需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

从小鼠气管中分离和定量评估刷状细胞

7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59496

⸱

2019年6月12日

 ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Immunology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

本文内容

摘要

刷状细胞是存在于正常小鼠气管中的稀有胆碱能化学感受上皮细胞。由于其数量有限，通过离体方法评估其在气道免疫和重塑中的功能作用具有挑战性。本文介绍了一种通过流式细胞术分离气管刷状细胞的方法。

摘要

气管刷状细胞是一类胆碱能化学感受上皮细胞，能够将来自气道腔内的信号传递至免疫系统和神经系统。它们属于一类化学感受上皮细胞家族，该家族还包括肠黏膜中的簇细胞、气管中的刷状细胞，以及鼻黏膜中的孤立化学感受细胞和微绒毛细胞。不同上皮区域的化学感受细胞共享关键的细胞内标志物和核心转录特征，但也表现出显著的转录异质性，这可能反映了局部组织微环境的差异。为了深入定义这些稀有上皮细胞的功能，需要从单细胞悬液中分离气管刷状细胞，但其分离具有挑战性，可能由于气管刷状细胞与神经末梢之间存在紧密相互作用，或与气道特异性的紧密连接和黏附连接组成有关。本文介绍了一种从小鼠气管上皮分离刷状细胞的操作流程。该方法首先将气管上皮与黏膜下层分离，从而使得上皮层后续仅需较短时间的木瓜蛋白酶孵育。该方案为活体气管刷状细胞的流式细胞分选及功能分析提供了一种快速且便捷的解决方案。

引言

刷状细胞属于一类化学感受上皮细胞，其特征是表达苦味受体以及味蕾细胞中所见的味觉受体信号转导机制。与味蕾细胞不同，化学感受上皮细胞散在分布于上皮表面，在鼻上皮中被称为孤立化学感受细胞（SCCs）和微绒毛细胞1,2，在气管中称为刷状细胞3,4，在肠道中称为簇状细胞5,6。表达苦味受体及苦味信号转导机制的上皮细胞也存在于尿道7,8和咽鼓管9中。气道刷状细胞在神经源性和免疫性气道反应中具有独特功能。它们是可产生乙酰胆碱的化学感受细胞，在受到苦味化合物以及群体感应物质等细菌代谢产物激活时，可诱发保护性呼吸反射10。气道刷状细胞也是气道上皮中白细胞介素-25（IL-25）的主要来源，而IL-25可调控气道内由气源性变应原引发的2型炎症反应3。

由于气管上皮中下呼吸道刷状细胞数量较少，且在大支气管以外区域数量极为有限，对其全转录组及其对环境刺激反应的表征研究一直受到限制10。用于从肠上皮分离化学感受细胞的技术在气管中的收获率相对较低，可能是因为气管刷状细胞与神经末梢之间存在紧密接触10，或呼吸黏膜中其他组织特异性因素，例如黏附连接和紧密连接蛋白的组成所致。近期有研究报告成功以较高得率分离气管刷状细胞用于单细胞RNA测序分析，所采用的方法包括使用木瓜蛋白酶孵育2小时，或使用蛋白酶（pronase）孵育18小时11,12。然而，长时间使用消化酶孵育可能降低细胞活力，并改变消化组织来源细胞的转录谱13，这可能导致与其他化学感受上皮细胞群体的比较分析出现偏差。

本文报道了一种用于RNA测序3的气管刷状细胞分离方法。使用高剂量分散酶处理气管，可使上皮层与黏膜下层分离。随后用木瓜蛋白酶消化上皮组织片，可高效回收此类结构细胞。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

在开展以下实验之前，须确保所有动物护理、使用及操作规程均已获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并符合美国国家研究委员会（National Research Council）的相关规定。 "实验动物护理和使用的指南" (8th 版本，2011）及ARRIVE指南。 以下所述所有操作程序均已通过布莱根妇女医院机构动物照护与使用委员会的审查与批准。

1. 试剂的准备

  1. 配制Dispase消化液，即含16 U/mL Dispase和20 µg/mL DNase I的PBS溶液。确保Dispase粉末完全溶解后，再将溶液置于37 °C水浴中预热。
  2. 向杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入5%热灭活的胎牛血清（FBS），配制终止液。
  3. 配制 Tyrode I 缓冲液：向不含钙的 HEPES-Tyrode 缓冲液中加入 26 U/mL 木瓜蛋白酶（48 U/mg 木瓜蛋白酶溶液，20 µL/mL）和 10 µL/mL L-半胱氨酸。
  4. 制备Tyrode II缓冲液：向含钙的HEPES-Tyrode缓冲液中加入2 μL/mL亮抑蛋白酶肽（5 mg/mL）。
  5. 配制FACS缓冲液：使用不含钙、镁的Hanks' Balanced Salt Solution（HBSS） & 酚红，添加 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）并加入 2% FBS。

2. 小鼠气管的解剖

注意：本实验方案中使用的小鼠为 ChAT(BAC)-eGFP（B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J），年龄 3–6 个月，雌雄均可。应尽量减少组织暴露于直射光下，以减少 eGFP 的光漂白。

  1. 通过腹腔注射100 mg/kg戊巴比妥安乐死溶液，或采用IACUC批准的标准方案对小鼠实施安乐死。
  2. 将小鼠仰卧位固定于手术板上，使用21 G针固定四肢并充分伸展。用70%乙醇喷洒毛发以消毒操作区域。
  3. 使用直镊提起腹部皮肤和毛发，用解剖剪（直剪，3 cm）在腹部中央做一剪口。用剪刀从腹部向颌下分离皮肤与皮下组织。用镊子提起皮下组织，用剪刀在腹壁中央做一小切口。
  4. 以V形切口打开腹膜。用镊子轻柔地将小肠移向一侧，定位腹主动脉和下腔静脉，用解剖剪做切口以实现快速放血。
  5. 定位膈肌。使用18 G针头在胸骨下方的膈肌处穿孔以排出肺内气体。使用尖头直解剖剪沿肋骨基底部小心剪开，将膈肌从肋骨 cage 上分离。
  6. 用镊子提起暴露的胸骨末端，从肋骨 cage 基部向颈部纵向剪开胸骨。用短直剪（2 cm）做中央颈部切口，并分离下颌下腺的两个叶。
  7. 使用精细尖头高精度镊子小心去除覆盖在气管分叉处（carina）的周围结缔组织和胸腺。
  8. 先在会厌水平分离气管近端，再在气管分叉水平解剖远端，逐步游离气管。
  9. 定位会厌，从会厌至气管分叉处（carina）纵向剪开气管。

3. 气管上皮消化

  1. 将气管放入含有 750 µL 预热至 37 °C 的分散酶消化液的 1.5 mL 离心管中。在室温下以 200 rpm 振荡孵育 40 分钟。用铝箔包裹离心管，以减少直接光照。
  2. 加入 750 µL 含 5% FBS 的冷 DMEM 以终止反应。置于冰上。
  3. 将气管转移至培养皿（100 mm × 15 mm）中，并置于解剖显微镜下。调整气管方向，使上皮面朝上。纵向剖开的气管呈由软骨环维持的半圆柱形结构，上皮位于凹面。
  4. 用直镊子将气管的会厌区域固定在培养皿上，使用一次性 22 号手术刀片刮取气管上的上皮。上皮层会以半透明薄膜的形式分离下来。
  5. 用手术刀片将上皮组织切碎，然后转移至 2 mL 离心管中。
  6. 用 750 µL Tyrode I 缓冲液冲洗培养皿，并将冲洗液转移至含有上皮层的 2 mL 离心管中。
  7. 将气管上皮层在 37 °C 下以 200 rpm 振荡孵育于 Tyrode I 缓冲液中 30 分钟。用铝箔包裹离心管，以减少直接光照。
  8. 加入 750 µL 冷 Tyrode II 缓冲液。剧烈涡旋消化组织 20–30 秒。使用连接 18 G 针头的注射器吹打匀浆 10 次。  更换为 21 G 针头，再吹打 10–20 次。
  9. 通过 100 µm 细胞筛过滤细胞至 50 mL 尖底离心管中。加入体积比为 30:1 的冷 FACS 缓冲液。
  10. 在 4 °C 下以 350 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。将沉淀用冷 FACS 缓冲液重悬，转移至 12 mm × 75 mm（5 mL）聚苯乙烯管中。再次在 4 °C 下以 350 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
  11. 将沉淀重悬于 100 µL FACS 缓冲液中。
  12. 加入 1 µL 抗小鼠 CD16/32 封闭抗体以阻断非特异性结合，在冰上孵育 15 分钟。无需洗涤。
  13. 加入以下抗体及其相应的同型对照：太平洋蓝标记的抗小鼠 CD45 抗体或大鼠 IgG2a, k（0.25 µg/106 细胞，总体积 100 µL），以及别藻红蛋白（APC）标记的抗小鼠 EpCAM 抗体或大鼠 IgG2b, k（0.5 µg/106 细胞，总体积 100 µL）单克隆抗体。在避光条件下冰上孵育 45 分钟。加入 4.5 mL 冷 FACS 缓冲液，混匀后在 4 °C 下以 350 × g 离心 10 分钟。弃去 FACS 缓冲液，将沉淀重悬于 300 µL 冷 FACS 缓冲液中。
  14. 在流式细胞分选前立即加入碘化丙啶（PI）（终浓度 5 µg/mL）。
    注意：刷状细胞形态不规则，具有多个突起，可能增加其在滤膜上的黏附性（图 3C）。我们比较了 30 μm、70 μm 和 100 μm 滤膜，发现较大孔径的滤膜可获得更高的细胞得率。此外，在木瓜蛋白酶消化后充分吹打细胞悬液可显著提高刷状细胞的得率。我们建议先使用 18 G 针头进行初步吹打，随后使用更小孔径的针头（21 或 23 G）进行更精细的细胞解离。

4. 流式细胞术设门策略

  1. 通过前向散射角和侧向散射角区分细胞与碎片。利用前向散射高度与宽度以及侧向散射高度与宽度排除双联体。双联体会表现出较高的宽度值。
  2. 在单细胞群体中，将碘化丙啶（PI）阴性的细胞群定义为活细胞。
  3. 在活的单细胞中，根据同型对照确定 CD45 低表达至阴性的细胞。
  4. 在 CD45 低/阴性细胞中，鉴定出同时为 EpCAM 阳性和 eGFP 阳性（在 FITC 通道中）的细胞。此即为刷状细胞群体（图 2A）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

该方案已成功用于分离气管刷状细胞以进行RNA测序3。在分离气管并采用两步法消化组织后（图1），排除死细胞（使用PI染色）后收集细胞，并用荧光标记的CD45和EpCAM进行染色。根据前向散射和侧向散射特征排除双联体细胞后，我们将刷状细胞定义为CD45低表达/阴性、EpCAM阳性且eGFP阳性的细胞（图2A）。通过流式细胞术分析，刷状细胞约占CD45low/neg细胞的0.16–0.42%，每根气管可获得250–600个刷状细胞（图2B）。我们将这些计数结果与基于ChAT(BAC)-eGFP小鼠全气管铺片中ChAT-eGFP阳性细胞数量的估计值进行比较，该估计值来源于我们已发表的对气管刷状细胞的广泛免疫组织化学评估3，并在本文中加以展示（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

我们发现，采用高剂量分散酶处理40分钟，随后进行短时间木瓜蛋白酶处理（30分钟），是气管消化和刷状细胞分离的最佳方案。与其他替代方案相比，该组合既能避免过度消化，又能获得最高的刷状细胞得率。

虽然传统上提取肺部造血细胞依赖于胶原酶IV等温和的消化酶15，但上皮细胞的分离则需要更复杂的方案。由于上皮细胞之间以及上皮细胞与基底膜之间存在紧密连接和黏附连接，且细胞本身较为脆弱，因此更难获得单细胞悬液。大多数上皮细胞消化方案包含两个步骤： 第一步是将上皮层从基底膜上分离，随后通过进一步步骤破坏使上皮细胞彼此黏附的紧密连接和桥粒16,17。

多个研究团队已成功采用两步法分离肠上皮细胞的不同改良方案，分离出肠道中的化学感应簇细胞：第一步使用EDTA和DTT将上皮细胞从黏膜下层释放，随后用dispase消化上皮细胞片层。Howitt等人采用5 mM EDTA加1 mM...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢布里格姆妇女医院人类免疫学中心流式细胞术核心实验室的 Adam Chicoine 在流式细胞分选方面的帮助。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目包括 R01 HL120952（N.A.B.）、R01 AI134989（N.A.B.）、U19 AI095219（N.A.B.、L.G.B.）和 K08 AI132723（L.G.B.）；同时获得美国过敏、哮喘和免疫学会（AAAAI）/美国肺部过敏性呼吸系统疾病奖（N.A.B.）、AAAAI 基金会教职员工发展奖（L.G.B.）、Steven 和 Judy Kaye 青年创新者奖（N.A.B.）、Joycelyn C. Austen 女性医师科学家职业发展基金（L.G.B.）以及 Vinik 家族的慷慨捐赠（L.G.B.）的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>抗体
抗GFP（多克隆山羊Ig）Abcam货号 ab5450
APC 抗小鼠 CD326（EpCAM）  (G8.8)Biolegendcat#118214
APC 标记的大鼠 IgG2a, k 同型对照Biolegendcat#400511
DAPIBiolegendcat#422801
驴抗山羊IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488Life Technologies/Molecular Probescat#A-11055
正常山羊 IgGR&D Systems货号#AB-108-C
太平洋蓝染料标记的抗小鼠 CD45 抗体（30F-11）Biolegendcat#103126
太平洋蓝染料标记的大鼠 IgG2b, k 同型对照Biolegendcat#400627
TruStain FcX（抗小鼠 CD16/32）抗体Biolegendcat#101320
化学品、多肽和重组蛋白
DispaseGibcocat# 17105041 
DNase ISigma 货号# 10104159001
HEPES-Tyrode’不含钙的 s 缓冲液（10 mM HEPES，135 mM NaCl，2.8 mM KCl，1 mM MgCl₂）2，12 mM NaHCO₃3，0.4 mM NaH2PO4，0.25% BSA，5.5 mM 葡萄糖。使用18.2兆欧姆水配制，并通过0.22微米滤膜过滤 µm 滤膜Boston BioProducts货号# PY-912
Tyrode’s 溶液（HEPES 缓冲）140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl₂2，2 mM MgCl2 和 10 mM 葡萄糖。使用 18.2 兆欧水配制，并通过 0.22 微米滤膜过滤 µm 滤膜。)Boston BioProducts货号 BSS-355
L-半胱氨酸Sigma货号 C7352
亮抑蛋白酶肽三氟乙酸盐Sigma货号 L2023
木瓜乳胶中的木瓜蛋白酶Sigmacat# P3125
碘化丙啶 Sigmacat# P4170
<强>实验模型：生物体/品系
ChATBAC-eGFP（B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J）杰克逊实验室7902
<强>仪器设备
配备 Airyscan 共聚焦系统的 LSM 800 在 蔡司Axio Observer Z1倒置显微镜Zeiss
LSRFortessaBD647465
<强>一次性设备
1.5 mL 无菌管Thomas Scientific1157C86
5 mL 聚苯乙烯圆底管，12 mm × 75 mm 规格Falcon14-959-1A
50 mL 聚丙烯锥形管，30 mm × 115 mm 款式Falcon352098
12号一次性羽毛手术刀Fisher ScientificNC9999403
培养皿，100 mm × 15 mm 型号Falcon351029
无菌细胞筛，100 μmFisherbrandcat#22363549

参考文献

  1. Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
  2. Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754(2018).
  3. Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
  4. Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
  5. Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
  6. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
  7. Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
  8. Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849(2017).
  9. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
  10. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
  11. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  12. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  13. Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
  14. Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
  15. Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
  16. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  17. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
  18. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
  19. Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
  20. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
  21. Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107(2016).
  22. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  23. Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490(2013).
  24. Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
  25. Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
  26. Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
  27. Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
  28. Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
  29. Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

气管刷状细胞上皮细胞分离木瓜蛋白酶消化流式细胞分选中性蛋白酶处理细胞活力ChAT eGFP 报告基因FACS 缓冲液碘化丙啶EpCAM 阳性
从小鼠气管中分离和定量评估刷状细胞
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。