本实验方案的目的是在不牺牲胚胎的情况下，对原肠胚形成时期的海葵Nematostella vectensis进行基因分型。
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本文内容
摘要
摘要
本文描述了一种基于PCR的基因分型方案，用于对刺胞动物门珊瑚纲的原肠胚阶段胚胎进行基因型分析 Nematostella vectensis 而不牺牲动物的生命。随后 体外 受精并去除胶状层后，将合子在室温下培养24小时，使其发育至早期至中期原肠胚阶段。随后将原肠胚置于含有海水的培养皿中的琼脂糖凝胶床上。在解剖显微镜下，使用钨针对外胚层组织进行手术分离，从每个胚胎切下一小块无口极组织片段。手术后的胚胎继续培养以促进愈合并持续发育。从分离的组织片段中提取基因组DNA，并作为位点特异性PCR的模板。根据PCR产物的大小或等位基因特异性PCR产物的有无来确定基因型。手术后的胚胎根据其基因型进行分选。整个基因分型过程所需时间取决于待筛选胚胎的数量，但至少需要4–5小时。该方法可用于从遗传异质性胚胎群体中鉴定基因敲除突变体，并支持在发育过程中对表型进行分析。
引言
刺胞动物是一类多样化的动物，包括水母、珊瑚和海葵。它们属于二胚层动物，由外胚层和内胚层组成，两者之间由细胞外基质（中胶层）分隔。刺胞动物门是物种繁多的两侧对称动物的姐妹群，后者包括 Drosophila 和 Mus 等传统动物模型1。此外，刺胞动物与两侧对称动物的分化被认为发生在寒武纪之前的时期2。因此，对刺胞动物和两侧对称动物进行比较研究，对于理解它们最近共同祖先的生物学特征至关重要。近年来，比较基因组学研究发现，刺胞动物和两侧对称动物共享许多发育工具包基因，如 notch 和 bHLH，这表明它们的共同祖先已拥有这些基因3。然而，这些发育工具包基因在刺胞动物与两侧对称动物的最后共同祖先中的具体功能仍知之甚少。为解决这一问题，关键在于研究这些高度保守的基因在刺胞动物中的功能机制。
一种新兴的刺胞动物遗传学模型是珊瑚纲动物 Nematostella vectensis 其基因组已测序3以及多种遗传学工具，包括吗啉代介导的基因敲低、巨核酸酶介导的转基因技术，以及CRISPR-Cas9介导的基因敲入和基因敲除，现已可用于该动物。此外 Nematostella 发育过程相对较为明确。在胚胎发生期间, 原肠作用通过内陷发生4，胚胎发育成可自由游动的浮浪幼虫。浮浪幼虫随后转变为具有口和口周触手的固着水螅体。水螅体继续生长并达到性成熟。
CRISPR-Cas9介导的靶向诱变现已被常规用于研究基因功能 Nematostella vectensis5,6,7,8,9. 为了在目标基因中产生敲除突变体 Nematostella首先将含有位点特异性单导向RNA和核酸酶Cas9蛋白的混合物注射到未受精或已受精的卵细胞中，以产生通常表现为嵌合体的F0代创始动物。随后将F0代动物饲养至性成熟，并相互交配以产生F1代群体，其中部分个体可能为基因敲除突变体6. 或者，可将性成熟的 F0 动物与野生型动物杂交以获得携带目标位点敲除等位基因的 F1 杂合子动物，随后将这些 F1 杂合子个体相互交配，产生的 F2 后代中预计有四分之一为敲除突变体5两种方法均需要一种从遗传异质性群体中鉴定敲除突变体的技术。可利用水螅体触手提取基因组DNA用于基因分型6,7然而，在研究目的基因的发育功能时，若突变胚胎无法发育至水螅体阶段（例如，由于突变导致的幼体致死），则需要在个体发育早期鉴定基因敲除突变体。本文所述为一种基于PCR的基因型鉴定方案，可在原肠胚阶段对单个个体进行非致死性基因型分析，从而能够在遗传背景异质的胚胎群体中识别出基因敲除突变体。整个基因分型过程所需时间取决于待筛查胚胎的数量，但至少需要4–5小时。
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方案
1. 诱导产卵， 体外 受精与脱胶
- 维持 Nematostella vectensis 在16 °C、盐度为12‰的海水中避光培养，并进行喂食 卤虫 每日
- 在诱导产卵前一天，将动物置于温度和光照可控的培养箱中。设置培养箱程序，使动物在25 °C下接受8小时光照。可选：喂食一小块（<1 mm3将牡蛎个体放入培养箱前，向每只牡蛎添加一定量的牡蛎精氨酸以促进产卵。
- 将动物置于16 °C培养箱中孵育1小时。
- 将动物从培养箱中取出，置于室温（RT）下有光照的实验台面上，以诱导产卵。通常在接下来的1.5–2小时内发生产卵。
- 若雌雄个体分开放置在不同容器中，使用剪切过尖端以扩大开口的转移移液管，将雌性容器中的卵团转移到含有精子的雄性容器中，以避免转移过程中机械应力对卵造成损伤。将卵留在雄性容器中至少15分钟，使其完成受精。
- 在培养皿或15 mL离心管中，用含有3%半胱氨酸（pH 7.4）的海水去除卵团中的胶状物。在摇床中轻轻振荡12分钟。
- 使用塑料移液管打散团块，并继续振荡 2-3 分钟，直至完全去除胶状物。
- 通过更换新鲜海水至少5次以去除半胱氨酸。
- 将受精卵置于玻璃培养皿中，在16 °C或室温下保存。
2. 从囊胚期胚胎中手术移除口后组织
- 配制DNA提取缓冲液，包含10 mM Tris-HCl（pH 8）、50 mM KCl、1 mM EDTA、0.3% Tween20、0.3% NP40和1 μg/μL蛋白酶K。每个胚胎使用20 μL提取缓冲液。充分涡旋混匀后，分装至PCR管中。
- 将1%琼脂糖溶于海水中，倒入培养皿中覆盖底部。室温冷却形成凝胶基质。向培养皿中加入新鲜海水，覆盖凝胶基质。
- 将受精后24小时（hpf）的胚胎（早期至中期原肠胚阶段）转移至含有琼脂糖凝胶垫的培养皿中。
- 将一根钨针插入针持中，通过将针尖浸入酒精（70% 或更高浓度）并置于火焰中燃烧以去除酒精，从而进行灭菌。
- 在解剖显微镜下（放大倍数为20倍至40倍），使用钨针通过移除一块与待操作胚胎大小相近的表面琼脂糖，在琼脂糖基质上制造一个凹陷；将胚胎置于该凹陷中，使其侧面向下，以限制胚胎在显微手术过程中的移动。
- 使用钨针手术切除位于口胚孔开口对侧的反口端组织。通常沿口-反口轴方向切除胚胎组织的反口端三分之一至四分之一即可。
- 使用 P20 移液器转移分离的反口面组织（置于 <2 μL）加入含有20 μL DNA提取缓冲液的PCR管中。
- 将术后胚胎转移至24孔板或96孔板中的一个孔内，孔中需含有至少500 μL的新鲜海水。
- 根据需要对所需数量的胚胎重复步骤 2.4–2.8。
- 将含有术后胚胎的孔板置于16 °C或室温下的培养箱中，直至完成基因分型。
3. 基因组DNA提取与基因分型PCR
- 使用小型离心机（例如在 2,680 × g 条件下离心 10 秒）短暂离心含有 DNA 提取缓冲液和分离的胚胎组织的 PCR 管。
- 为了从单个胚胎中提取基因组 DNA，将 PCR 管在 55 °C 下孵育 3 小时。每 30 分钟涡旋振荡 30 秒，以确保细胞团块充分分散并增强细胞裂解。
- 将 PCR 管在 95 °C 下孵育 5 分钟，以灭活蛋白酶 K。
- 将基因组 DNA 提取物保存在 4 °C 或冰上，并立即进行 PCR 扩增。
注意：可通过将基因组 DNA 提取物置于 -20 °C 冰箱中，暂停本实验流程。 - 以提取的基因组 DNA 为模板，设置 PCR 反应，扩增目标基因组位点。
- 如果目标位点的不同等位基因之间存在大小差异，且该差异可通过琼脂糖凝胶电泳检测，则设计一对引物以扩增整个位点。
- 或者，使用等位基因特异性引物，仅在特定等位基因存在时产生 PCR 产物；例如，通过设计结合于插入/缺失突变区域的引物实现。
- 使用典型的 20 μL PCR 反应体系，如下：5 μL 基因组 DNA 提取物、8 μL 无核酸酶水、4 μL PCR 缓冲液、0.2 μL 10 mM dNTPs、0.6 μL DMSO、1 μL 10 μM 正向引物、1 μL 10 μM 反向引物，以及 0.2 μL DNA 聚合酶（参见材料表）。
注意：可在同一 PCR 反应中使用多个引物。例如，可将一个通用正向引物与两个等位基因特异性反向引物组合使用，前提是这两个反向引物设计为产生不同大小的 PCR 产物，从而可通过凝胶电泳明确判断两种等位基因的存在与否（见代表性结果部分）。
- 进行琼脂糖凝胶电泳，以确定 PCR 产物的大小及其存在与否。根据预期的 PCR 产物大小调整琼脂糖凝胶电泳条件（如琼脂糖凝胶浓度、电压/cm 和电泳时间）。
- 根据 PCR 结果中 PCR 产物的大小及存在与否，为每只术后胚胎确定其基因型。例如，若预期不同等位基因产生不同大小的 PCR 产物，则利用大小信息为每只胚胎分配基因型。若使用了等位基因特异性引物，则应根据 PCR 产物的存在与否来确定每只胚胎的基因型。
- 根据基因型对胚胎进行分选。
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结果
的 Nematostella 基因组中存在一个编码神经肽GLWamide前体蛋白的单一基因座。该基因座上的三个敲除突变等位基因（glw- a，glw- b，以及 glw- c此前已有报道5四只携带野生型等位基因（+）和敲除等位基因的杂合雄性个体 glw- c 在 GLWamide 基因座（基因型： +/glw- c与携带野生型等位基因和不同敲除等位基因的杂合雌性小鼠杂交 glw- a 在同一基因座（基因型： +/glw- a）以产生后代。后代中可能有四种基因型： glw- a/glw- c, +/glw- c，glw- a/+,
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讨论
本文描述了一种基于 PCR 的基因分型方案，可在不牺牲动物的前提下对单个海葵胚胎进行基因型鉴定。在排卵和去胶质后，受精卵被允许发育至原肠胚阶段。通过手术切除每个原肠胚胚胎的反口端区域，将分离出的反口端组织用于后续基因组 DNA 提取，而术后剩余的胚胎则能够愈合并继续发育。提取的基因组 DNA 用于 PCR 检测，以确定每个胚胎的基因型。该方法利用了海葵胚胎口端部分具有调节和发育能力的特性10,11，在适当的培养条件下，大多数胚胎（>90%）通常能够存活并正常发育。本基因分型检测所需的组织量少于整个原肠胚的一半，且因基因组 DNA 提取失败导致的阴性结果极为罕见（<5%）。由于所需组织量很小，有可能将该方法应用于原肠胚前阶段的胚胎，尽管这一点尚未经过验证。只要动物尚未进入活跃游动阶段（即在自由游动的浮浪幼虫阶段之前），该方法均可高效实施。此基因分型方法在需要于发育过程中进行表型分析的情况下尤为有利。
本方案的一个局限性在于，可筛选的胚胎数量可能受限。特...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢匿名审稿人对本文早期版本提出的宝贵意见，这些意见帮助改进了稿件。本研究得到了阿肯色大学资金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 果蝇帕尔帖制冷培养箱 | 谢尔拉布 | SRI6PF | 用于诱导产卵 |
| Instant Ocean 海盐 | Instant ocean | 138510 | |
| 卤虫卵囊 | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-半胱氨酸盐酸盐 | Sigma Aldrich | C7352 | |
| 标准轨道摇床，型号 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl，1 M，pH 8.0 | 优质生物 | 351-007-01 | |
| 氯化钾 | VWR | BDH9258 | |
| EDTA，0.5 M pH 8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 替代品 | US Biological | N3500 | |
| 蛋白酶K溶液（20 mg/mL），RNA级 | ThermoFisher | 25530049 | |
| 琼脂糖 | VWR | 710 | |
| 微型解剖针持针器 | Roboz | RS-6060 | |
| 钨制解剖针 | 罗博兹 | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler 梯度PCR仪 | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | 新英格兰生物实验室 | M0530L | |
| dNTP 混合液 | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide 通用正向引物 | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| 特异性反向引物 glw- a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| 特异性反向引物 glw- c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
参考文献
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