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方法文章

原子吸收光谱法测定哺乳动物细胞内锌池

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DOI：

10.3791/59519

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2019年5月16日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在使用动物模型之前，培养的原代细胞或永生化细胞系通常被用作研究基本生物学和机制问题的初步方法。本实验方案描述了如何制备全细胞提取物和亚细胞组分，用于通过原子吸收光谱法研究锌（Zn）及其他微量元素。

摘要

过渡金属是生物体必需的微量营养素，但在高浓度下可能对细胞产生毒性，其机制包括与蛋白质中的生理金属竞争结合位点以及引发氧化还原应激。导致金属缺乏或积累的病理状态是多种人类疾病的致病因素。一些实例包括贫血、肠病性肢端皮炎以及威尔逊病和门克斯病。因此，能够以高灵敏度和高准确性测定生物样品中过渡金属的含量及其转运情况，对于研究这些元素如何参与正常的生理功能及毒性机制具有重要意义。例如，锌（Zn）是许多哺乳动物蛋白质的辅因子，参与细胞信号传导过程，并作为细胞内的第二信使。过量的锌具有毒性，可抑制其他金属的吸收；而锌缺乏则可能导致多种潜在致命的病症。

石墨炉原子吸收光谱法（GF-AAS）是一种高灵敏度且有效的方法，可用于测定多种生物样品中锌及其他过渡金属的浓度。通过GF-AAS进行电热原子化，将微量样品原子化后，利用目标元素的特征激发波长进行选择性吸收分析，从而实现金属的定量。在比尔-朗伯定律的线性范围内，金属对光的吸光度与待测物的浓度成正比。与其他测定锌含量的方法相比，GF-AAS能够在微量样品中以高灵敏度检测蛋白质中游离态和结合态的锌，甚至可能检测小分子细胞内化合物中的锌。此外，与电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）或基于同步辐射的X射线荧光技术相比，GF-AAS更易于获得和使用。本文描述了针对不同培养细胞系进行系统性样品制备以用于GF-AAS分析的方法。作为原理验证，比较了增殖细胞与分化细胞的全细胞裂解液及亚细胞组分中该微量元素含量的差异。

引言

锌（Zn）、铜（Cu）、锰（Mn）和铁（Fe）等过渡金属和重金属在环境中天然存在，既存在于食物营养成分中，也存在于污染物中。所有生物体都需要不同量的这些微量营养素；然而，暴露于高浓度金属会对生物体产生有害影响。金属的摄取主要通过饮食途径，但也可能通过吸入或经皮肤吸收1,2,3,4,5。值得注意的是，大气颗粒物中金属的含量正在增加，且已广泛与健康风险相关联。由于人类活动的影响，银（Ag）、砷（As）、镉（Cd）、铬（Cr）、汞（Hg）、镍（Ni）、铁（Fe）和铅（Pb）等重金属在大气颗粒物、雨水和土壤中的浓度已显著升高6,7。这些金属可能与体内必需的生理微量元素（尤其是锌和铁）发生竞争，并通过使生物过程中的关键酶失活而引发毒性效应。

微量元素 Zn 为氧化还原中性，在生物反应中作为路易斯酸发挥作用，因此是超过 10% 哺乳动物蛋白质进行蛋白质折叠和催化活性所必需的基本辅因子8,9,10；因此，Zn 对多种生理功能至关重要8,11。然而，与许多微量元素一样，这些金属在促进正常生理功能与引发毒性之间存在微妙的平衡。在哺乳动物中，Zn 缺乏会导致贫血、生长迟缓、性腺功能减退、皮肤异常、腹泻、脱发、味觉障碍、慢性炎症以及免疫和神经功能受损11,12,13,14,15,16,17,18。过量时，Zn 具有细胞毒性，并会干扰铜等其他必需金属的吸收19,20,21。

此外，某些金属（如 Cu 和 Fe）可能参与有害反应。通过芬顿化学反应产生活性氧（ROS）会干扰铁硫簇蛋白的组装，并改变脂质代谢22,23,24。为了防止此类损伤，细胞利用金属结合伴侣蛋白和转运蛋白来避免毒性效应。毫无疑问，必须严格调控金属稳态，以确保特定细胞类型维持适当的金属水平。因此，迫切需要发展准确测定生物样品中痕量金属的技术。在发育中和成熟的生物体中，不同细胞类型、不同发育阶段以及正常与病理状态下，对微量元素的生物学需求存在差异。因此，精确测定组织和系统中的金属含量对于理解生物体金属稳态至关重要。

石墨炉原子吸收光谱法（GF-AAS）是一种高灵敏度的技术，适用于小体积样品，非常适合用于测定生物和环境样品中存在的过渡金属和重金属25,26,27,28。此外，由于该技术具有高灵敏度，已被证明适用于以非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞为模型系统研究Na+/K+-ATP酶和胃H+/K+-ATP酶的精细转运特性29。在GF-AAS中，样品内原子化的元素会吸收由含有目标金属的光源发射的特定波长辐射，所吸收的辐射量与该元素的浓度成正比。当吸收紫外或可见光辐射时，元素的电子发生激发，这是一个对每种化学元素都独特的量子化过程。在单电子过程中，光子的吸收涉及原子内一个电子从较低能级跃迁至较高能级，而GF-AAS通过测定样品吸收的光子数量来定量，该数值与石墨管中原子化的辐射吸收元素数量成正比。

该技术的选择性依赖于原子的电子结构，每种元素都具有特定的吸收/发射光谱线。以锌（Zn）为例，其吸收波长为213.9 nm，可与其他金属明确区分。总体而言，石墨炉原子吸收光谱法（GF-AAS）可用于定量检测锌，具有足够的检出限（LOD）、高灵敏度和高选择性25。吸收波长的变化被积分并表现为在特定且孤立波长处的能量吸收峰。样品中锌的浓度通常根据已知浓度的标准曲线，依据朗伯-比尔定律计算得出，其中吸光度与样品中锌的浓度成正比。然而，将朗伯-比尔定律应用于GF-AAS分析时也存在一些复杂情况。例如，原子化过程的差异和/或样品中浓度分布不均可能影响金属含量的测定结果。

石墨炉原子吸收光谱法（GF AAS）痕量元素分析所需的金属原子化过程包括三个基本步骤。第一步是去溶剂化，即蒸发掉液态溶剂，当炉温升至约100 °C时，留下干燥的化合物。随后，通过将温度升高至800至1,400 °C（根据待测元素的不同而有所变化），使这些化合物气化成为气体。最后，在1,500至2,500 °C的温度下，气态化合物被原子化。如上所述，目标金属浓度的增加会导致GF-AAS检测到的吸收信号成比例增强，但石墨炉会缩小分析的动态范围，即仪器能够测定的浓度工作范围。因此，该技术要求使用较低的浓度，并需通过确定方法的检出限（LOD）和比尔-朗伯定律的线性范围上限（LOL）来仔细界定其动态范围。LOD是指能够检测到某种物质所需的最低量，定义为基质中Zn的标准偏差的三倍。LOL则是指可依据比尔-朗伯定律进行检测的最高浓度。

在本研究中，我们描述了一种标准方法，用于分析全细胞提取物、细胞质和细胞核组分以及增殖和分化培养细胞中的锌（Zn）含量图1）。我们针对不同细胞体系改进了细胞核的快速分离方案，以防止样品制备过程中金属的丢失。所使用的细胞模型包括：源自小鼠卫星细胞的原代成肌细胞、小鼠神经母细胞瘤细胞（N2A 或 Neuro2A）、小鼠 3T3-L1 脂肪细胞、人源非致瘤性乳腺上皮细胞系（MCF10A）以及上皮性 Madin-Darby 犬肾（MDCK）细胞。这些细胞来源于不同的谱系，是研究谱系特异性金属含量差异的良好模型 体外.

源自小鼠卫星细胞的原代成肌细胞是一种较为理想的 体外 用于研究骨骼肌分化的模型。在高血清条件下培养时，这些细胞增殖迅速；通过转为低血清条件，可诱导其向肌源性谱系分化。30小鼠神经母细胞瘤（N2A）永生化细胞系源自小鼠神经嵴。这些细胞具有神经元样和阿米巴样干细胞形态。在分化刺激下，N2A细胞表现出多种神经元特性，例如含有神经丝蛋白。N2A细胞常用于阿尔茨海默病、神经突生长及神经毒性的研究。31,32,333T3-L1 小鼠前脂肪细胞系常用于研究与脂肪生成相关的代谢和生理变化。这些细胞具有成纤维细胞样的形态，但在诱导分化后，会表现出与脂质合成和甘油三酯积累相关的酶活性激活，这一过程可通过细胞质内脂滴形成的形态学变化进行观察。34,35MCF10A 是一种非肿瘤性乳腺上皮细胞系，源自一名患有乳腺纤维囊性疾病的未绝经女性36它已广泛用于与乳腺癌发生相关的生化、分子和细胞研究，如细胞增殖、迁移和侵袭。Madin-Darby 犬肾（MDCK）上皮细胞系被广泛用于研究与上皮表型建立相关的特性及分子事件。当达到汇合状态时，这些细胞会极化并形成细胞间黏附，这是哺乳动物上皮组织的典型特征。37.

为了检测原子吸收光谱法（AAS）测定哺乳动物细胞中锌（Zn）水平的能力，我们分析了这五种细胞系的全细胞及亚细胞组分（胞质溶胶和细胞核）。AAS测定结果显示，这些细胞类型中的锌浓度存在差异。增殖和分化中的原代成肌细胞中锌浓度较低（每毫克蛋白质含4至7 nmol），而四种永生化细胞系中的锌浓度较高（每毫克蛋白质含20至40 nmol）。与增殖细胞相比，分化中的原代成肌细胞和神经母细胞瘤细胞中锌水平有轻微但无统计学意义的升高。而在分化后的脂肪细胞中则观察到相反的现象。然而，与分化后的细胞相比，增殖状态的3T3-L1细胞表现出更高的金属浓度。重要的是，在这三种细胞系中，亚细胞分级分离结果显示，锌在胞质溶胶和细胞核中的分布随细胞代谢状态的不同而有所差异。例如，在增殖的成肌细胞、N2A细胞和3T3-L1前脂肪细胞中，大部分锌定位于细胞核。在使用特定细胞处理诱导分化后，这三种细胞类型中的锌则主要定位于胞质溶胶。有趣的是，两种上皮细胞系在增殖期间的锌水平均高于达到汇合状态时的水平，后者形成了特征性的紧密单层结构。在增殖的上皮细胞中，乳腺细胞系MCF10A的锌在胞质溶胶和细胞核之间的分布均等，而在肾源性细胞系中，大部分锌位于细胞核。当这两种细胞类型达到汇合状态时，锌主要定位于胞质溶胶。这些结果表明，石墨炉原子吸收光谱法（GF-AAS）是一种高度敏感且准确的技术，可用于低产量样品的元素分析。GF-AAS结合亚细胞分级分离技术，可被用于研究不同细胞系和组织中痕量金属元素的水平。

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方案

1. 哺乳动物细胞培养

  1. 一般注意事项
    1. 遵循先前综述过的哺乳动物细胞培养的无菌操作技术38。
    2. 将所有细胞系维持在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中。不同细胞类型的培养条件各不相同。必须为所使用的每种细胞系维持适当的培养条件，因为操作步骤的任何变化都可能导致异常表型或细胞培养失败。
    3. 熟悉目标细胞系的特性，并遵循针对特定实验所选细胞类型提供的操作方案（见下文示例）。
  2. 贴壁细胞胰酶消化与传代的一般操作流程
    1. 通过抽吸移除培养皿中的细胞培养基。
    2. 使用不含钙和镁的PBS轻轻洗涤细胞（每10 cm2培养表面积使用5 mL）。将洗涤液加至培养皿侧壁，避免冲落单层细胞；轻摇培养皿以使溶液充分覆盖表面。对于上皮细胞，需在37 °C培养箱中用PBS孵育10至15分钟，以促进后续步骤中的细胞解离。
    3. 通过抽吸移除洗涤液。
    4. 向培养皿中加入足量的解离试剂（0.25%胰蛋白酶）（约每10 cm2加0.7 mL）。轻柔晃动培养皿，确保胰酶完全覆盖细胞单层。
    5. 在室温下孵育2至5分钟。实际孵育时间因细胞系而异；对于上皮细胞，建议在37 °C培养箱中孵育10至15分钟。在显微镜下观察细胞是否已解离。
    6. 当大部分细胞已解离时，用5 mL预热的铺板或生长培养基回收细胞悬液。通过反复吹打细胞单层区域，机械性地分散细胞团块。
    7. 将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，在1,000 x g条件下离心2至5分钟。离心速度和时间根据细胞类型而定。小心抽吸去除上清液，注意不要触碰细胞沉淀。用5至10 mL预热的适当生长培养基重悬细胞沉淀，并取样使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
    8. 根据各特定细胞系推荐的接种密度，取适量细胞悬液进行接种（见下文示例）。根据培养皿大小补充适量培养基，并将细胞放回培养箱中继续培养。
  3. 源自小鼠卫星细胞的原代成肌细胞
    1. 开始前，准备用于原代成肌细胞生长的胶原包被培养皿。将含有0.02%胶原和0.05 M乙酸的去离子水溶液通过0.22 µm无菌滤器过滤除菌。将培养皿与胶原溶液在37 °C孵育过夜。
    2. 次日，抽吸去除胶原溶液，在无菌操作台中让培养皿自然晾干，并于4 °C保存备用。
      注：胶原溶液最小用量为：35 mm培养皿=1 mL；60 mm培养皿=2 mL；10 cm培养皿=5 mL。
    3. 在55 cm2胶原包被的培养皿中以1 × 104 个细胞/cm2的密度接种原代成肌细胞。增殖培养基为含20%胎牛血清（FBS）、25 ng/mL重组碱性成纤维细胞生长因子（FGF）和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM/Ham’s F12营养混合培养基。
      注：增殖期及储备细胞应维持在不超过50%汇合度。细胞接触会诱导其向肌源性分化方向承诺，从而损害细胞的增殖能力。
    4. 为诱导原代成肌细胞分化，让细胞生长至80%至100%汇合度（通常在接种后48小时达到），然后更换为分化培养基（DMEM，含2%马血清、1%胰岛素-转铁蛋白-硒A补充剂和100 U/mL青霉素/链霉素）。每天更换培养基直至收获细胞。
  4. 小鼠神经母细胞瘤细胞（N2A）
    1. 将N2A细胞以2 × 104 个细胞/cm2的密度接种于生长培养基中，该培养基为低血清培养基/高糖DMEM与L-谷氨酰胺的混合液（1:1, v:v），并补充10% FBS和100 U/mL青霉素/链霉素。储备培养物应维持在50%以下汇合度。
    2. 当细胞汇合度达到25%至40%时，开始诱导N2A细胞分化。更换为含低血清培养基/DMEM、1% FBS和20 µM维甲酸的分化培养基，持续培养7至10天。每隔一天更换一次培养基，直至收获细胞。
      注：N2A细胞在分化过程中部分细胞会变圆、容易脱落，并可能发生凋亡。在抽吸和添加培养基时需格外小心。
  5. 3T3-L1小鼠前脂肪细胞
    1. 将小鼠3T3-L1细胞维持在高糖DMEM中，补充10% FBS和100 U/mL青霉素/链霉素。脂肪生成过程依赖于细胞汇合度，因此储备培养物不应超过50%汇合度，否则会影响细胞的分化能力。
    2. 以2 × 104 个细胞/cm2的密度接种细胞。在此密度下，细胞将在3天内达到汇合状态。
    3. 在细胞达到100%汇合度后两天，启动脂肪生成分化。诱导培养基由含10% FBS、10 μg/mL胰岛素、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 μM地塞米松和10 μM曲格列酮的DMEM组成。
    4. 在诱导培养48小时后，更换为分化培养基（含10% FBS和5 μg/mL胰岛素的DMEM）。每隔一天更换一次培养基，直至收获细胞。典型的完全分化样本通常在脂肪生成诱导后7至10天采集。
      注：随着脂肪生成进程推进，细胞逐渐变圆并易于脱落。在抽吸和添加培养基时需格外小心。
  6. MCF10A细胞
    1. 将MCF10A细胞接种于DMEM/F12（1:1, v:v）培养基中，补充5% FBS、100 U/mL青霉素/链霉素、0.5 µg/mL氢化可的松、10 µg/mL胰岛素和20 ng/mL表皮生长因子（EGF）。推荐接种密度为1 × 105 个细胞/cm2。在此条件下，细胞将在4天内达到100%汇合度。每2至3天更换一次培养基，直至收获细胞。
      注：MCF10A细胞较难解离。建议在胰酶消化前，先在不含钙的PBS中加入0.5 mM EDTA，并在37 °C孵育10至15分钟。
  7. Madin-Darby犬肾细胞（MDCK）
    1. 将MDCK细胞接种于补充有10% FBS和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM中。推荐接种密度为1 × 105 个细胞/cm2，在此条件下细胞将在3天内达到100%汇合度。每2天更换一次培养基，直至收获细胞。
      注：MDCK细胞较难解离。建议在胰酶消化前，先在不含钙和镁的PBS中于37 °C孵育5至10分钟。为防止细胞聚集，在等待细胞解离期间切勿敲击或摇晃培养瓶。

2. 用于原子吸收光谱法的哺乳动物细胞培养样品制备：全细胞及亚细胞组分分离

  1. 在 55 cm2 培养皿中培养目标细胞。使用较小的培养皿可能导致金属含量低于 GF-AAS 的检测限。
  2. 全细胞提取物
    1. 使用真空泵吸除培养基，确保完全去除残留培养基。用预冷的不含钙和镁的 PBS 缓冲液冲洗目标时间点或培养条件下的细胞三次。
    2. 立即使用新的塑料细胞刮刀，在 1 mL 不含钙和镁的 PBS 中将细胞刮下，转移至 1.5 mL 微量离心管中，于 2,000 × g 离心 2 分钟，吸除上清液。此步骤可暂停，将细胞沉淀样品保存于 -20 °C，或继续进行步骤 2.4。
  3. 亚细胞组分分离
    1. 使用真空泵吸除培养基，确保完全去除残留培养基。用预冷的不含钙和镁的 PBS 缓冲液冲洗目标时间点或培养条件下的细胞三次，然后用 1 mL 预冷的不含钙和镁的 PBS 将细胞从培养皿上刮下。
    2. 将样品转移至 1.5 mL 微量离心管中并置于冰上。在 10,000 × g 条件下离心 10 秒。若需分析胞质和细胞核组分中的金属含量，则应立即快速分离细胞核。此操作可最大程度减少因细胞裂解导致的金属损失39,40。
    3. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 400 μL 含 0.1% 非离子去污剂 Nonidet P-40 (NP-40) 的预冷 PBS（不含钙和镁）中。取 100 μL 转移至新的微量离心管中作为全细胞样品，该等分试样占总样品的 25%。
    4. 在冰上使用 P1000 移液器吸头反复吹打细胞悬液 5 至 10 次以分离细胞核。上皮细胞的细胞核分离需使用 0.5% NP-40 浓度。通过 26 ¾ G 针头反复推注细胞悬液 10 至 15 次，随后再通过 30 ½ G 针头推注 10 至 15 次，以实现细胞解离。
      注：使用 40 倍物镜通过光学显微镜检查细胞核完整性。
    5. 将剩余的细胞裂解液悬液（300 μL）在 10,000 × g 条件下离心 10 秒，上清液即为胞质组分，将其 300 μL 转移至新的微量离心管中。
    6. 用 500 μL 含 0.1% NP-40 的预冷 PBS（不含钙和镁）冲洗含有细胞核组分的沉淀，然后在 10,000 × g 条件下离心 10 秒。吸除上清液，将含有细胞核的沉淀重悬于 100 μL 相同溶液中。
      注：此步骤可暂停，样品可保存于 -20 °C。
  4. 采用超声破碎法进行细胞裂解，共进行三个循环（每次 30 秒开启/30 秒关闭，频率 50 kHz，功率 200 W），总时长 5 分钟。使用 Bradford41 法测定样品中的总蛋白含量。
  5. 使用针对细胞核组分（组蛋白、染色质重塑蛋白、核基质蛋白）或胞质组分（β-微管蛋白、β-肌动蛋白）的特异性抗体，通过 Western 印迹法对各组分纯度进行质量控制（图 2）。
    注：请勿使用金属探头的超声破碎仪，以免造成金属污染。

3. 采用原子吸收光谱法分析哺乳动物细胞培养物的全细胞及亚细胞组分中的锌含量

  1. 使用等体积的浓 HNO₃ 通过酸消解法消解细胞培养样品（全细胞或细胞核组分）。3 痕量金属级（注意）80℃下处理1小时 °C，然后在20℃过夜 °C.
  2. 通过加入相当于反应体积30%的H终止反应2O2. 将样品体积调至 500 μL，含18 MΩ 纯化水
    注意：HNO₃3 操作时应佩戴化学防护眼镜、防溅面罩、手套；若无 adequate ventilation（通风橱），还需佩戴经批准的防蒸气呼吸器。本方案可在此暂停。样品可在室温（RT）下保存。
  3. 使用配备石墨炉的原子吸收光谱仪测定锌含量时，制备标准溶液和实验样品。
    1. 使用 2% (v/v) HNO₃3 去离子水中配制的溶液，使用与标准曲线相同的批次作为全程校准用空白溶液。使用分析纯标准品，用18 MΩ 纯化水
    2. 使用市售的1,000 ppm Zn储备液，用含2%（v/v）HNO₃的溶液配制1,000 ppb的Zn标准溶液3 用去离子水配制溶液。将100 ppb标准液用2%（v/v）HNO₃直接稀释至5、8、10、15、20和25 ppb，制备工作标准溶液。3 0.1%（1 g/L）Mg(NO₃)₂ 的去离子水溶液。使用该溶液配制锌标准品和空白样。3)2 基体改进剂
      注：Zn 的检出限为 0.01 ppb（µ克/升）。通过提高标准品浓度，确定锌的线性范围上限为 20 纳克/毫升（图3).
    3. 在相同的优化条件下测定标准品和样品：进样流速为 250 mL/min，进样温度为 20 °C，石墨炉温度为1,800 °C.
      注意：GF 温度已升高至 2450 °C 用于在注入新样品或标准品之前的清洗步骤。
    4. 将灯（C-HCL）优化至电流20 A、波长213.9 nm、狭缝0.7 nm。
    5. 使用锌标准曲线测定矿化样品以确定金属含量。由于测量体积较小，若测量耗时较长，样品可能发生蒸发。因此，建议向样品中添加水。用18 MΩ 经0.01% HNO₃处理的纯化水3 （分析纯），如果所获得的数据超出检出限。
      注意：通常，样品需稀释至500 μL的体积。 µL，放入AAS自动进样器中，待标准曲线建立后立即进行测定。所需体积应由用户确定，并需考虑后续浓度计算。建议一次性完成整个实验的锌含量测定。中断测量可能导致较大的实验变异和不一致。
  4. 将通过原子吸收光谱法（AAS）测得的ppb浓度转换为摩尔浓度。需考虑Zn的质量 ‎（65.39 amu）。将原子吸收光谱法（AAS）测得的ppb值除以63,390,000。在细胞中，Zn的浓度范围从数个pmol到 µ摩尔
    1. 将 Zn 的浓度（pmol 或 µmol) 除以通过 Bradford 法测定的样品初始蛋白质量（步骤 2.4）。该计算将得出金属含量（pmol 或 µ每毫克样品蛋白所含的锌的物质的量（mol Zn）
      注意：在进行金属含量测定时，需充分考虑所使用的稀释倍数。

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结果

我们测试了石墨炉原子吸收光谱法（GF-AAS）检测哺乳动物细胞中微量锌（Zn）的能力（图1）。为此，我们培养了从小鼠卫星细胞分离的原代成肌细胞，以及已建立的细胞系 N2A（神经母细胞瘤来源）、3T3 L1（脂肪细胞）、MCF10A（乳腺上皮细胞）和 MDCK 细胞（犬肾上皮细胞）。首先，我们分离了上述所有细胞类型的全细胞、胞质和核组分，并通过蛋白质印迹法（western blot）评估各组分的纯度（图2）。以染色质重塑因子 Brg1 和微管蛋白（tubulin）分别作为核组分和胞质组分的标志物进行代表性免疫检测，结果表明第2.3节所述的亚细胞组分分离方案适用于后续的元素分析（图2）。全细胞及亚细胞组分按前述方法制备用于 GF-AAS 分析，仪器校准后获得典型的线性标准曲线（图3）。

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讨论

原子吸收光谱法是一种用于微量生物样品中锌含量测定的高度敏感方法。本文所述的锌检测优化方案使该方法的应用变得简便，并确保了理想的分析条件。在此，我们利用石墨炉原子吸收光谱法（GF-AAS）测定了不同细胞系的全细胞以及胞质和核组分中的锌浓度。结果表明，该技术所得结果与荧光探针和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）获得的结果相当。例如，多种荧光探针显示线粒体中游离锌水平在0.1至300 pM范围内，高尔基体中的锌水平低于皮摩尔范围，而内质网中的锌水平为800至5,000 pM42，这些数值与在胞质组分中检测到的锌水平一致。此外，锌响应性荧光染料FluoZin-3显示，在MCF10A和C2C12细胞的小型胞质囊泡中有游离锌的积累43,44，这也与本研究中在胞浆内定量的锌含量相符。另外，本课题组采用ICP-MS对分化中的原代肌管细胞进行锌分析的结果表明，其全细胞锌水平与本研究中通过GF-AAS获得的结果相似45。此外，使用原子吸收光谱...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了马萨诸塞大学医学院教员多样性学者奖对 T.P.-B. 的资助。N.N.-T. 受墨西哥公共教育部分部-国家科学技术委员会（SEP-CONACYT）资助，项目编号 279879。J.G.N. 受美国国家科学基金会资助，项目编号 DBI 0959476。作者感谢 Daryl A. Bosco 博士提供 N2A 细胞系，以及 Daniella Cangussu 提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤Sigma AldrichI5879
乙酸Sigma Aldrich1005706
抗 Brg1 抗体 (G7)Santa Cruz biotechnologiessc-17796
抗 β-微管蛋白抗体 (BT7R)Thermo ScientificMA5-16308
BradfordBiorad5000205
地塞米松Sigma AldrichD4902
杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)ThermoFischer-Gibco11965092
杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物 (DMEM/F12)ThermoFischer-Gibco11320033
杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (DPBS)ThermoFischer-Gibco14190144
表皮生长因子 (EGF)Sigma AldrichE9644
胎牛血清 (FBS)ThermoFischer-Gibco16000044
成纤维细胞生长因子-碱性 (FGF) (AA 10-155)ThermoFischer-GibcoPHG0024
马血清ThermoFischer-Gibco16050122
氢化可的松Sigma AldrichH0888
过氧化氢 (H2O2)Sigma Aldrich95321
胰岛素Sigma Aldrich91077C
胰岛素-转铁蛋白-硒-AThermoFischer51300044
硝酸 (HNO3)Sigma Aldrich438073
壬基酚聚氧乙烯醚 (NP-40)Thermo Scientific85125
OptiMEM (低血清培养基)ThermoFischer-Gibco31985070
青霉素-链霉素ThermoFischer-Gibco15140148
PureCol (胶原蛋白)Advanced BioMatrix5005
视黄酸Sigma AldrichPHR1187
曲格列酮Sigma Aldrich648469-M
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红ThermoFischer-Gibco25200056
锌 (Zn) 纯单元素标准品，1,000 µg/mL，2% HNO3Perkin ElmerN9300168
已建立的细胞系
3T3-L1American Type Culture CollectionCL-173
MCDKAmerican Type Culture CollectionCCL-34
MCF10AAmerican Type Culture CollectionCRL-10317
N2AAmerican Type Culture CollectionCCL-131
设备
原子吸收分光光度计PerkinElmerAanalyst 800
BioruptorDiagnodeUCD-200

参考文献

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