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方法文章

小鼠不同脂肪组织库的鉴定与分离

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DOI：

10.3791/59499

⸱

2019年7月11日

 , 
1Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Michigan Medical School

本文内容

摘要

脂肪细胞存在于离散的脂肪库中，并在其独特的微环境中发挥多种作用。随着对脂肪细胞在不同区域特征和功能差异的不断揭示，标准化地鉴定和分离这些脂肪库对于该领域的进步至关重要。本文中，我们提供了一种详细的小鼠多种脂肪库切除方案。

摘要

脂肪组织是具有多种功能的复杂器官，包括根据局部和全身需求储存和动员能量、通过解偶联代谢产生热量，以及分泌脂肪因子以调节全身稳态和免疫反应。新兴研究正在揭示分布于全身不同部位的脂肪细胞在发育、分子和功能特征方面存在的重要区域差异。这些脂肪库的不同特性具有医学相关性，因为代谢性疾病通常表现出特定脂肪库的效应。本实验方案将为研究人员提供一份详细的小鼠脂肪组织解剖图谱和解剖指南，以实现对多种小鼠脂肪组织的可重复且准确的识别与切除。标准化地分离特定脂肪库将有助于在不同营养和环境条件下，深入比较它们在分子与代谢特性及其对局部和全身病理状态中的作用。

引言

脂肪组织在全身稳态中发挥着关键作用，包括根据局部和整体需求储存和释放能量、体温调节，以及分泌脂肪因子以调节能量平衡、代谢和免疫反应1,2。脂肪细胞在体内以离散的脂肪库形式分布，在某些情况下，其在微环境内具有特殊功能3,4,5。传统上，脂肪组织的研究主要集中于白色脂肪组织（WAT）及其在维持能量稳态中的作用。大多数脂肪细胞分布在皮下和内脏的WAT脂肪库中。这些脂肪库的特性对于代谢性疾病的差异性易感性具有重要意义。位于皮肤下方的皮下脂肪细胞被认为具有保护性的代谢效应5。围绕重要器官分布并存在于性腺、肾周、腹膜后、大网膜和心包脂肪库中的内脏脂肪细胞则通常与代谢紊乱相关，包括2型糖尿病和心血管疾病2。棕色脂肪组织（BAT）也已被广泛研究。棕色及类棕色脂肪细胞表达解偶联蛋白1（UCP1），在适应性产热和葡萄糖稳态中发挥重要作用6,7。经典的棕色脂肪细胞主要存在于肩胛间BAT脂肪库中8。棕色脂肪细胞的簇状结构也可见于其他部位，包括锁骨上、锁骨下/肩胛下、颈部、椎旁和主动脉周围脂肪库8,9。

除了存在于主要的白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）储存部位外，脂肪细胞还分布在全身各处特定的微环境中4，并在其相应的局部微环境中发挥特殊功能。例如，骨髓脂肪组织（BMAT）可作为脂质储存库，是循环脂联素的主要来源，并与成骨细胞、破骨细胞及造血细胞密切相互作用10,11。皮肤脂肪细胞参与多种广泛的生理过程，包括伤口愈合、免疫反应、体温调节以及毛囊生长12,13。此外，心外膜脂肪细胞可产生多种脂肪因子和趋化因子，对冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生和发展产生局部及全身性影响14。肌间和肌内WAT的扩张与体脂增加、系统性胰岛素抵抗以及肌肉力量和活动能力下降呈正相关15。此外，腘窝脂肪细胞在感染期间可作为淋巴系统扩张所需的脂质储存库16。尽管目前对不同关节周围脂肪库的具体功能尚不明确，但现认为膝关节内的Hoffa脂肪体（髌下脂肪体）可能参与前膝疼痛和骨关节炎等疾病的病理过程17。

尽管脂肪细胞在不同解剖区域的特征与功能差异正受到广泛研究，但目前该领域仍受限于缺乏标准化的操作流程，以用于鉴定和分离多种小鼠脂肪组织库。以往发表的方法通常仅描述了一两种特定脂肪库的分离过程，且缺乏实现一致切除所需的详细操作说明18,19。本文所述方案提供了全面的操作指南，详细说明了多种小鼠脂肪组织库的精确解剖位置及分离步骤。尽管本研究主要聚焦于白色脂肪组织（WAT）库的分离，但也详细描述了肩胛间棕色脂肪组织（BAT）的切除方法。采用本方案分离的脂肪组织可用于多种实验终点分析，包括组织块培养研究、组织学分析以及基因表达检测。

本文的目标是为研究人员提供一份详细方案，以清晰、准确地识别和分离小鼠中较为显著和较少研究的脂肪组织库（图1）。该资源将有助于更全面地研究不同微环境中脂肪细胞的发育、分子及功能特性。

小鼠体脂分布示意图，标注脂肪组织，肥胖症科学研究。
图1：本实验方案中分离的小鼠脂肪组织库的示意图。 本图改编自 Bagchi 等，20184。请点击此处查看此图的放大版本。

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方案

所有动物实验程序均经密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 安乐死

注意：本视频方案使用 4 至 6 月龄的 C57BL/6J 小鼠。

  1. 将小鼠放入异氟烷麻醉室，调节异氟烷流速至5%或更高。持续暴露于异氟烷，直至呼吸停止后一分钟。然后将小鼠从麻醉室中取出，并使用经批准的二次确认方法确认安乐死完成。
    注意：经批准的二次确认方法因机构和动物实验方案而异，可能包括颈椎脱位或断头。
  2. 将已实施安乐死的小鼠置于解剖托盘上。使用70%乙醇对小鼠的背侧和腹侧体表进行消毒。确保小鼠体表充分湿润，以尽量减少解剖过程中毛发带来的污染。

2. 主要皮下脂肪组织库（前皮下、背腰部、腹股沟、臀部）及肩胛间棕色脂肪组织的鉴定与分离

  1. 识别并分离前部皮下 WAT
    注意：前部皮下WAT位于小鼠肩胛骨之间，从颈背向下延伸至腋窝7。该脂肪库也被称为肩胛上8或肩胛间20WAT，其正下方紧邻肩胛间BAT脂肪库。
    1. 为分离前部皮下脂肪库，将小鼠俯卧位平放于解剖盘上，用解剖针固定其上下肢。
    2. 用镊子提起颈部背侧皮肤，使用虹膜剪在皮肤上做一个小切口（1 mm）。
    3. 将虹膜剪的一侧刀片插入初始切口，沿中线做一条垂直切口（2–3 cm），从颈背开始沿脊柱向下至背部中段。
    4. 使用虹膜剪在初始垂直切口的顶端和底端分别做两条横向切口（各1 cm），从中线向两侧水平延伸。
    5. 用镊子小心地向后剥离皮肤，暴露前部皮下脂肪库。
    6. 沿组织自然边界使用虹膜剪切除脂肪库。
      注意：此方法同时分离出前部皮下WAT和肩胛间BAT。
    7. 将分离出的脂肪库置于解剖盘上，用虹膜剪小心去除混杂的BAT组织。
  2. 识别并分离经典BAT
    注意：经典BAT位于前部皮下WAT脂肪库下方。
    1. 为分离BAT，使用虹膜剪沿前部皮下组织底部边缘水平剪开，沿脂肪库自然边界进行切割。
    2. 随后使用虹膜剪沿脂肪库两侧边缘做两条垂直切口，遵循组织的自然边界。
    3. 用镊子小心将脂肪库翻起，暴露出嵌于WAT中的蝴蝶形肩胛间BAT，并仔细将其从周围WAT中解剖分离。
  3. 识别并分离后部皮下 WAT，
    1. 将小鼠仰卧位平放。
    2. 用解剖针固定上下肢后，用镊子提起胸骨基底部的皮肤，并在皮肤上做一个小切口（1 mm）。
    3. 将虹膜剪的一侧刀片插入初始切口，沿中线做一条切口（4–5 cm），从胸骨基底部向下延伸至尾根部。进行此切口时需格外小心，因为腹侧皮肤非常薄，且与下方腹膜腔壁紧密相连。
    4. 使用虹膜剪在初始垂直切口的顶端做两条横向切口（各1 cm），从中线向两侧水平延伸。
    5. 用镊子小心将皮肤从腹膜腔和腿部剥离，以寻找仍附着于皮肤上的后部皮下WAT。用解剖针固定展开的皮肤，以便完整切除WAT。
      注意：尽管后部皮下WAT看似连续，但实际上由三个独立的脂肪库组成：背腰、腹股沟和臀部1。其中，背腰部脂肪库从腰椎延伸至后肢基部；三角形的腹股沟脂肪库从前肢基部腹侧横跨腹股沟区域，并含有一个明显的淋巴结；臀部脂肪库从腹股沟基部向下延伸，环绕腿部至尾根部。

3. 内脏脂肪组织库（性腺、肾周、腹膜后、大网膜、心包）的鉴定与分离

  1. 识别并分离内脏 WAT 脂肪库
    注意： 内脏 WAT 脂肪库主要位于胸腔和腹膜腔内，操作时保持小鼠仰卧位。用解剖针将小鼠的四肢固定在解剖盘上。
    1. 用镊子提起胸骨基底部的薄层腹膜壁，使用虹膜剪做一个小切口（1 mm）。
    2. 将虹膜剪的一侧刀片插入切口，从腹膜腔顶部（胸骨基底部）至直肠方向做一条向下垂直切口（4–5 cm）。
    3. 在垂直切口的上端和下端，分别使用虹膜剪从正中线向两侧各做一条横向切口（每条 1 cm）。
    4. 用镊子向后剥离腹膜，暴露腹腔内容物。将展开的腹膜用解剖针固定在解剖盘上。
  2. 识别并分离性腺 WAT
    注意： 性腺 WAT 在雌性小鼠中围绕子宫和卵巢（卵巢或子宫旁组织），在雄性小鼠中则围绕附睾和睾丸（附睾周围）。卵巢 WAT 包绕卵巢、子宫和膀胱。在肥胖动物中，性腺 WAT 与肾周 WAT 可能看似连续——此时应在子宫角和卵巢处将两者分离。附睾 WAT 通常附着于附睾、睾丸以及明显的附睾血管上。
    1. 找到性腺（睾丸或卵巢），用镊子提起与其相关的性腺 WAT。
    2. 使用虹膜剪小心地将 WAT 从性腺上切除。
  3. 识别并分离肾周 WAT
    注意： 肾周 WAT 双侧包绕肾脏。在肥胖动物中，该脂肪库可能向下延伸至子宫角和卵巢的上部。尽管肾周 WAT 传统上被归类为内脏脂肪库21，但多个研究团队通过谱系示踪和放射性标记葡萄糖摄取实验已将其鉴定为棕色脂肪库8,9,20。组织学上，其由白色和棕色脂肪细胞混合组成。
    1. 为切除肾周脂肪库，先找到肾脏，用镊子将其提起并向正中线拉，以清晰观察肾周脂肪库与后腹膜脂肪库之间的分界。
    2. 切除与肾脏直接相关的 WAT。确保将位于肾脏上方的肾上腺从 WAT 中去除。
  4. 识别并分离后腹膜 WAT
    注意： 后腹膜 WAT 位于椎旁位置，沿后腹壁与脊髓交界处分布。
    1. 为切除该脂肪库，用镊子将肾脏提起并向正中线拉动，以清晰观察肾周脂肪库与后腹膜脂肪库之间的边界。
      注意： 在肥胖动物中，识别此边界可能较为困难。
    2. 随后，使用虹膜剪小心地将后腹膜 WAT 从后腹壁剥离。
  5. 识别并分离网膜 WAT
    注意： 网膜 WAT 位于胃的大弯侧。尽管网膜脂肪在人类中是一个重要的脂肪库，但在小鼠中通常仅见于极度肥胖个体。
    1. 为识别内脏网膜 WAT，用镊子提起胃部，使用虹膜剪沿胃的下缘切除相关脂肪组织。注意勿将网膜 WAT 与胰腺混淆。
  6. 识别并分离肠系膜 WAT
    注意： 肠系膜 WAT 是一种网状结构，包绕并与小肠和大肠相关联。
    1. 为切除该脂肪库，从胃底和直肠基部切断，将肠道与其他消化道分离。用镊子将肠道从腹腔中提起并展开。
    2. 使用虹膜剪从十二指肠开始，沿至结肠末端，小心地将肠系膜 WAT 从肠道上剥离。仔细移除与肠系膜脂肪库紧密相连的淋巴结。
  7. 识别并分离心包 WAT
    注意： 心包 WAT 位于脏层心包外侧及壁层心包的外表面，常分布于心脏的下部14。
    1. 为进入胸腔，保持小鼠仰卧位，并用解剖针将四肢固定于解剖盘上。
    2. 用镊子提起剑突（胸骨基底部的软骨），在胸腔壁上做一个小切口（1 mm）。
    3. 将虹膜剪的一侧刀片插入切口，从胸骨基底部向两侧各做一条横向切口（每条 1 cm），以暴露膈肌和胸腔下缘。
    4. 使用解剖剪通过肋骨架从胸腔侧缘向锁骨方向做两条向上垂直切口（3–4 cm）。
    5. 用镊子提起胸骨的腹侧半部，使用解剖剪沿锁骨下缘做最后一条切口（2 cm），以移除肋骨架并暴露胸腔内容物。
    6. 若存在，小心地从心包外表面剥离心包脂肪组织。

4. 其他脂肪组织库的鉴定与分离

  1. 识别与分离心外膜白色脂肪组织
    注意：心外膜白色脂肪组织（WAT）位于脏层心包内，直接与心肌表面相接触。
    1. 若存在，可在灌注后的心脏经10%中性缓冲甲醛固定24小时后，通过组织学方法观察到心外膜脂肪细胞。
  2. 识别与分离腘窝 WAT
    注意：腘窝WAT位于膝关节后方的腘窝内，其中含有一个较大的淋巴结。该脂肪库在年轻动物中通常不可见。
    1. 为分离腘窝WAT，使用虹膜剪从后肢基部至足部小心去除皮肤。
    2. 将髌骨朝下置于解剖盘上，并用针固定足部以拉直腿部。确保膝关节后方的腘窝朝上。
    3. 使用虹膜剪在腓肠肌内侧头和外侧头的下缘处做一切口。用镊子抬起肌肉，暴露出三角形的腘窝脂肪库。
    4. 使用虹膜剪沿天然组织边界切除该脂肪库。
  3. 识别与分离真皮层WAT
    注意：真皮层WAT是位于网状真皮与肉膜肌（panniculus carnosus）之间的一层薄薄的脂肪细胞。
    1. 为通过组织学方法识别真皮脂肪细胞，将小鼠俯卧位放置。用解剖针固定上下肢后，以70%乙醇喷洒小鼠体表以润湿皮肤。
    2. 使用手术刀从小鼠背部一块方形皮肤区域去除湿润的毛发。
    3. 使用虹膜剪小心切除该剃毛区域的皮肤，包括网状真皮、真皮层WAT、肉膜肌以及部分皮下WAT。
    4. 使用手术刀将切除的皮肤切成细长的垂直条状。
    5. 将细长条状皮肤放置，使其黏性的皮下WAT层朝下。
    6. 从一端开始，将条带自身卷起形成螺旋状。螺旋外部黏性的皮下WAT层可使卷状结构在固定过程中保持形状。
    7. 将螺旋状样本置于24孔板的孔中，加入10%中性缓冲甲醛，固定24小时后再进行组织学处理22。
  4. 识别与分离肌间WAT
    注意：肌间WAT广义上指位于肌肉深筋膜下方的脂肪细胞。该术语包括骨骼肌纤维之间分散分布的脂肪细胞（也称为肌内WAT），以及位于肌束内部的脂肪细胞。野生型小鼠通常不含大量肌间脂肪细胞。然而，在特定条件下可通过组织学方法识别肌间WAT。在某些情况下，肌间脂肪细胞也可能存在于平滑肌中，例如膈肌。
    1. 以分离胫前肌（TA）为例，将小鼠仰卧位放置，并用解剖针将后肢固定于解剖盘上。用70%乙醇润湿皮肤，以减少毛发污染。
    2. 使用虹膜剪小心去除腿部皮肤，暴露位于膝关节上方股骨干处的股四头肌群，以及位于膝关节下方胫骨腹侧的TA肌肉。
      注意：TA肌肉在胫骨近端较厚，远端则更趋腱性。
    3. 使用虹膜剪切除一块肌肉组织，并在组织学处理前用10%中性缓冲甲醛固定24小时22。
  5. 识别与分离关节内WAT脂肪库
    注意：关节内WAT脂肪库位于滑膜关节内部。
    1. 例如，为通过组织学方法识别髌下脂肪垫，可按照BMAT部分所述详细步骤采集腿部骨骼。
    2. 在移除股骨-胫骨复合体后，使用虹膜剪和纱布尽可能去除肌肉和结缔组织。注意不要破坏胫股关节。
    3. 在脱钙及组织学处理前（见下文步骤4.6.8），将股骨-胫骨复合体用10%中性缓冲甲醛固定24小时。
  6. 识别与分离骨髓脂肪组织
    注意：骨髓脂肪组织（BMAT）存在于骨骼内部，与造血细胞交错分布。解剖学上，BMAT可分为组成型（分布于胫骨远端和尾椎）和调控型（分布于胫骨中至近端、股骨及腰椎）10,11。在小鼠中，为RNA和蛋白质分析而进行骨髓脂肪细胞的纯净分离具有挑战性。然而，小鼠骨骼可方便地采集后进行固定、脱钙和石蜡包埋，用于组织学分析。
    1. 例如，为采集腿部骨骼，首先将小鼠后肢整体取下。使用解剖剪切断髋臼-股骨关节，保持股骨头完整。
    2. 使用虹膜剪小心去除腿部皮肤，暴露腿部肌肉。
    3. 使用虹膜剪和纱布小心剥离附着于股骨和胫骨上的主要肌肉。
    4. 当股骨暴露后，沿骨边缘追踪至骨盆与股骨的连接处，小心将股骨头从髋臼-股骨关节中释放。用纱布清除股骨上残留的组织。
    5. 沿胫骨边缘追踪至踝关节，小心将位于胫骨末端的内踝从踝关节中分离。
    6. 一旦股骨-胫骨复合体被分离，使用虹膜剪和/或纱布尽可能去除肌肉和结缔组织。
    7. 通过将虹膜剪的一侧刀片插入胫股关节，轻轻切断内侧和外侧副韧带以及前、后交叉韧带，从而将胫骨与股骨分离。注意不要移除膝关节囊，以确保胫骨保持完整。用纱布清除胫骨上残留的组织。
    8. 将骨骼在室温下用10%中性缓冲甲醛固定24小时，随后根据后续需求进行清洗和储存。
      1. 若需使用微型计算机断层扫描（µCT）分析骨参数，请将骨骼储存在Sorensen磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中23。
      2. 为进行BMAT定量和组织学分析，将骨骼在14% EDTA（pH 7.4）中脱钙10–14天。
      3. 脱钙后，可采用四氧化锇染色结合µCT分析对BMAT进行定量24；否则，按常规流程处理并石蜡包埋骨骼用于组织学分析23。

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结果

通过上述方案可成功鉴定并分离小鼠多种脂肪组织。图中显示了皮下脂肪（A，E-F）、棕色脂肪（B）、内脏脂肪（C，D，G-J）以及腘窝脂肪（K）的大体解剖位置。 图2.

用于解剖学研究的啮齿类动物内脏解剖示意图，可见标注的结构。
图 2：小鼠脂肪组织库的大体解剖位置。 C57BL/6J 成年小鼠的（A）前皮下脂肪、（B）棕色脂肪、（C）附睾脂肪（b，膀胱）、（D）卵巢脂肪（u，子宫角）...

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讨论

随着人们对不同脂肪细胞簇在分子和功能特性上的多样性日益重视，领域内的研究人员统一识别并切除脂肪组织库以进行后续分析变得至关重要。迄今为止，关于小鼠多种脂肪组织库的标准化定位与分离，尚缺乏足够的实验方案。以往发表的方法主要集中在一两个脂肪库，且缺少不同研究人员进行一致识别和切除所需的详细信息18,19。本文对脂肪生物学领域具有新颖且重要的贡献，因为它提供了对小鼠体内常见及较少被研究的脂肪库解剖位置和精确解剖的深入指南。文中还提供了大体解剖学位置和组织学分析，以展示脂肪细胞微环境的多样性。

采用本方案成功分离出离散的脂肪组织库依赖于多个关键步骤。保持解剖环境的清洁至关重要；必要时可使用70%乙醇清除解剖托盘和工具上的污染毛发或血液。在分离后侧皮下白色脂肪组织（WAT）时，皮肤的初始切口切勿穿透与其紧密相邻的腹膜腔，以便有效分离两层组织并暴露WAT。同样，在切开腹膜壁以暴露腹腔内容物时，切口不得穿破下方的肠道，以防受到消化物质的污染。肩胛间棕色脂肪组织（BAT）必须从周围...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

O.A.M. 获得美国国立卫生研究院（NIH）基金 DK062876 和 DK092759 的资助；D.P.B. 获得密歇根大学医学科学家培训项目（T32GM007863）、密歇根大学器官发生培训项目（T32HD007605）、密歇根大学拉克姆优秀奖学金以及泰诺未来护理奖学金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 中性缓冲福尔马林Fisher Scientific22-110-869
24 孔板，未处理Sigma-AldrichCLS3738
70% 乙醇（由 95% 稀释）Fisher Scientific04-355-226
带弯曲尖端的解剖镊VWR89259-946
解剖盘Carolina Biological Supply Company629004
解剖剪刀（尖头/钝头）VWR82027-588
纱布海绵Vitality Medical2634Curity 4 英寸 × 4 英寸纱布海绵，12 层
解剖用 Handy-PinsCarolina Biological Supply Company629132
虹膜剪刀（直型）VWR470018-890
异氟烷VetOne501017
手术刀VWR100499-578Feather 手术刀柄配刀片，一次性

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