中，当离焦光成为关键问题时，成像技术的选择似乎非常有限。共聚焦系统可通过消除离焦光，使用数值孔径（NA）高于0.3（针对GCaMP6）或0.8（可捕获染料）的任何物镜，实现可接受的单细胞分辨率。从技术上讲，传统的共聚焦显微镜可用于同时对数百个胰岛（GCaMP）或数十个胰岛（可捕获染料）的细胞质钙离子浓度［Ca2+]cyt进行成像。当传感器在组织中呈三维表达时，共聚焦模式唯一现实的替代方案或许是光片显微镜。

当传感器在胰岛组织的外周细胞层中表达时，情况略有不同。对于表达明亮且细胞内分布清晰的重组传感器，使用低数值孔径（NA）物镜的宽场成像模式可能已具备足够的成像质量，并可显著增加视场面积，从而提高通量。宽场成像系统的空间分辨率较低，因为无法消除非焦平面的杂散光；因此，使用高数值孔径（低景深）物镜对组织成像时信息量较少，单个细胞的信号会受到邻近细胞信号的严重干扰。而使用低数值孔径（高景深）物镜时，此类干扰则显著减小。

然而，对于某些任务而言，高通量和/或高采样率会成为关键优势。α细胞和δ细胞表现出显著的异质性，这就需要较大的样本量才能揭示亚群的贡献。宽场成像速度快且更灵敏，工业级大视野系统在相同信噪比下可同时对数百个（GCaMP）或数十个（Fluo4）胰岛进行成像，而共聚焦实验通常仅针对十个或单个胰岛。这种通量上的差异使得宽场系统在具有单细胞分辨率的群体成像中更具优势，对于δ细胞等较小亚群尤其重要。同样，若试图从Ca2+振荡信号中重建电活动17，也将受益于宽场成像模式提供的更高采样率。与此同时，某些"特定"问题，例如在主导的β细胞亚群被刺激时胰腺α细胞的活动，仍需使用共聚焦系统。决定采用共聚焦模式的一个影响因素是来自β细胞亚群的显著干扰信号的存在。

尽管在成像实验后仍可使用激素特异性抗体染色来验证细胞身份，但也可利用功能性标记化合物鉴定微小的细胞亚群，例如肾上腺素和胃饥饿素，这些化合物已被证明可选择性地刺激Ca2+ α-中的动力学18 和δ细胞19,20分别。

时间序列成像数据的分析旨在提供超越常规药理学的信息，例如群体异质性、不同信号之间的相关性与相互作用。传统上，成像数据以荧光强度随时间变化的形式进行分析，并归一化至初始荧光强度（F/F0）。由于荧光探针信号的漂白，或自发荧光及pH变化（通常由毫摩尔浓度水平的葡萄糖引起12）带来的干扰，通常需要进行基线校正。Ca2+ 数据可通过多种方式分析，但主要有三种趋势：测量尖峰频率的变化、平台期比例，或随时间计算的曲线下面积。我们发现后一种方法具有优势，尤其适用于严重欠采样的共聚焦数据。pAUC指标的优点在于其对信号频率和幅度变化均具有敏感性，而频率计算则需要大量的振荡周期21，这在常规成像中难以实现。pAUC分析的限制因素是其对基线变化的高度敏感性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

此处描述的所有方法均根据英国《动物（科学程序）法案》（1986年）以及牛津大学伦理准则制定。

1. 分离小鼠胰岛

  1. 准备培养基和分离溶液。
    1. 配制培养基：RMPI1640（参见材料表），添加10%胎牛血清、100 单位/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素。将培养基分装至两个60 mm塑料培养皿（未经任何黏附处理），并将培养皿置于培养箱中（37 °C，5% CO2，饱和湿度）。
    2. 配制分离溶液（每只小鼠50 mL）：Hanks’ 溶液含5 mM葡萄糖、100 单位/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素。置于冰上（4 °C）保存。
    3. 配制酶溶液（例如Liberase）：以分离溶液配制为0.2 mg/mL，每只小鼠使用2 mL。置于冰上（4 °C）保存。可选步骤：预先测试Liberase的活性，并针对每批酶优化孵育参数22。
  2. 将酶溶液注入小鼠胆管。
    1. 通过颈椎脱位法处死小鼠（12周龄雌性，C57Bl/6J）。
    2. 在解剖显微镜下，使用精细剪刀切开皮肤和肌肉层，暴露胆管。
    3. 使用棉线在胆管与肠道连接处两侧结扎肠道。
    4. 用弯头精细镊子轻轻提起胆管，使用带有30G针头的2 mL注射器注入预冷的酶溶液。此时应观察到胰腺膨胀。
    5. 使用钝头镊子与精细镊子配合，将膨胀的胰腺收集至15 mL离心管中，并置于冰上（4 °C）。向管中加入1 mL酶溶液。
  3. 从胰腺中解离并收集胰岛。
    1. 将注入酶溶液后膨胀的胰腺置于37 °C水浴中孵育16分钟。可轻柔振荡，但若膨胀充分，则振荡并非必需。
    2. 加入预冷的分离溶液至总体积达10 mL，以终止消化反应。轻轻振荡消化物，应分解为小块组织。
    3. 用10 mL分离溶液洗涤消化物三次，每次在冰上静置5分钟，于1 × g 条件下离心沉淀释放出的胰岛。使用10 mL移液管小心吸除上清液。
    4. 向消化物中加入冷RPMI培养基（定容至10 mL）。
    5. 使用塑料培养皿（步骤1.1.1）挑选胰岛。将其中一个培养皿中的RMPI培养基倾去，轻轻倒入4–5 mL消化物。用P10移液器将呈圆形、表面光滑且密度较高的胰岛转移至第二个培养皿中。
    6. 将胰岛置于培养箱中培养（37 °C，5% CO2，饱和湿度）。实验可在此阶段暂停。部分研究者认为，让胰岛静置1–2小时有助于其从分离过程中的机械应力中恢复。

2. 加载染料或表达传感器

  1. 制备可捕获染料。
    1. 将分装的可捕获染料（例如 Fluo-4）50 μg 溶于 DMSO 中，配制成 2 mM 的储备液。加入普朗尼克酸（Pluronic acid），使其终浓度为 1%（使用 DMSO 中 20% 的储备液），以改善染料的溶解性。
    2. 将染料分装至小型PCR管中（每管2 μL）。染料可在-20 °C冷冻保存数周。
  2. 或者，制备重组传感器。
    1. 将传感器（例如编码GCaMP6f的腺病毒载体）分装为10 μL的等份，于-80 °C保存。
    2. （可选）通过使用多个连续稀释度的病毒液感染胰岛（如下所述），预先检测病毒原液的滴度，以确定感染的最佳浓度。
      注意：由不同载体（慢病毒、BacMam、AAV）编码的重组传感器需要采用不同的感染方案。请务必与载体供应商确认，并根据您的实验需求优化工作比例。 "工作" 腺病毒的储存液可保存在 -20 °C，可反复冻融数次。过度冻融会降低病毒的有效滴度。
  3. 配制成像溶液。
    1. 配制成像溶液（单位：mM）：140 NaCl，4.6 KCl，2.6 CaCl₂2，1.2 MgCl2, 1 NaH2PO4，5 NaHCO₃3，10 HEPES（用NaOH调节pH至7.4）。
    2. 在成像溶液中配制葡萄糖（0.5 M）和甘露醇（0.5 M）的储备液。储备液可在冰箱（4 °C）中保存数周。
  4. 加载可捕获染料。
    1. 将2 μL染料溶解于600 μL含6 mM葡萄糖的成像溶液中，配制染料工作液。可加热或涡旋以促进溶解。
    2. 将步骤1中分离的胰岛加入染料的工作液中。可使用多孔板或培养皿进行染色。若使用培养皿，取100 μL工作液滴加于无黏附性培养皿（35 mm或60 mm）底部，用移液器将10–30个胰岛移入液滴中。
    3. 若存在不同组别的胰岛（例如野生型/基因敲除型），应设置多个孔和多个液滴，以便同时完成加样。
    4. 将胰岛在染料工作液中于室温避光孵育70-90分钟。切勿过度孵育。
    5. 在荧光显微镜下检查负载情况；胰岛应呈现轻微荧光，部分细胞比其他细胞更亮。细胞变圆以及染料在细胞核内定位是过载的迹象。
    6. 将胰岛转移至不含染料的成像溶液中（含6 mM葡萄糖）。胰岛可立即用于成像，也可选择让染料进一步去酯化10-15分钟。胰岛可保留染料数小时，因此可用于多次成像实验。
  5. 或者，用重组载体感染胰岛。
    1. 将胰岛以液滴形式接种于RPMI培养基（步骤1.1.1）中（例如，30 μL），以尽量减少所需载体的体积。
    2. 以大约10的比例加入载体5 感染单位/胰岛，理想情况下应达到感染复数 >2. 理想情况下，应将比例优化至可在外周层提供表达的最低比例。预滴定（步骤2.2.3）可能有助于实现此目标。
    3. 将20-50个胰岛加入液滴中，培养8-48小时（理想情况下过夜）。大多数细胞应呈现微弱的绿色荧光，且细胞形态无明显变化。
      注意：感染和表达的成功与否取决于接触病毒溶液的时间。理想情况下，病毒应在溶液中孵育过夜，但也可选择在短至15分钟后移除。然而，感染效率以及随之而来的表达水平可能会显著降低。

3. 成像 Ca2+ 动力学

  1. 在（倒置）显微镜下固定胰岛。
    1. 组装用于倒置显微镜的成像腔室。将玻璃盖玻片（厚度为1或1.5）放置于腔室内，并确保玻璃与腔室之间的接口密封不漏水。检查盖玻片是否处于显微镜物镜的工作距离范围内（对于体积较大的高数值孔径物镜尤为重要）。
    2. 准备固定配件。从细网和粗网中裁剪出小矩形（20 mm × 20 mm）。插入两个间隔物 "壁" 使用45-50 μm厚的粘性胶带将样品固定在细网筛上。若待成像胰岛的尺寸显著超过常规的100 μm，应使用双层间隔片。
    3. 将网格和重物放入35 mm的培养皿中的成像溶液中。确保塑料和金属部分均被溶液浸湿。
    4. 在解剖显微镜下，用隔片转动细网 "壁" 倒置，使垫片朝上。用P20移液器挑选若干负载可捕获染料或表达重组传感器的胰岛，轻轻放置于细网筛上，位于两个垫片之间。确保网筛和垫圈上不残留过多成像溶液。
    5. 用钟表匠镊子夹起含有胰岛的筛网，将其倒置放入成像室中，使间隔物朝下并直接接触腔室盖玻片。确保胰岛被夹在间隔物与筛网之间，位于盖玻片中央。
    6. 将粗网和重物置于腔室内的细网之上。向腔室内加入成像溶液。确保胰岛已被固定并处于可成像状态。避免剧烈震荡腔室（轻微扰动，如将腔室移至显微镜或将腔室插入加热载物台，是可以接受的）。
      注意：类似的固定装置也可用于直立系统。
  2. 设置显微镜。
    1. 选择成像模式和物镜，将步骤3.1中含胰岛的培养皿置于显微镜的温度控制载物台上。
      1. 设置温度控制（理想范围为30 °C至36 °C）并启动灌流。对于倒置系统，应将灌流 chamber 内的流入端置于低于流出端的位置，并使流出流量大于流入流量（通常通过在蠕动泵上使用内径更宽的管路来实现）。
      2. 确保流出端与溶液的接触面积极小，以便以连续多个微小液滴的形式移除溶液，避免长时间连续移除溶液。后者是周期性信号延时成像中的主要伪影来源，此类伪影表现为每个成像像素的规则周期性强度振荡，常被误认为 "慢波".
      3. 用含有3 mM葡萄糖的成像溶液启动灌流。
    2. 选择用于绿色荧光染料成像的光路和滤光片；激发波长在470至500之间，发射波长在505至550之间的滤光片组合适用于每种绿色荧光染料。
    3. 进行活体成像以设定成像参数。调整视野以捕获目标胰岛。
    4. 优化图像的信噪比。为此，调节激发光强度、曝光时间和像素合并（binning）参数。确保在尽可能低的光照强度和曝光时间下，仍能清晰地分辨胰岛内每个细胞。
    5. 进行图像采集。根据具体任务，图像采集频率可设置为 0.1 至 5 Hz。该频率远低于快速 Na+α细胞和δ细胞中的驱动振荡（>300 Hz），这意味着数据默认处于欠采样状态。然而，在大视野的多细胞/多胰岛成像中，提高采集频率以满足这一需求是不可行的。GCaMP 可以实现更快的成像，而 Fluo4 在快速采集条件下则不可避免地会发生漂白。
      注意：鉴于[Ca2+]细胞毒性 胰岛细胞中的振荡由电活动驱动，使用较低的采样速率似乎适得其反。然而实际上，采样速率在约1 Hz或更高时，可能已足以解析β细胞的放电行为13，而α细胞和δ细胞中钠通道驱动的振荡检测阈值远高于300 Hz。α细胞或δ细胞的[Ca2+]细胞毒性 在1 Hz或0.1 Hz下采集的振荡信号将严重欠采样，并反映Ca2+ 由细胞处理而非电活动。
      1. 检查所获取数据的质量：在3 mM葡萄糖条件下，α细胞活性应清晰可见/可检测。确认满足此条件后，进行大规模的时间序列成像。
  3. 延时成像
    1. 利用采集软件中实现的信号动力学在线图表（如果可用）。如果无法使用在线图表，则应用一种以最全面方式显示信号强度的查找表（例如 "彩虹").
    2. 可逆地施加刺激：记录信号恢复至基础水平的过程；忽略记录开始和结束时的伪迹，其中结束时的伪迹可能看似不可逆 "增加"/"减少" 由于pH变化或细胞死亡导致的探针荧光变化。
    3. 通过振荡性 Ca²⁺ 区分 α 细胞2+ 在低葡萄糖条件下，向灌流液中加入肾上腺素或谷氨酸，作用可逆，持续2-5分钟。细胞内钙离子浓度[Ca2+]细胞毒性 随后振荡将减缓或停止。
      注意：肾上腺素是α细胞的一种公认标志化合物，可通过促进Ca²⁺释放，对该类胰岛细胞亚群产生选择性正向作用。2+ 来自细胞内储存库18谷氨酸已被提出作为另一种α细胞特异性激动剂23.
    4. 添加/去除最近有报道称可选择性激活δ细胞的胃饥饿素19,20. 观察[Ca2+]细胞毒性 在胰岛细胞的一个小亚群中。
    5. 添加/去除 20 mM 葡萄糖。观察 β 细胞亚群中协调的振荡性反应。注意此前已被肾上腺素、谷氨酸和胃饥饿素激活的细胞的反应。
    6. 保存图像序列。考虑使用 "自动保存" 在记录过程中。

4. 数据分析

  1. 分析延时图像。
    1. 将延时图像导入图像分析软件，例如开源的 ImageJ/FIJI。
    2. 如果在记录期间发生了显著或快速的移动，则将数据视为不可修复并予以舍弃。可使用 StackReg 或 TurboReg 插件24校正轻微的漂移。
    3. 创建用于细胞检测和感兴趣区域（ROI）映射的掩膜图像。实现此目的的最佳方法是使用“平均强度""或“最大强度""等函数之一生成图像堆栈。应选择能够最准确识别单个细胞的函数。
    4. 对掩膜图像进行阈值化处理，并移除胰岛区域外的所有数据。该功能对32位图像可自动运行。
    5. 在阈值化图像中检测极大值。若图像密度较高，极大值可表现为点、区域甚至扇区。
    6. 应用“查找极大值"”功能且不设尺寸限制，将检测到的极大值粘贴至感兴趣区域（ROI）编辑器中。
    7. 对每个映射的 ROI 进行平滑或插值处理；必要时可对 ROI 进行扩展。可编写简单脚本执行步骤（4.1.6–4.1.8），并多次运行以获得最佳的细胞检测结果。多个 ROI 可能重叠，但这种情况较为罕见。
    8. 分析 ROI 的位置，并将相应的 X 和 Y 数据粘贴到电子表格软件中（例如 Microsoft Excel）。
    9. 分析所有 ROI 的灰度强度随时间的变化，并将数据粘贴至电子表格软件中。
  2. 分析数值数据。
    1. 将数据导入数据分析软件。根据所选软件以及实验的持续时间、采样频率和数据量，此操作可以是简单的复制粘贴，也可以是一个独立的流程。确保数值数据的正确排列与存储。
    2. 导入时间戳或时间记录（如可用）。
    3. 将原始荧光强度数据（"F"）归一化至初始荧光值（"F0"）。该初始值不必是第一个时间点的荧光值，也可以是前几个时间点的平均值。归一化应降低数据变异性，在理想情况下（无基线漂移）可得到可用于分析的数据集（"F/F0"）。
    4. 如果 F/F0 数据集的细胞间变异性仍然显著（如长时间记录或发生光漂白），则进行基线校正。为此，定义一个“对照”区域，即施加对照溶液的时间段（对于小鼠胰岛，为不含任何激动剂/拮抗剂的 3 mM 葡萄糖溶液）。
      1. 如果对照区域具有明确的非振荡信号，可假设每次施加对照溶液后，F/F0 均恢复至初始值（F/F0=1）。通过将每个细胞的数据按添加对照溶液的时间点划分为若干段，并对每一段进行线性校正，从而校正延时数据。请勿使用多项式或其他非线性校正方法，因其会导致伪影。
      2. 如果对照时间段存在明显振荡，或存在其他因素（如 FAD 自发荧光），则使用峰检测算法17。一种简单且快速的替代方法是采用对极大值敏感的小波变换（图3A）。
    5. 对数据进行量化。尽管 Ca2+ 是一种高度动态的信号，但在生物医学文献中，以绝对 F/F0 值形式呈现 Ca2+ 数据是广泛可接受的。若需比较多个实验的结果，应选择一种量化指标。
      1. 测量 Ca2+ 峰的频率（图4A,D），以及其对（拮）激动剂添加的响应。为此，将记录划分为等长时间段，通过统计每段时间内的峰数量并除以时间段长度，计算部分频率（即各时间段内的放电频率）的时间进程。
      2. 或者，设定阈值，并计算上述各时间段的平台期比例（pf）（图4B,F）。该比例表示细胞处于“兴奋""状态的时间占该时间段的百分比。
      3. 或者，计算上述各时间段的部分曲线下面积（pAUC）（图4C,G）。该指标对放电频率和振幅的变化均敏感。
        注：频率测量的一个局限性在于其对峰持续时间不敏感且稳定性较差。由于数据相对于电活动放电严重欠采样，每个时间段内的峰数通常较少，因此单个额外的峰可能显著影响结果。pAUC 的瓶颈在于其对基线变化敏感。尽管 pAUC 比频率更不易产生伪影，且对胞质 [Ca2+]cyt 变化更敏感，但它对 Ca2+ 动力学本质的反映仍不够充分。平台期比例是将开放概率概念扩展至全细胞系统的结果。然而，由于其依赖于阈值设定，其稳健性低于 pAUC。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

胰岛对可滞留型染料的负载效果通常较好（图1A），除非细胞膜的脂质组成受到影响（例如，长期暴露于脂肪酸）。人5型腺病毒（Ad5）载体也可靶向所有胰岛细胞（图1B）。当同一细胞中表达多个重组传感器时，可能会出现问题。此外，采用上述技术通常可将胰岛非常牢固地固定，从而提供卓越的稳定性与溶液通透性。

在低葡萄糖水平下，α细胞中的Ca2+振荡可被 readily 检测到（图2）。低葡萄糖条件下细胞间的活动与对肾上腺素和谷氨酸的反应之间存在高度的单细胞相关性。饥饿素（Ghrelin）在低葡萄糖条件下可激活部分对肾上腺素有反应的细胞（α细胞？），但对大多数由低葡萄糖激活的细胞（β细胞）中的Ca2+动力学无影响。

当以部分频率进行分析时（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

该实验方案中有三个阶段对整体成功至关重要。首先，将 Liberase 酶成功注入胆管不仅决定了胰岛分离操作的定量成功率，还直接影响所分离胰岛的质量。胰腺未充分膨胀可能导致分离所得胰岛缺乏某些重要的代谢反应。其次，染料的加载或传感器的表达水平决定了延时成像记录的信噪比。在过载的胰岛中，信号会消失或减弱。最后，将组织成功且紧密地定位在成像腔内，是获得有意义且可分析实验结果的关键环节。组织定位不佳或发生移动，将导致实验时间浪费和（或）数据不清晰。

该方法可进行修改，以适用于多种信号（使用共聚焦系统）和多组胰岛（例如，不同基因型的胰岛）。多种信号的成像需向胰岛的每个细胞递送第二种传感器，该传感器在光谱上需与Ca2+报告分子兼容（例如pH传感器SNARF5f26,27）。为此，可将胰岛同时加载或共感染Ca2+和pH传感器，然后在每个时间帧内依次进行成像。

以单细胞分辨率对胰岛群...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

AH 获得了英国糖尿病基金会博士生奖学金，EV 得到了牛津离子-惠康信托培训项目的资助，AIT 持有牛津生物医学研究中心的博士后奖学金。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
40x/1.3 物镜
Axiovert 200 显微镜
发射
激发
胎牛血清Sigma-AldrichF7524-500ML
Fluo4Thermo Fisher (Life Technologies)F14201
GCaMP6f，位于（人5型）腺病毒载体中Vector Biolabs1910
Hanks' 溶液Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)
LiberaseSigma-Aldrich5401020001
青霉素/链霉素Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)15140122
RPMI 培养基Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)61870044
Zeiss LSM510-META 共聚焦系统Carl Zeiss

参考文献

  1. Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets. Journal of Anatomy. 186, Pt 3 629(1995).
  2. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
  3. Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 63 (8), 575-591 (2015).
  4. Færch, K., et al. Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation. Diabetes. 65 (11), 3473-3481 (2016).
  5. Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2. The Journal of Physiology. 557 (2), 347-354 (2004).
  6. Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell. Cell Calcium. 35 (4), 357-365 (2004).
  7. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137(2001).
  8. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  9. Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97(2014).
  10. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  11. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
  12. Tarasov, A. I., Rutter, G. A. Methods in enzymology. 542, Elsevier. 289-311 (2014).
  13. Tarasov, A. I., et al. Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic β cells. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (4), 543-554 (2013).
  14. Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signal. 11 (515), 2039(2018).
  15. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  16. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. Elife. 5, 12727(2016).
  17. Theis, L., et al. Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging. Neuron. 90 (3), 471-482 (2016).
  18. Hamilton, A., et al. Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
  19. Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
  20. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  21. Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data. PloS One. 9 (4), 93826(2014).
  22. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  23. Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
  24. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  25. Tarasov, A. I., et al. Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis. Lab on a Chip. 18 (18), 2838-2848 (2018).
  26. Knudsen, J. G., et al. Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production. Cell Metabolism. , (2018).
  27. Adam, J., et al. Fumarate hydratase deletion in pancreatic β cells leads to progressive diabetes. Cell Reports. 20 (13), 3135-3148 (2017).
  28. Wills, Q. F., et al. Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity. Islets. 8 (2), 48-56 (2016).
  29. Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells. Endocrinology. 105 (6), 1463-1468 (1979).
  30. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  31. Longo, E. A., et al. Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 266 (14), 9314-9319 (1991).
  32. Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose. Cell Calcium. 10 (4), 205-211 (1989).
  33. Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic β-cells. Archives of Biochemistry and Biophysics. 268 (1), 404-407 (1989).
  34. Okamoto, Y., et al. Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro. Diabetes. 41 (12), 1555-1561 (1992).
  35. Gilon, P., Henquin, J. C. Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell. The Journal of Biological Chemistry. 267 (29), 20713-20720 (1992).
  36. Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans. Diabetes. 42 (8), 1210-1214 (1993).
  37. Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
  38. Stout, A. L., Axelrod, D. Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy. Applied Optics. 28 (24), 5237-5242 (1989).
  39. Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638(2013).
  40. Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
  41. Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
  42. van Gurp, L., et al. Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice. Diabetologia. 59 (11), 2387-2392 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章