利用动静脉瘘合并流出道狭窄建立中心静脉狭窄的小鼠模型

摘要

通过穿透小鼠肾下腹主动脉的双层管壁进入下腔静脉，建立主动脉-下腔静脉瘘，随后通过部分结扎下腔静脉在其流出道处形成狭窄。该可重复模型可用于研究中心静脉狭窄。

摘要

中心静脉狭窄是导致动静脉瘘（AVF）失功的重要因素。本研究改良了一种小鼠AVF模型，通过对瘘管流出道中的下腔静脉（IVC）进行部分结扎，模拟中心静脉狭窄。本文介绍了该模型的技术细节。首先，通过腹部切口暴露腹主动脉和下腔静脉。分离肾下腹主动脉和下腔静脉以进行近端阻断，并暴露远端主动脉以便穿刺。仔细游离左肾静脉与主动脉分叉之间中点处的下腔静脉，以便在其下方置入一根8-0缝线。在阻断腹主动脉和下腔静脉后，使用25 G针头穿透肾下腹主动脉前后壁进入下腔静脉完成动静脉瘘的建立，随后将一根22 G静脉（IV）导管与下腔静脉共同结扎。之后撤出导管，从而形成可重复且不完全闭塞的静脉狭窄。确认原发性止血成功后，松开腹主动脉和下腔静脉的阻断夹。这一新型中心静脉狭窄模型操作简便、可重复性强，将有助于推动AVF失功机制的研究。

引言

动静脉瘘（AVF）是血液透析最常用的通路，与其他通路（如移植物或中心静脉导管）相比，其通畅率更高且感染风险更低。然而，高达60%的AVF无法成熟^1,2,3；最近一项系统综述报道，AVF术后1年的初级通畅率仅为60%⁴。静脉流出道的狭窄是导致AVF无法成熟的主要原因^5,6。某些特定部位在瘘口近端较易发生狭窄：桡动脉-头静脉瘘的吻合口邻近摆动段、肱动脉-头静脉瘘的头静脉弓区域，以及既往曾在同侧放置过锁骨下静脉或颈内静脉导管的患者其瘘管的中心静脉部位^7,8。

对于没有动静脉瘘（AVF）的患者，中心静脉狭窄通常无症状，但在存在动静脉瘘时，由于静脉高压可导致同侧肢体水肿，并因血流冲击而影响瘘管成熟⁹。中心静脉狭窄的病理生理机制很可能与器械置入后引发的炎症反应及凝血级联激活有关。此外，导管尖端的持续移动以及动静脉瘘带来的血流增加会改变剪切应力，导致血小板沉积和静脉壁增厚¹⁰。为了理解由中心静脉狭窄引起的动静脉瘘功能障碍的基本机制，需要建立一种模拟中心静脉狭窄合并动静脉瘘的动物模型。

我们建立了一种易于操作和掌握的小鼠主动脉-下腔静脉瘘模型，能够重现人类动静脉瘘的临床病程¹¹。我们结合了多种既往建立的小鼠模型的概念与技术，创建了一种具有静脉狭窄的新颖小鼠动静脉瘘模型。本文介绍一种在流出道瘘管中带有下腔静脉狭窄的小鼠主动脉-下腔静脉瘘模型，可用于中心静脉狭窄的研究。

方案

所有实验均经耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后进行。

1. 麻醉与术前操作

1. 使用高压灭菌器对所有手术器械和材料进行灭菌。打开热支持装置，确保其温度达到40–42 °C。
2. 将一只9–11周龄的C57BL/6小鼠放入丙烯酸诱导室中，用2.5%异氟烷气体和0.8 L/min氧气进行麻醉。麻醉诱导约需3分钟。
3. 将小鼠从诱导室中取出，通过脚趾夹、耳夹和尾夹测试确认其处于深度麻醉状态。将小鼠仰卧位放置于手术区域，使用硅胶面罩持续给予2.5%异氟烷。皮下注射0.1 mg/kg剂量的丁丙诺啡作为镇痛剂，并在眼睛上涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。
4. 使用脱毛剂Nair去除小鼠颈部腹侧至下腹部的毛发。
5. 采用两步法对手术区域进行清洁和消毒，依次使用10%聚维酮碘和70%异丙醇。覆盖无菌手术巾。

2. 手术操作步骤

1. 暴露夹闭部位和穿刺点
   1. 准备无菌器械并佩戴无菌手套，以在整个手术过程中维持无菌状态。
   2. 使用手术刀从肝脏下缘水平至耻骨上方做一条沿中线的皮肤切口，随后用剪刀剪开肌层以进入腹腔。
   3. 将牵开器插入腹腔，将肠管向右侧牵拉并用生理盐水浸湿的纱布包裹以保持湿润。取出膀胱和精囊（雄性小鼠），并向尾侧牵拉。使用显微持针器分离直肠与后腹膜之间的系膜，以充分暴露腹主动脉和下腔静脉（IVC）。
   4. 使用显微持针器将肾下腹主动脉和下腔静脉连同其外侧及背侧周围后腹膜组织整块分离，以便同时进行跨夹闭。
   5. 进一步分离周围组织，暴露腹主动脉穿刺点，该点位于左肾静脉至腹主动脉分叉处距离的约四分之三处。
2. 下腔静脉分离
   1. 在左肾静脉远端紧邻处开始，分离肾下段下腔静脉与腹主动脉之间的组织，并向远端延伸至左肾静脉与腹主动脉分叉中点位置，以便术后可观察到狭窄段上游和下游的下腔静脉。
      注意：应在左肾静脉远端紧邻处进行钝性分离，因为此处下腔静脉与腹主动脉之间的结缔组织相对疏松。
   2. 在该水平处制作一个“窗口”，将下腔静脉与腹主动脉分离，并继续游离下腔静脉周围组织。首先将一根8-0单丝聚酰胺缝线置于下腔静脉和腹主动脉下方（图1A），然后通过将缝线末端穿过所制窗口，将其仅置于下腔静脉下方（图1B）。
      注意：由于下腔静脉较为脆弱，沿腹主动脉外膜进行分离有助于建立窗口，避免损伤下腔静脉及其细小分支或腹主动脉分支。若发生出血，可能难以控制。当下腔静脉存在明显侧支时，应在侧支远端预先放置一根8-0缝线。
3. 动静脉瘘（AVF）建立
   1. 将25 G针头在距针尖约4 mm处弯成45–60°角。
   2. 使用显微夹夹闭肾下腹主动脉和下腔静脉。
   3. 抓住腹主动脉分叉周围的结缔组织，将腹主动脉向内侧和尾侧旋转，使穿刺部位暴露并轻微拉向腹侧。
   4. 在适当固定腹主动脉位置后，使用已准备好的25 G针头从腹主动脉穿刺进入下腔静脉（图1C）。
   5. 释放腹主动脉，并用主动脉左侧牵起的周围组织覆盖穿刺点。拔出针头后，用棉签轻压穿刺部位以实现止血。
4. 建立下腔静脉狭窄
   1. 将22 G静脉留置针针尖（见材料表）纵向放置于下腔静脉表面。使用8-0缝线将留置针与下腔静脉一起结扎（图1D），随后拔出留置针。
   2. 确认初步止血成功（图1E），然后松开腹主动脉和下腔静脉的夹闭。继续覆盖穿刺点至少1分钟，确保完全止血。
      注意：夹闭时间不宜过长，以免导致狭窄段远端下腔静脉血栓形成。
   3. 将器官复位，并用6-0缝线关闭腹腔。

3. 术后操作步骤

1. 关闭腹部切口后，停止异氟烷吸入。将小鼠放入一个单独的无垫料笼子中，并将笼子置于保温支持装置上，以防止低体温。
   注意：需观察小鼠直至其达到并维持胸卧位。根据当地实验动物护理与使用委员会（IACUC）的建议，实施术后护理，包括镇痛和伤口护理。对于镇痛，我们在手术后每12小时按0.1 mg/kg剂量肌肉注射一次布托啡诺，持续48 小时，之后根据需要继续使用。
2. 术后使用多普勒超声（见材料表）确认动静脉瘘的通畅性。此外，根据需要测量其他血管和血流特征。

结果

雄性小鼠接受上述手术以同时建立动静脉瘘（AVF）和下腔静脉狭窄（IVC stenosis）。对照组小鼠仅接受剖腹术及下腔静脉周围组织的分离，即假手术处理，或仅建立下腔静脉狭窄而不同时建立动静脉瘘。

术后第7天通过多普勒超声观察下腔静脉（IVC）（图2）。在纵切面中可清晰识别IVC的瘘管和狭窄区域（图2C、E）。在同时存在动静脉瘘（AVF）和狭窄的小鼠中，瘘管与狭窄之间的IVC段出现扩张。在狭窄部位处分析IVC的超声波形（图2D、F）。仅存在狭窄而无AVF的小鼠，其狭窄段呈现静脉波形，频谱增宽程度较假手术小鼠更明显，但搏动性不显著。然而，在同时存在AVF和狭窄的小鼠中，狭窄段除频谱增宽外，还表现出明显的搏动性波...

讨论

小鼠动静脉瘘（AVF）模型已被用于研究导致AVF成熟的生物学机制和分子事件^13,14。在本研究中，我们对已建立的小鼠AVF模型进行了改良，创建了一种新型的小鼠主动脉-下腔静脉瘘模型，并在瘘管的流出道处引入下腔静脉（IVC）狭窄。我们的结扎模型与先前报道的多种采用血管结扎技术的小鼠模型类似。已有研究通过使用30 G针头作为间隔物进行部分IVC结扎来建立小鼠深静脉血栓模型¹⁵；而我们采用较大的22 G静脉导管作为间隔物，以形成更轻度的狭窄，从而避免血栓性闭塞。另有研究采用部分颈动脉结扎的小鼠模型以诱导紊乱血流，进而引发动脉粥样硬化¹⁶；我们的模型同样采用了部分静脉结扎，因此在部分结扎部位的IVC区域也表现出紊乱血流。

已对动静脉瘘（AVF）成熟失败的机制进行了研究，其中瘘管静脉狭窄是重要原因。血流动力学改变，包括剪切应力频率的紊乱，被证明是重要因素

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20-60 兆赫扫描头	VisualSonics Inc.	RMV-704
8-0 无菌微缝合线，6毫米（140 µ），3/8 圆弧，TAP 尖针	AROSuture	T06A08N14-13	聚酰胺单丝缝合线
诱导室，2 升 3.75"宽 × 9.00"深 × 3.75"高	VetEquip	941444
Isoflo，异氟烷液体	Zoetis	26675-46-7
小鼠，C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
Pet Bed 微波加热垫	Snuggle Safe	6250
PrecisionGlide 25G 针头	BD	305122
Surflo 22G 静脉导管	Terumo	SR-OX2225CA	外径 0.85 毫米
血管夹	Roboz Surgical Instrument	RS-5424
Vevo770 高分辨率成像系统	VisualSonics Inc.	770