小鼠特拉切斯刷细胞的分离与定量评价

Summary

刷细胞是罕见的胆碱能化学感觉上皮细胞发现在天真的小鼠气管。由于其数量有限,其功能在气道免疫和改造中的作用的体外评估具有挑战性。我们描述了一种通过流式细胞测定分离气管刷细胞的方法。

Abstract

流毛刷细胞是胆碱能化学感觉上皮细胞,准备将信号从气道流明传输到免疫和神经系统。它们是化学感觉上皮细胞家族的一部分,包括肠道粘液中的突触细胞、气管中的刷细胞以及鼻黏液中的单独化学感觉和微绒细胞。不同上皮腔的切觉细胞共享关键的细胞内标记和核心转录特征,但也表现出显著的转录异质性,可能反映局部组织环境。需要从单细胞悬浮液中分离气管刷细胞,以详细定义这些稀有上皮细胞的功能,但它们的分离具有挑战性,这可能是由于气管刷细胞和神经末梢之间的密切相互作用或由于气道特异性的紧密和粘附结的组成。在这里,我们描述了从小鼠气管上皮分离刷细胞的过程。该方法基于气管上皮从亚粘液中的初始分离,允许随后用木瓜进行上皮板的较短孵育。此过程为流动细胞分和可行气管刷细胞的功能分析提供了快速、方便的解决方案。

Introduction

刷细胞属于一类化学感官上皮细胞,其特征是苦味受体的表达和味蕾细胞中发现的味觉受体转导机制。与味蕾细胞不同,化学感官上皮细胞分散在上皮表面,被称为鼻上皮1、2、气管^{中的微微神经质细胞。}3,4,和肠中的突子细胞5,6。表达苦味受体和苦味转导机制的皮下细胞也存在于尿^道7、8和听觉管9中。气道刷细胞在神经生成和免疫气道反应中具有独特的功能。它们是乙酰胆碱产生的化学感觉细胞,在用苦化合物和细菌代谢物(如法定感^物质10)激活时引起保护性呼吸反射。气道刷细胞也是IL-25的主要气道上皮来源,它调节气^道3中的气过敏原-2型炎症。

低气道刷细胞的完整转录组及其对环境刺激的反应的表征,由于在气管上皮中数量少,且大支气^管10以外的数量非常有限。用于从肠道上皮分离化学感觉细胞的技术并没有从气管中产生比例高的数字,可能是因为神经末梢^为10或其他的气管刷细胞的亲密接触呼吸粘部中的组织特异性因子,如粘附物和紧密结蛋白的组成。最近关于单细胞RNA测序分析成功分离高数量的气管刷细胞的报告,要么采用2小时培养,要么用帕金孵育,要么用18小时孵育11,12。由于使用消化酶的较长孵育期会降低细胞活力,并改变消化^组织13细胞的转录轮廓,这可能偏向其他化学感觉上皮种群的比较分析。

在这里,我们报告一种用于RNA测序的气管刷细胞分离方法。用高剂量去巴西气管治疗将上皮从亚粘管中分离出来。随后消化上皮片与木瓜,允许这种结构细胞的出色地恢复。

Protocol

在进行以下实验之前,确保所有动物护理使用和规程都得到机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准,并符合国家研究理事会的"护理和使用指南"。实验室动物"( ^第8版,2011年)和《大起百万人指南》。下文所述的所有程序都经过布里格姆和妇女医院的机构动物护理和使用委员会的审查和批准。

1. 试剂制备

1. 制备脱脂消化溶液,这是一种PBS溶液,含有16U/mL消沉剂和20μg/mL DNase I。
2. 在 Dulbeco 改性鹰介质 (DMEM) 中加入 5% 的热灭活胎牛血清 (FBS),以做出停止解决方案。
3. 准备Tyrode I缓冲液:在无钙的HEPES-Tyrode缓冲液中加入26 U/mL木瓜(20 μL/mL 48 U/mg木瓜溶液)和10μL/mL-半胱氨酸。
4. 准备Tyrode II缓冲液:用钙向HEPES-Tyrode的缓冲液中加入2μL/mL白蛋白(5毫克/mL)。
5. 准备FACS缓冲液:使用汉克斯平衡盐溶液(HBSS),不含钙、镁和苯酚红色,辅以2 mM乙烯二甲酸乙酸(EDTA),并加入2%FBS。

2. 小鼠特拉切亚的解剖

注:该协议中使用的小鼠为 ChAT^(BAC)-eGFP (B6)。Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J,3-6个月,男女年龄。尽量减少组织对直接光的暴露,以减少eGFP的光漂白。

1. 使用100mg/kg五巴比妥安乐死溶液,在腹腔内注射或使用经IACUC批准的标准协议,使小鼠安乐死。
2. 用21G针将鼠标固定在手术板上,并延长上肢和下肢。用 70% EtOH 喷洒毛皮,以消毒区域。
3. 使用直钳,抬起腹部的皮肤和毛皮,并用解剖剪刀(直剪刀,3 厘米)在中心切开。使用剪刀,将皮肤从皮下组织从腹部分离到曼迪布拉。用钳子将皮下组织抱起来时,用剪刀在腹壁的中心进行一个小切口。
4. 用 V 形切口打开围肠。使用钳子,轻轻地移动小肠到一侧,定位腹部主方和vena卡瓦,并用解剖剪刀进行切口,以便快速排泄。
5. 找到隔膜。使用 18 G 针头,在胸骨正下方的隔膜中打开一个开口,使肺部放气。使用尖尖直解剖剪刀小心地将隔膜从肋笼中分离出来,沿肋骨底部切开。
6. 使用钳子,抬起胸骨的外露端,并将胸骨从肋骨笼底纵向切割到颈部。用短直剪刀(2厘米)做一个中央宫颈切口,并分离下颌腺的两个叶。
7. 小心地去除周围的结缔组织和胸腺覆盖卡林纳与一对细点高精度钳子。
8. 首先在气管分裂水平上分离近端,然后在气管分叉水平上解剖远端。因此,首先将气管分离。
9. 找到眼皮骨,并纵向切割气管从眼皮虫到卡利纳。

3. 斜管内皮消化

1. 将气管放入含有750μL预加热(至37°C)的1.5 mL管中。在室温下在 200 rpm 的振动器上孵育 40 分钟。用铝箔盖住管子,以减少对直光的照射。
2. 加入750 μL的冷DMEM与5%FBS停止反应。放在冰上。
3. 将气管转移到培养皿(100 mm x 15 mm)并置于解剖显微镜下。将气管定向,上皮侧朝上。纵向解剖的气管具有半圆柱形,由软柱环保持。上皮在凹面上。
4. 用直钳将气管的眼皮球区用直钳绑在培养皿上,并使用22号一次性手术刀,刮掉气管的上皮。上皮层作为半透明板分离。
5. 用手术刀切碎上皮。将上皮层转移到 2 mL 管中。
6. 用 750 μL 的 Tyrode I 缓冲液冲洗培养皿,并转移到包含上皮层的 2 mL 管中。
7. 在 Tyrode I 缓冲器中孵育气管上皮层 30 分钟,在 37°C 下在 200 rpm 的摇床上孵育。用铝箔盖住管子,以减少对直光的照射。
8. 加入750 μL的冷蒂罗德II缓冲液。涡旋被消化的组织大力为20-30s。用连接到18G针头的注射器将均质化10次。 切换到 21 G 仪表针,再三聚 10-20 次。
9. 通过100μm滤网将细胞过滤成50 mL锥形管。添加 30:1 vol/vol 的冷 FACS 缓冲区。
10. 在 4°C 下以 350 x g旋转 10 分钟,然后丢弃上清液。将颗粒重新悬浮在冷 FACS 缓冲液中,并将悬浮液转移到 12 mm x 75 mm (5 mL) 聚苯乙烯管中。在 4°C 下以 350 x g再次旋转 10 分钟,然后丢弃上清液。
11. 在 100 μL 的 FACS 缓冲液中重新悬浮颗粒。
12. 加入1μL抗小鼠CD16/32阻断抗体,以阻止非特异性结合,并在冰上孵育15分钟。不要清洗。
13. 加入以下抗体和各自的等型对照:太平洋蓝色抗小鼠CD45或大鼠IgG2a,k(0.25μg/10⁶细胞在100μL体积)和异化青霉素(APC)抗小鼠EpCAM或大鼠IgG2b,k(0.5μg/10⁶细胞在100μL体积)单克隆抗体。在冰上孵育45分钟,防止直接光线照射。加入4.5 mL的冷FACS缓冲液,在350 x g下混合和旋转10分钟,在4°C下。丢弃 FACS 缓冲液,在 300 μL 的冷 FACS 缓冲液中重新悬浮颗粒。
14. 在流量细胞分拣之前,立即添加碘化钠 (PI) (5 μg/mL)。
    注:刷细胞具有不规则的形状,具有多个过程,可能会增加它们对过滤器的依从性(图3C)。我们比较了 30 mm 到 70 mm 和 100 mm 的过滤器,发现更大的孔隙过滤器可确保更好的产量。此外,在木瓜消化后细胞悬浮液的彻底三聚化可显著提高刷细胞的产量。我们建议使用18G针头进行初始三次三次分离,然后用较小的孔(21或23G针)对细胞进行更精细的解散。

4. 流式细胞测量测量策略

1. 通过正向和侧面散射角度识别碎屑中产生的细胞。使用正向散射高度和宽度以及侧散射高度和宽度排除双精度值。双精度值是具有高宽度值的单元格。
2. 在单个单元格中,将活细胞标识为 PI 阴性的填充。
3. 在活的单细胞中,根据等型对照识别CD45从低到负细胞。
4. 在CD45低/负细胞内,识别同样为eGFP阳性的EpCAM阳性细胞(在FITC通道中)。这是刷细胞的填充 (图 2A)。

Results

这个程序已经成功地实现分离气管刷细胞的RNA测序3。用2步方案分离气管和消化组织后,在排除带有PI的死细胞后,用荧光标记CD45和EpCAM收集并染色细胞。在基于正向和侧散射特性门控双精度点后,我们将画笔单元定义为 CD45 的低/负、EpCAM 的正值和 eGFP 的正数(图 2A)。刷细胞按流动细胞测定表示CD45^低/负细胞的±0.16-0.42%,每个气管占250-600个细胞(图2B)。我们根据我们发表的对气管刷细胞³的广泛免疫组织学评估,将这些计数与 ChAT (BAC)-eGFP 小鼠整个气管支气管支架中 ChAT-eGFP 阳性细胞数量的估计值进行了比较, 此处说明了 (图 3.我们...

Discussion

我们发现,高剂量消血治疗40分钟,然后短的木瓜治疗(30分钟)的组合为气管消化和刷细胞分离提供了最佳方案。与替代协议相比,这种组合既避免了广泛的消化,又能产生最高产量的刷细胞。

虽然肺消化提取造血细胞传统上依赖于温和的消化酶,如胶原酶IV^15,但分离上皮细胞需要更复杂的方案。上皮细胞的单细胞悬浮体更难实现,因为紧密和粘附结将它们结合在彼此和基底膜上,并且由于细胞本身的弱点。大多数上皮细胞消化协议涉及两个步骤 - 第一步是从基底膜分离上皮,然后后续步骤来干扰紧结和脱毛体,这些结和脱毛体将上皮细胞粘附在彼此上^16,17.

几个组已经成功地从肠道分离化学感觉突体细胞,使用两步协议的不同修改分离上皮细胞:第一步使用EDTA和DTT从亚粘体释放上皮细胞,然后消化上皮片与消沉。Howitt等人使用5 mM EDTA + 1 mM DTT的混合物,然后消化0.5单位/mL分酶I...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>抗体
抗 GFP（多克隆山羊 Ig）	Abcam	cat# ab5450
APC 抗小鼠 CD326 （EpCAM） （G8.8）	Biolegend	cat#118214
APC 大鼠 IgG2a，k 同种型对照	Biolegend	cat#400511
DAPI	Biolegend	cat#422801
驴抗山羊 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488	Life Technologies/Molecular Probes	cat#A-11055
正常山羊 IgG	R&D Systems	cat#AB-108-C
Pacific Blue 抗小鼠 CD45 （30F-11）	Biolegend	cat#103126
Pacific Blue 大鼠 IgG2b，k 同种型对照	Biolegend	cat#400627
TruStain FcX（抗小鼠 CD16/32）抗体	Biolegend	cat#101320
化学品、肽和重组蛋白
分散酶	Gibco	猫# 17105041
DNase I	Sigma	cat# 10104159001
HEPES-Tyrode's 不含钙的缓冲液（10 mM HEPES、135 mM NaCl、2.8 mM KCl、1 mM MgCl2、12 mM NaHCO3、0.4 mM NaH2PO4、0.25% BSA、5.5 mM 葡萄糖。在 18.2 兆欧水中制备，并通过 0.22 µm 过滤器	Boston BioProducts	cat# PY-912
Tyrode's 溶液（HEPES 缓冲）140 mM NaCl、5 mM KCl、25 mM HEPES、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2 和 10 mM 葡萄糖。在 18.2 兆欧水中制备，并通过 0.22 µm 过滤器。）	波士顿生物产品	公司 cat# BSS-355
L-半胱氨酸	Sigma	cat# C7352
亮肽素三氟乙酸盐	Sigma	cat# L2023
木瓜蛋白酶来自木瓜乳胶	Sigma	cat# P3125
碘化丙啶	Sigma	cat# P4170<
strong>实验模型：生物体/菌株
ChATBAC-eGFP （B6.Cg-Tg（RP23-268L19-EGFP）2Mik/J）	杰克逊实验室	7902
设备
LSM 800 配备 Airyscan 共聚焦系统 在 A 蔡司 Axio Observer Z1 倒置显微镜	蔡司
LSRFortessa	BD	647465
一次性设备
1.5 mL 无菌管	Thomas Scientific	1157C86
5 mL Poysterene 圆底管，12 mm x 75 mm 样式	Falcon	14-959-1A
50 mL 聚丙烯锥形管，30 mm x 115 mm 型	Falcon	352098
Feather 一次性手术刀 12 号	Fisher Scientific	NC9999403
培养皿，100 mm x 15 mm 型	Falcon	351029
无菌细胞过滤器，100 μ;m	费舍尔布兰德	猫#22363549