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通过电穿孔转染CRISPR/Cas9核糖核蛋白实现精确基因编辑

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DOI：

10.3791/59512

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2019年6月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics, Department of Internal Medicine, University of Michigan Medical Center, 2Celetrix LLC

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用电穿孔管对哺乳动物细胞进行高效CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的基因编辑的实验方案。

摘要

以CRISPR相关蛋白9（Cas9）为代表的基因编辑核酸酶正成为生物医学研究中的主流工具。通过转染将CRISPR/Cas9元件成功递送至靶细胞，是实现高效基因编辑的前提条件。本实验方案表明，采用电穿孔管（TE）设备介导CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）与单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体模板共同递送至多种哺乳动物细胞，可实现高效且精确的基因编辑。首先，应用TE技术将CRISPR/Cas9 RNP与ssODN递送至兔成纤维细胞，以在白细胞介素2受体γ亚基（IL2RG）基因和蝶呤还原酶（SPR）基因中诱导致病性突变。经细菌TA克隆测序分析，获得3.57%–20%的精确突变率。随后，该策略被应用于人诱导多能干细胞（iPSCs），靶向多个临床相关基因，包括表皮生长因子受体（EGFR）、心肌肌球蛋白结合蛋白C（Mybpc3）以及血红蛋白β亚基（HBB）基因。深度测序（DeepSeq）结果显示，突变精确率稳定维持在较高水平（11.65%–37.92%）。本研究证明，采用电穿孔管递送CRISPR/Cas9 RNP是一种适用于哺乳动物细胞基因编辑的高效转染方案。

引言

CRISPR/Cas9 是基因编辑中最常用的可编程核酸酶。其作用机制依赖于单导向RNA（sgRNA）介导的靶序列识别，同时识别基因组中的靶序列和相邻的原间隔序列邻近基序（PAM）。Cas9核酸酶在PAM序列上游三个核苷酸的位置产生双链DNA断裂（DSB）1。这些DSB可通过易错的非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）途径进行修复。为了通过HDR途径实现精确的基因编辑，通常需提供供体模板，其形式为质粒DNA（pDNA）或单链寡脱氧核苷酸（ssODN）。

CRISPR/Cas9 与 sgRNA 可通过三种形式递送至细胞：Cas9 蛋白与 gRNA 组成的核糖核蛋白（RNP）复合物2,3；Cas9 mRNA 与 sgRNA4,5；或包含必要启动子、驱动表达的 sgRNA 以及 Cas9 编码区的质粒 DNA（pDNA）6,7,8。许多研究团队已证实，当以 RNP 形式递送 CRISPR/Cas9 时，基因编辑效率通常优于 pDNA 或 mRNA 形式，这归因于 RNP 的尺寸远小于核酸分子9。此外，先前研究已表明，一种新型的试管电穿孔（TE）设备在多种细胞类型的基因编辑应用中尤为高效9。

本研究展示了一种利用转座电穿孔（TE）技术将CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）递送至多种哺乳动物细胞中多个临床相关位点的逐步操作方案。这种新型的TE转染技术及其高同源定向修复（HDR）效率现象，可能在生物医学研究中具有广泛的应用前景。

方案

所有动物的饲养、护理和使用程序均经密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准。

1. 细胞准备

  1. 从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获取人诱导多能干细胞（iPSCs，ACS-1030）。按照供应商说明，将iPSCs在人工细胞外基质上，使用无饲养层细胞培养基（见材料表）于细胞培养箱中（37 °C，5% CO2）进行培养。
    1. 转染前2小时，用10 µM Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y27632处理iPSCs（该抑制剂可减少解离后人hiPSCs的凋亡，提高其存活率和克隆效率，且不影响其多能性）。
    2. 转染时，使用细胞解离液（见材料表）在37 °C下将iPSCs解离为单细胞，持续5分钟。计数细胞数量。
  2. 采用兔耳皮肤组织活检样本建立原代兔成纤维细胞培养体系，方法如前所述10。
    1. 从兔耳尖端获取一块0.5 cm × 0.5 cm的耳部皮肤活检组织。剃除耳组织表面的毛发。
    2. 用含5%青霉素-链霉素的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗组织两次。将耳组织转移至新的6 cm组织培养皿中，切成小块（约1.0 mm × 1.0 mm）。滴加数滴胎牛血清以防止组织干燥。
    3. 将切碎的组织铺于10 cm组织培养皿中，加入10 mL培养基。兔成纤维细胞在含10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。将培养皿置于细胞培养箱中（37 °C，5% CO2）。
    4. 接种后3至5天，使用胰蛋白酶-EDTA在37 °C下消化细胞2分钟。计数细胞数量。

2. gRNA 和供体寡核苷酸的设计与合成

  1. 针对每个基因，使用在线工具（例如，<http://crispor.tefor.net/>）根据靶位点的序列设计向导RNA（gRNA）。
  2. 粘贴目标DNA序列。
  3. 选择基因组和原间隔序列邻近基序（PAM）。输入的DNA序列中可能的向导序列将在输出页面中显示。建议选择预测效率较高且脱靶效应较低的gRNA。
  4. 通过商业供应商合成用于转录gRNA的DNA模板，并按照gRNA合成试剂盒的制造商说明进行体外转录。
  5. 使用gRNA合成试剂盒中包含的RNA纯化微柱纯化gRNA。测定浓度后，将gRNA储存于-80 °C。
  6. 为每个突变位点设计单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体模板。ssODN可由IDT等商业供应商合成。通常，每个ssODN长度为120–160个核苷酸（nt），包含60–80 nt的左侧同源臂和60–80 nt的右侧同源臂。为防止编辑后的DNA被再次切割，应尽可能在ssODN中引入PAM区域的同义突变。CRISPR切割位点应尽可能靠近预期的基因组改变位置。

3. Cas9核糖核蛋白和ssODN的管式电穿孔

  1. 按照第1节所述方法准备细胞。
  2. 将2-3 × 105个细胞重悬于20 µL电穿孔缓冲液中。轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液。
  3. 进行Cas9 RNP转染时，室温（RT）下预先将2 µg Cas9-NLS蛋白与0.67 µg gRNA混合孵育10-15分钟。随后，将形成的RNP复合物与2 µg ssODN轻柔地与细胞混合。
  4. 使用电穿孔试剂盒提供的通用适配移液器吸头，将细胞混合物转移至20 µL电穿孔管中。为获得更好的电穿孔效果，转移过程中应尽量避免产生气泡。
  5. 将电穿孔管插入电穿孔仪的插槽中，按下"Go"键完成操作。请遵循制造商针对每种细胞类型推荐的参数设置。例如，对于人iPSCs和兔成纤维细胞，设定电压为420 V，脉冲时间为30 ms。电穿孔是否成功可通过电穿孔仪显示屏上的脉冲报告进行确认。
  6. 电穿孔后，将人iPS细胞转移至1 mL含Y-27632的预温培养基中（培养基配方见细胞培养部分）。对于兔成纤维细胞，则转移至含10%胎牛血清的DMEM培养基中。
  7. 将重悬的细胞接种至12孔细胞培养板的一个孔中。
  8. 每天更换培养基。人iPSC培养基中的Y-27632在电穿孔后24小时移除。

4. 基因编辑事件的分析

  1. 电穿孔后72小时收集细胞。使用胰蛋白酶-EDTA消化兔成纤维细胞，或使用细胞解离溶液消化人诱导多能干细胞。离心后，用350 mL裂解缓冲液（1 M Tris HCl、5 M NaCl、0.5 M EDTA；pH 8.0、10% SDS，每1 mL裂解缓冲液中加入20 µL的20 mg/mL蛋白酶K储备液）重悬细胞，并在55 °C下孵育过夜。
  2. 采用标准操作程序，使用苯酚-氯仿提取基因组DNA。
  3. 使用高保真DNA聚合酶扩增包含靶向区域的100–200 bp DNA片段，然后使用凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化DNA片段，或使用PCR SV mini试剂盒直接从PCR产物中纯化。
  4. 为通过细菌菌落测序确定基因编辑效率，使用TOPO TA克隆试剂盒将纯化的PCR产物连接至pCR4-TOPO载体中。随机挑选细菌克隆，使用TOPO TA克隆试剂盒提供的通用测序引物对插入片段进行测序。
  5. 为通过深度测序确定基因编辑效率，将步骤4.3中获得的纯化PCR产物（约100–200 bp）送至DNA测序核心实验室进行CRISPR扩增子测序。

结果

将 Cas9 RNP 和 ssODN 递送至兔成纤维细胞

TE介导Cas9核糖核蛋白递送至哺乳动物细胞的整体流程如图1所示。首先，在兔成纤维细胞中对IL2RG基因引入C231Y和Q235X突变，并在SPR基因中引入R150G突变。已知IL2RG和SPR基因的功能缺失突变分别会导致原发性免疫缺陷11和运动及认知功能障碍12。

特异的sgRNA设计如图2A所示。用于扩增靶向区域的引物列于表3中。ssODN序列见表1。基因编辑效率通过细菌TA克隆法测定（图2B）。在IL2RG C231位点，共测序28个克隆，其中1个（3.57%）携带精确的C231Y突变，4个（14.28%）携带插入或缺失（indel）突变，其余23个（82%）为野生型。在IL2RG Q235位点，共测序27个克隆，其中2个（7.41%）携带精确的Q235X突变，3个（11.11%）携带indel突变，其余为野生型。在SPG R150位点，共测序20个克隆，其中5个（25%）携带精确的R150G突变，10个（50%）携带indel突变，其余为野生型。

将 Cas9 RNP 和 ssODN 递送至人 iPSC

随后采用TE技术将Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）和单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）递送至人诱导多能干细胞（iPSCs），以靶向EGFR、Mybpc3和HBB基因中具有临床意义的位点。EGFR基因T790位点邻近区域的点突变可导致携带EGFR激活突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药性13。Mybpc3基因第16外显子的移码突变与肥厚型心肌病相关14。HBB基因的E6V点突变可引发镰状细胞病15。

特异的sgRNA设计如图3A所示。用于扩增靶向区域的引物列于表3中。ssODN序列见表1。基因编辑效率通过深度测序（DeepSeq）确定（图3B）。在EGFR位点，15.68%的等位基因携带精确的点突变（6,315条读长），22.75%携带插入缺失突变（9,162条读长），其余61.57%为野生型（24,797条读长）。在Mybpc3位点，37.92%携带精确的4个碱基TGAA缺失（11,654条读长），2.24%携带插入缺失突变（410条读长），其余59.84%为野生型（18,692条读长）。在HBB位点，11.65%携带精确的E6V突变（6,565条读长），23.35%携带插入缺失突变（13,163条读长），其余65%为野生型（36,644条读长）。

通过Cas9核糖核蛋白进行细胞培养到基因编辑，采用离心管电穿孔；流程示意图。
图1：Cas9核糖核蛋白离心管电穿孔流程图。

CRISPR基因编辑；DNA序列比对图；HDR与Indels对比；sgRNA结合位点。
图2：兔成纤维细胞的基因编辑。（A）靶序列示意图。方框表示靶向位点，带下划线的字母对应gRNA序列，红色字母表示PAM序列。（B）基因编辑事件的TA克隆结果。方框表示精确突变的位点，所示的Indel序列为一种等位基因类型的代表，其他Indel序列未显示。请点击此处查看此图的放大版本。

CRISPR 基因编辑比较；包含 EGFR、HBB、Mybpc3 修饰的序列比对图；HDR 和插入缺失结果。
图 3：人类诱导多能干细胞的基因编辑。（A）靶序列示意图。方框表示靶向位点。带下划线的字母对应 gRNA 序列。红色字母表示 PAM 序列。（B）基因编辑事件的深度测序结果。方框表示精确突变的位点。红色字母表示在供体模板中引入的同义突变。所示插入缺失序列仅代表一种等位基因类型，其他插入缺失序列未显示。请点击此处查看该图的放大版本。

位点寡核苷酸序列
 
（靶向突变）
Rabbit IL2RG (C231Y)AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTATGGGAGTGCTCAGCATTGGAGT
GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT
Rabbit IL2RG (Q235X)AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTGTGGGAGTGCTTAGCATTGGAGT
GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT
Rabbit SPRgacctccatgctctgcctgacctcctgcatcctgaaggcgtttcctgccagtcctggCctcagcgggactgtggtgaacatctcgtcgctgtgtgccctgcagcccttcaagggctggg
cgctgtac
(R150G)
Human EGFRACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCTACAGTCCAACTGATTACCC
AGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTAC
（T790附近点突变）
Human Mybpc3GCCCCCTGTGCTCATCACGCGCCCCTTGGAGGACCAGCTGGTGATGGTGGGGCAGCGGGTGGAGTTTGCGAGGTATCGGA
GGAGGGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTTCCAGAAGCACGGGGCATGGGTGTTGGGGGCAT
（4-bp缺失）
Human HBB TCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCAGTTACTGCC
CTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAG
(E6V)

表1：ssODN序列。

步骤问题可能的原因溶液
2.1低插入缺失率gRNA设计不佳，gRNA储存液 >6 个月，低浓度向导 RNA重新设计向导RNA，制备/订购新的向导RNA。
2.3PGE 效率低供体DNA设计不佳、向导RNA效率低下、供体DNA用量不当或DNA质量差增加同源臂长度，引入PAM突变，对供体DNA引入同义突变，使用更高效的引导RNA，优化Cas9蛋白与引导RNA的比例。
3.4转染失败电转过程中将细胞-缓冲液混合物转移至电转管时产生气泡，电压/时长设置错误尽量避免气泡形成，调整电压/持续时间设置。
3.6电穿孔后细胞存活率低人源单个iPS细胞存活率低电穿孔后添加ROCK抑制剂，增加细胞数量。
4.1PCR失败高GC含量或重复序列优化PCR条件，在PCR体系中加入DMSO。

表2：常见问题的故障排除指南。

引物名称序列备注
Rb-IL2RG-FCATGACAGTGACAGGGTCCC用于扩增兔 IL2RG DNA 片段
Rb-IL2RG-RTGCCAGAGACACAAGCGAAC
Rb-SPR-FGTACTTTGGAGGGACAGAGG用于扩增兔 SPR DNA 片段
RB-SPR-RCTCAGCACCCTGACACTGGG
H-EGFR-FTGATGGCCAGCGTGGACAAC用于扩增人 EGFR DNA 片段
H-EGFR-RACCAGTTGAGCAGGTACTGGG
H-Mybpc3-FATGCCCCGTGCTTCTGGAAC用于扩增人 Mybpc3 DNA 片段
H-Mybpc3-RTCAGGGGAGCCAACCCTCAT
H-HBB-FTAACCTTGATACCAACCTGC用于扩增人 HBB DNA 片段
H-HBB-RCATTTGCTTCTGACACAACT

表3：步骤4.3中使用的引物。

讨论

管式电穿孔法可有效将CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）和单链寡脱氧核苷酸（ssODN）递送至兔和人类细胞，实现高效且精确的基因编辑（PGE）。TE与传统电穿孔设备的主要区别在于使用了一种特殊设计的管状结构，其中两个电极分别位于管的顶部和底部，样品在完全装入后即密封并进行电穿孔（图1）。相比之下，传统比色皿的电极位于两侧，且在电穿孔过程中样品未完全密封。这种新设计减少了气泡的产生并压缩了气泡的尺寸，从而改善了电场电压的均匀分布，最终降低了细胞死亡率并提高了转染效率9。在本研究中，针对人诱导多能干细胞（iPSCs）中的EGFR、Mybpc3和HBB基因，实现了较高的精确基因编辑率（15%–37%）。这些结果与先前在人类干细胞中实现高精确基因编辑率的报道一致9。

在兔细胞中靶向了IL2RG和SPR基因的致病性突变。近期已成功构建IL2RG基因敲除兔，作为人类X连锁严重联合免疫缺陷症（SCID-X1）的模型16,17。本研究显示，可在兔细胞中高效产生患者来源的IL2RG突变（例如C231Y和Q235X），证明了构建携带患者突变的SCID-X1兔模型的可行性。同时证明，SPR基因R150G突变也可在兔细胞中高效构建。该突变可导致儿童出现运动和认知功能障碍12。一旦成功建立，这些携带IL2RG和SPR突变的兔模型可作为转化医学研究中宝贵的临床前模型，并可用于开发基于基因编辑的单基因病治疗策略。

CRISPR/Cas9介导的基因编辑应用的一个关注点是脱靶编辑事件。本研究中使用的sgRNA在预测的主要脱靶位点处的插入缺失（indel）率，采用先前描述的方法进行了分析9（见表S1）。总共分析了sg-rb-IL2RG-01的7个潜在主要脱靶位点、sg-rb-SPR的5个、sg-hEGFR的7个、sg-hMybpc3的5个以及sg-hHBB的7个脱靶位点，所用引物列于表S2中。T7E1检测未发现任何脱靶插入缺失（图S1），表明使用这些sgRNA进行CRISPR/Cas9介导的基因编辑具有极低的脱靶风险。这也说明管式电穿孔方法本身不会引起或增加脱靶编辑。然而，仍应致力于减少或消除不必要的脱靶编辑。对于拟用于临床应用的细胞，可能需要通过全基因组测序来排除此类事件。

在技术层面，以下因素被认为是通过CRISPR/Cas9 RNP电穿孔实现高效精确基因组编辑的关键。首先，建议选择具有预测低脱靶效应的高效sgRNA。在将选定的sgRNA用于精确基因编辑（PEG）应用之前，必须验证其插入缺失（indel）效率。软件预测效果良好的sgRNA在验证步骤中失败的情况并不少见。

其次，为了实现较高的同源定向修复效率（PGE），建议在可能的情况下对单链寡核苷酸（ssODN）供体引入PAM突变。其原理在于，这样做可以防止CRISPR/Cas9在供体模板整合后再次切割。在某些情况下，PGE本身即可引入PAM突变；而在其他情况下，可以在PAM序列中引入沉默突变。如果无法实现PAM突变，则建议尽量在供体中引入多个对应于sgRNA序列的沉默突变。

第三，对于转染电穿孔（TE）而言，尤其需要注意的是，在将细胞和RNP混合物转移至电穿孔管时，应避免产生气泡。尽管电穿孔管的设计本身已尽可能减少气泡的形成，但谨慎操作可进一步降低甚至完全避免气泡的产生。针对在采用电穿孔管进行CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的精确基因编辑过程中可能遇到的常见问题，表2提供了相应的故障排除指南。

综上所述，本文证明了管式电穿孔是一种将CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）和单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）递送至哺乳动物细胞以实现高同源定向修复（PGE）效率的有效方法。这种新型的TE转染技术及其稳定的精确基因编辑效率，可能有助于推动基因编辑技术的应用发展。

披露

J. C. 供职于 Celetrix LLC，该公司为管式电穿孔仪的制造商。L. M.、L. J.、J. S.、D. Y.、J. Z.、Y. E. C. 和 J. X. 宣布无竞争利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（R21OD023194，授予JX）资助。本工作使用了密歇根大学医学中心转化科学与治疗学先进模型中心（CAMTraST）资助的核心服务。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AccutaseSTEMCELL Technologies792人iPSC的细胞解离溶液，首次使用于步骤1.1.2。 
Cas9 Nuclease 3NLSIDT1074182Cas9蛋白，首次使用于步骤3.3。 
DMEMThermo Fisher11965092用于细胞培养，首次使用于步骤1.2.3。 
DPBSThermo Fisher1708075用于制备细胞培养液，首次使用于步骤1.2.2。 
EDTALonza51201用于配制裂解缓冲液，首次使用于步骤4.1。 
Electroporation bufferCeletrix13–0104电穿孔缓冲液，首次使用于步骤3.2。 
Electroporation tubesCeletrix20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104电穿孔管，首次使用于步骤3.4。 
ElectroporatorCeletrixCTX-1500A LE管式电穿孔仪，首次使用于步骤3.5
Fetal bovine serumSigma Aldrich12003C用于细胞培养，首次使用于步骤1.2.2。 
Forma CO2 IncubatorsThermo FisherModel 370用于细胞培养，首次使用于步骤1.1。 
Gel Extraction KitQiagen28115用于凝胶纯化，首次使用于步骤4.3。 
Human  induced pluripotent stem cellsAmerican Type Culture CollectionACS-1030人iPSC，首次使用于步骤1.1。 
Matrigel                           Corning354277人工细胞外基质；用于细胞培养板的预包被，首次使用于步骤1.1。 
mTeSR 1 medium STEMCELL Technologies85850无饲养层人iPSC培养基，首次使用于步骤1.1。 
PCR SV miniGeneAll103-102用于PCR产物纯化，首次使用于步骤4.3。 
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher15140163用于制备细胞培养液，首次使用于步骤1.2.2。 
Phenol-chloroformThermo Fisher15593031用于DNA提取，首次使用于步骤4.2。 
Precision gRNA Synthesis KitInvitrogenA29377用于全长gRNA（向导RNA）的合成，首次使用于步骤2.4。 
Proteinase K SolutionThermo FisherAM2548用于DNA提取，首次使用于步骤4.1。 
Q5 high-fidelity DNA polymeraseNEBM0491用于PCR扩增，首次使用于步骤4.3。 
Sodium dodecyl sulfateSigma AldrichL3771用于配制裂解缓冲液，首次使用于步骤4.1。 
TA Cloning Kit Thermo FisherK457502用于TA克隆测序，首次使用于步骤4.4。 
Tissue Culture Dish (10 cm)FALCON353003用于细胞培养，首次使用于步骤1.2.3。 
Tissue Culture Dish (12 well)FALCON353043用于细胞培养，首次使用于步骤3.7。 
Tissue Culture Dish (6 cm)FALCON353004用于细胞培养，首次使用于步骤1.2.2。 
Tris HClThermo FisherBP1757-500用于配制裂解缓冲液，首次使用于步骤4.1。 
Trypsin-EDTAThermo Fisher25200056用于细胞消化，首次使用于步骤1.2.4。
Universal Fit Pipette Tips Celetrix14-0101用于电穿孔，首次使用于步骤3.4。 
Y27632LC LabsY-5301凋亡抑制剂，首次使用于步骤1.1.1。 

参考文献

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
  3. Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
  4. Miller, J. B., et al. Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).
  5. Finn, J. D., et al. A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
  6. Liang, C., et al. Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma. Biomaterials. 147, 68-85 (2017).
  7. Luo, Y. L., et al. Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles. ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).
  8. Wang, H. X., et al. Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).
  9. Xu, X., et al. Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation. Scientific Reports. 8 (1), 11649(2018).
  10. Du, F., et al. Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).
  11. Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M. GeneReviews(R). Adam, M. P., et al. , (1993).
  12. Friedman, J., et al. GeneReviews(R). Adam, M. P., et al. , (1993).
  13. Hidaka, N., et al. Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).
  14. Ma, H., et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).
  15. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  16. Song, J., et al. Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency. Frontiers in Immunology. 9, 429(2018).
  17. Song, J., et al. Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting. Scientific Reports. 7 (1), 12202(2017).

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