小鼠特拉切斯刷细胞的分离与定量评价

Summary

刷细胞是罕见的胆碱能化学感觉上皮细胞发现在天真的小鼠气管。由于其数量有限,其功能在气道免疫和改造中的作用的体外评估具有挑战性。我们描述了一种通过流式细胞测定分离气管刷细胞的方法。

Abstract

流毛刷细胞是胆碱能化学感觉上皮细胞,准备将信号从气道流明传输到免疫和神经系统。它们是化学感觉上皮细胞家族的一部分,包括肠道粘液中的突触细胞、气管中的刷细胞以及鼻黏液中的单独化学感觉和微绒细胞。不同上皮腔的切觉细胞共享关键的细胞内标记和核心转录特征,但也表现出显著的转录异质性,可能反映局部组织环境。需要从单细胞悬浮液中分离气管刷细胞,以详细定义这些稀有上皮细胞的功能,但它们的分离具有挑战性,这可能是由于气管刷细胞和神经末梢之间的密切相互作用或由于气道特异性的紧密和粘附结的组成。在这里,我们描述了从小鼠气管上皮分离刷细胞的过程。该方法基于气管上皮从亚粘液中的初始分离,允许随后用木瓜进行上皮板的较短孵育。此过程为流动细胞分和可行气管刷细胞的功能分析提供了快速、方便的解决方案。

Introduction

刷细胞属于一类化学感官上皮细胞,其特征是苦味受体的表达和味蕾细胞中发现的味觉受体转导机制。与味蕾细胞不同,化学感官上皮细胞分散在上皮表面,被称为鼻上皮1、2、气管^{中的微微神经质细胞。}3,4,和肠中的突子细胞5,6。表达苦味受体和苦味转导机制的皮下细胞也存在于尿^道7、8和听觉管9中。气道刷细胞在神经生成和免疫气道反应中具有独特的功能。它们是乙酰胆碱产生的化学感觉细胞,在用苦化合物和细菌代谢物(如法定感^物质10)激活时引起保护性呼吸反射。气道刷细胞也是IL-25的主要气道上皮来源,它调节气^道3中的气过敏原-2型炎症。

低气道刷细胞的完整转录组及其对环境刺激的反应的表征,由于在气管上皮中数量少,且大支气^管10以外的数量非常有限。用....

Protocol

在进行以下实验之前,确保所有动物护理使用和规程都得到机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准,并符合国家研究理事会的"护理和使用指南"。实验室动物"( ^第8版,2011年)和《大起百万人指南》。下文所述的所有程序都经过布里格姆和妇女医院的机构动物护理和使用委员会的审查和批准。

1. 试剂制备

1. 制备脱脂消化溶液,这是一种PBS溶液,含有16U/mL消沉剂和20μg/mL DNase I。
2. 在 Dulbeco 改性鹰介质 (DMEM) 中加入 5% 的热灭活胎牛血清 (FBS),以做出停止解决方案。
3. 准备Tyrode I缓冲液:在无钙的HEPES-Tyrode缓冲液中加入26 U/mL木瓜(20 μL/mL 48 U/mg木瓜溶液)和10μL/mL-半胱氨酸。
4. 准备Tyrode II缓冲液:用钙向HEPES-Tyrode的缓冲液中加入2μL/mL白蛋白(5毫克/mL)。
5. 准备FACS缓冲液:使用汉克斯平衡盐溶液(HBSS),不含钙、镁和苯酚红色,辅以2 mM乙烯二甲酸乙酸(EDTA),并加入2%FBS。

2. 小鼠特拉切亚的解剖

注:该协议中使用的小鼠为 ChAT^(BAC)-eGFP (B....

Results

这个程序已经成功地实现分离气管刷细胞的RNA测序3。用2步方案分离气管和消化组织后,在排除带有PI的死细胞后,用荧光标记CD45和EpCAM收集并染色细胞。在基于正向和侧散射特性门控双精度点后,我们将画笔单元定义为 CD45 的低/负、EpCAM 的正值和 eGFP 的正数(图 2A)。刷细胞按流动细胞测定表示CD45^低/负细胞的±0.16-0.42%,每个气管占250-600个细胞(图2B)。我们根据我们发表的对气管刷细胞³的广泛免疫组织学评估,将这些计数与 ChAT (BAC)-eGFP 小鼠整个气管支气管支架中 ChAT-eGFP 阳性细胞数量的估计值进行了比较, 此处说明了 (图 3.我们.......

Discussion

我们发现,高剂量消血治疗40分钟,然后短的木瓜治疗(30分钟)的组合为气管消化和刷细胞分离提供了最佳方案。与替代协议相比,这种组合既避免了广泛的消化,又能产生最高产量的刷细胞。

虽然肺消化提取造血细胞传统上依赖于温和的消化酶,如胶原酶IV^15,但分离上皮细胞需要更复杂的方案。上皮细胞的单细胞悬浮体更难实现,因为紧密和粘附结将它们结合在彼此和基底膜上,并且由于细胞本身的弱点。大多数上皮细胞消化协议涉及两个步骤 - 第一步是从基底膜分离上皮,然后后续步骤来干扰紧结和脱毛体,这些结和脱毛体将上皮细胞粘附在彼此上^16,17.

几个组已经成功地从肠道分离化学感觉突体细胞,使用两步协议的不同修改分离上皮细胞:第一步使用EDTA和DTT从亚粘体释放上皮细胞,然后消化上皮片与消沉。Howitt等人使用5 mM EDTA + 1 mM DTT的混合物,然后消化0.5单位/mL分酶I.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>抗体
抗 GFP（多克隆山羊 Ig）	Abcam	cat# ab5450
APC 抗小鼠 CD326 （EpCAM） （G8.8）	Biolegend	cat#118214
APC 大鼠 IgG2a，k 同种型对照	Biolegend	cat#400511
DAPI	Biolegend	cat#422801
驴抗山羊 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488	Life Technologies/Molecular Probes	cat#A-11055
正常山羊 IgG	R&D Systems	cat#AB-108-C
Pacific Blue 抗小鼠 CD45 （30F-11）	Biolegend	cat#103126
Pacific Blue 大鼠 IgG2b，k 同种型对照	Biolegend	cat#400627
TruStain FcX（抗小鼠 CD16/32）抗体	Biolegend	cat#101320
化学品、肽和重组蛋白
分散酶	Gibco	猫# 17105041
DNase I	Sigma	cat# 10104159001
HEPES-Tyrode's 不含钙的缓冲液（10 mM HEPES、135 mM NaCl、2.8 mM KCl、1 mM MgCl2、12 mM NaHCO3、0.4 mM NaH2PO4、0.25% BSA、5.5 mM 葡萄糖。在 18.2 兆欧水中制备，并通过 0.22 µm 过滤器	Boston BioProducts	cat# PY-912
Tyrode's 溶液（HEPES 缓冲）140 mM NaCl、5 mM KCl、25 mM HEPES、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2 和 10 mM 葡萄糖。在 18.2 兆欧水中制备，并通过 0.22 µm 过滤器。）	波士顿生物产品	公司 cat# BSS-355
L-半胱氨酸	Sigma	cat# C7352
亮肽素三氟乙酸盐	Sigma	cat# L2023
木瓜蛋白酶来自木瓜乳胶	Sigma	cat# P3125
碘化丙啶	Sigma	cat# P4170<
strong>实验模型：生物体/菌株
ChATBAC-eGFP （B6.Cg-Tg（RP23-268L19-EGFP）2Mik/J）	杰克逊实验室	7902
设备
LSM 800 配备 Airyscan 共聚焦系统 在 A 蔡司 Axio Observer Z1 倒置显微镜	蔡司
LSRFortessa	BD	647465
一次性设备
1.5 mL 无菌管	Thomas Scientific	1157C86
5 mL Poysterene 圆底管，12 mm x 75 mm 样式	Falcon	14-959-1A
50 mL 聚丙烯锥形管，30 mm x 115 mm 型	Falcon	352098
Feather 一次性手术刀 12 号	Fisher Scientific	NC9999403
培养皿，100 mm x 15 mm 型	Falcon	351029
无菌细胞过滤器，100 μ;m	费舍尔布兰德	猫#22363549