本实验方案的目的是在不牺牲胚胎的情况下，对原肠胚形成时期的海葵Nematostella vectensis进行基因分型。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
本文描述了一种基于PCR的基因分型方案，用于对刺胞动物门珊瑚纲的原肠胚阶段胚胎进行基因型分析 Nematostella vectensis 而不牺牲动物的生命。随后 体外 受精并去除胶状层后，将合子在室温下培养24小时，使其发育至早期至中期原肠胚阶段。随后将原肠胚置于含有海水的培养皿中的琼脂糖凝胶床上。在解剖显微镜下，使用钨针对外胚层组织进行手术分离，从每个胚胎切下一小块无口极组织片段。手术后的胚胎继续培养以促进愈合并持续发育。从分离的组织片段中提取基因组DNA，并作为位点特异性PCR的模板。根据PCR产物的大小或等位基因特异性PCR产物的有无来确定基因型。手术后的胚胎根据其基因型进行分选。整个基因分型过程所需时间取决于待筛选胚胎的数量，但至少需要4–5小时。该方法可用于从遗传异质性胚胎群体中鉴定基因敲除突变体，并支持在发育过程中对表型进行分析。
引言
刺胞动物是一类多样化的动物，包括水母、珊瑚和海葵。它们属于二胚层动物，由外胚层和内胚层组成，两者之间由细胞外基质（中胶层）分隔。刺胞动物门是物种繁多的两侧对称动物的姐妹群，后者包括 Drosophila 和 Mus 等传统动物模型1。此外，刺胞动物与两侧对称动物的分化被认为发生在寒武纪之前的时期2。因此，对刺胞动物和两侧对称动物进行比较研究，对于理解它们最近共同祖先的生物学特征至关重要。近年来，比较基因组学研究发现，刺胞动物和两侧对称动物共享许多发育工具包基因，如 notch 和 bHLH，这表明它们的共同祖先已拥有这些基因3。然而，这些发育工具包基因在刺胞动物与两侧对称动物的最后共同祖先中的具体功能仍知之甚少。为解决这一问题，关键在于研究这些高度保守的基因在刺胞动物中的功能机制。
一种新兴的刺胞动物遗传学模型是珊瑚纲动物 Nematostella vectensis 其基因组已测序3以及多种遗传学工具，包括吗啉代介导的基因敲低、巨核酸酶介导的转基因技术，以及CRISPR-Cas9介导的基因敲入和基因敲除，现已可用于该动物。此外 Nematostella 发育过程相对较为明确。在胚....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 诱导产卵， 体外 受精与脱胶
- 维持 Nematostella vectensis 在16 °C、盐度为12‰的海水中避光培养，并进行喂食 卤虫 每日
- 在诱导产卵前一天，将动物置于温度和光照可控的培养箱中。设置培养箱程序，使动物在25 °C下接受8小时光照。可选：喂食一小块（<1 mm3将牡蛎个体放入培养箱前，向每只牡蛎添加一定量的牡蛎精氨酸以促进产卵。
- 将动物置于16 °C培养箱中孵育1小时。
- 将动物从培养箱中取出，置于室温（RT）下有光照的实验台面上，以诱导产卵。通常在接下来的1.5–2小时内发生产卵。
- 若雌雄个体分开放置在不同容器中，使用剪切过尖端以扩大开口的转移移液管，将雌性容器中的卵团转移到含有精子的雄性容器中，以避免转移过程中机械应力对卵造成损伤。将卵留在雄性容器中至少15分钟，使其完成受精。
- 在培养皿或15 mL离心管中，用含有3%半胱氨酸（pH 7.4）的海水去除卵团中的胶状物。在摇床中轻轻振荡12分钟。
- 使用塑料移液管打散团块，并继续振荡 2-3 分钟，直至完全去除胶状物。
- 通过更换新鲜海水至少5次以去除半胱氨酸。
- 将受精卵置于玻璃培养皿中，在16 °C或室温下保存。
2. 从囊胚....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
的 Nematostella 基因组中存在一个编码神经肽GLWamide前体蛋白的单一基因座。该基因座上的三个敲除突变等位基因（glw- a，glw- b，以及 glw- c此前已有报道5四只携带野生型等位基因（+）和敲除等位基因的杂合雄性个体 glw- c 在 GLWamide 基因座（基因型： +/glw- c与携带野生型等位基因和不同敲除等位基因的杂合雌性小鼠杂交 glw- a 在同一基因座（基因型： +/glw- a）以产生后代。后代中可能有四种基因型： glw- a/glw- c, +/glw- c，glw- a/+,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文描述了一种基于 PCR 的基因分型方案，可在不牺牲动物的前提下对单个海葵胚胎进行基因型鉴定。在排卵和去胶质后，受精卵被允许发育至原肠胚阶段。通过手术切除每个原肠胚胚胎的反口端区域，将分离出的反口端组织用于后续基因组 DNA 提取，而术后剩余的胚胎则能够愈合并继续发育。提取的基因组 DNA 用于 PCR 检测，以确定每个胚胎的基因型。该方法利用了海葵胚胎口端部分具有调节和发育能力的特性10,11，在适当的培养条件下，大多数胚胎（>90%）通常能够存活并正常发育。本基因分型检测所需的组织量少于整个原肠胚的一半，且因基因组 DNA 提取失败导致的阴性结果极为罕见（<5%）。由于所需组织量很小，有可能将该方法应用于原肠胚前阶段的胚胎，尽管这一点尚未经过验证。只要动物尚未进入活跃游动阶段（即在自由游动的浮浪幼虫阶段之前），该方法均可高效实施。此基因分型方法在需要于发育过程中进行表型分析的情况下尤为有利。
本方案的一个局限性在于，可筛选的胚胎数量可能受限。特.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢匿名审稿人对本文早期版本提出的宝贵意见，这些意见帮助改进了稿件。本研究得到了阿肯色大学资金的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 果蝇帕尔帖制冷培养箱 | 谢尔拉布 | SRI6PF | 用于诱导产卵 |
| Instant Ocean 海盐 | Instant ocean | 138510 | |
| 卤虫卵囊 | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-半胱氨酸盐酸盐 | Sigma Aldrich | C7352 | |
| 标准轨道摇床，型号 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl，1 M，pH 8.0 | 优质生物 | 351-007-01 | |
| 氯化钾 | VWR | BDH9258 | |
| EDTA，0.5 M pH 8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 替代品 | US Biological | N3500 | |
| 蛋白酶K溶液（20 mg/mL），RNA级 | ThermoFisher | 25530049 | |
| 琼脂糖 | VWR | 710 | |
| 微型解剖针持针器 | Roboz | RS-6060 | |
| 钨制解剖针 | 罗博兹 | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler 梯度PCR仪 | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | 新英格兰生物实验室 | M0530L | |
| dNTP 混合液 | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide 通用正向引物 | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| 特异性反向引物 glw- a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| 特异性反向引物 glw- c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
参考文献
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
